抗体コントロール 蛍光色素標識
2
次抗体 水性マウント剤顕微鏡用スライドガラス
76×25 mm
CAT.NO. S8902
蛍光検出用の適切なフィルター付きの蛍光顕微鏡倒立光学顕微鏡
検 出 細胞の調製
培養装置から細胞を取り出す。倒立光学顕微鏡下で観察し、望ましい形状であることを確認する。培地を捨て、
PBS
でリンスし、過量の液を除く。固定
4
種類の固定法を記載します。用途に応じて（又は製品データシートの推奨内容に応じて）適切な固定法を選 択してください。メタノール
-
アセトン固定パラホルムアルデヒド
-
トリトン固定パラホルムアルデヒド
-
メタノール固定PEM-
エタノール固定1
．冷却メタノール中で-20
℃で10
分間処理し、固定する。2
．過量のメタノールを除く。3
．冷却アセトン中で-20
℃で1
分間透過処理する。1
．3
〜4
％パラホルムアルデヒド中で10
〜20
分間固定する。2
．PBS
で簡単にリンスする。3
．0.5
％トリトンX-100
で2
〜10
分間透過処理する。1
．3
〜4
％パラホルムアルデヒド中で10
〜20
分間固定する。2
．PBS
で簡単にリンスする。3
．冷却メタノール中で-20
℃で5
〜10
分間透過処理する。1
．PEM
バッファー中で10
分間固定する。2
．PBS
で2
回簡単にリンスする。3
．冷却エタノール中で-20
℃で5
〜10
分間透過処理する。4
．PBS
で3
回洗浄する（1
回あたり5
分以上）。1
次抗体反応2
次抗体反応評価
適切なネガティブコントロールを処理することを勧めます。ネガティブコントロールによりバックグラウンドの蛍 光と、
1
次及び2
次抗体の非特異的染色が確認されます。理想的なネガティブコントロールの試薬は、蛍光色 素標識マウスモノクローナル抗体又は骨髄腫タンパク質です。研究対象の動物種の細胞に特異的ではなくとも、アイソタイプが一致したもので、試験抗体と同じ濃度にするべきです。自己蛍光性又はネガティブコントロール 試薬の蛍光の程度は、研究対象の細胞種及び使用機器の感度によって異なります。
Fc
受容体を有する細胞の 蛍光解析の場合、アイソタイプが一致したネガティブコントロールを必ず使用してください。マウント剤でカバーガラスをマウントし、スライドガラス上に反転させる。
顕微鏡下で観察し撮像する。
関連製品
CAT.NO.
価格リン酸緩衝生理食塩水
P3813-1PAK 1,500
リン酸緩衝生理食塩水（タブレット）
P4417-50TAB 12,000
メタノール、SAJ
特級19-2400-5-500ML-J 1,600
アセトン、histological grade, 534064-500ML 5,100
パラホルムアルデヒド
P6148-500G 3,500
Triton™ X-100 T9284-100ML 10,400
メタノール、
SAJ
特級19-2400-5-500ML-J 1,600
スライド（顕微鏡用）
S8902-1PAK 4,000
1
．1
次抗体をPBS
で希釈し、適切な希釈倍率とする。細胞上のカバーガラスにアプライし、室温で
60
分間インキュベートする。注意：加湿チャンバーの利用を勧めます。
2
．PBS
で3
回洗浄する（5
分以上）。注意：
2
次抗体は間接法でのみ用いられます。1
．標識2
次抗体をPBS
で希釈し、適切な希釈倍率と する。カバーガラスにアプライし、室温で30
分 間インキュベートする。2
．PBS
で3
回洗浄する（1
回あたり5
分以上）。3
．過量のPBS
を除く。検 出
ELISA
法酵素結合免疫測定法（
ELISA
）とは、化合物を特異的に定量する測定法です。その特異性、融通性及び再現性（低 コストでもあります）により、診断ツールとして広く使用されるようになりました。タンパク質研究の場合、細胞 タンパク質レベル（発現プロファイルなど）の便利なスクリーニング法となっています。試薬及び機器
リン酸緩衝生理食塩水（
PBS
）タブレット10mM
リン酸バッファーpH7.4
、150mM NaCl
及び0.1
％アジ化ナトリウム（タブレット
CAT.NO. P4417
） 炭酸-
重炭酸バッファーカプセル、pH 9.6
（CAT.NO. C3041
）洗浄用バッファー（
PBST
）10mM
リン酸バッファーpH 7.4
、150mM NaCl
、0.05
％TWEEN®20
（CAT.NO.
P3563
）抗体コントロール 動物種及びアイソタイプが一致した、非特異的免疫グロブリン（マウスモノクローナル
1
次抗体のコントロールとしてマウス骨髄腫タンパク質など）2
次抗体 アルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP
）のいずれかの 標識検出用基質 アルカリホスファターゼ：
SIGMAFAST™ pNPP
タブレット（CAT.NO. N1891
）HRP
：SIGMAFAST OPD
タブレット（CAT.NO. P9187
）反応停止剤（オプション） アルカリホスファターゼ：
3M NaOH HRP
：3M HCl
又は3M H
2SO
4マルチウェルプレート
抗原のコーティング
1
．炭酸-
重炭酸バッファー又はPBS
で、適切な濃度の抗原溶液を調製する。2
．上述の溶液0.2mL
をマルチウェルプレートの各ウェルにピペットで移す。3
．37
℃で30
分間インキュベートするか、又は4
℃で一晩インキュベートする。4
．コーティング液を除く。PBST
で3
回洗浄する。注意：非特異的結合による問題が生じた場合は、追加のブロッキング段階（
5
％BSA-PBS
で30
分間処理）が必要になる場合があります。更なる情報は 文献をご参照くださいVogt, R.F., et al.,
（1987
）J. Immunol.Meth., 101, 43.
1
次抗体反応1
．モノクローナル1
次抗体をPBST
で希釈する。滴定により至適希釈倍率を 決定しておく。2
．希釈したモノクローナル抗体を、各ウェルあたり0.2mL
添加する。ネガティ ブコントロールは動物種とアイソタイプが一致した非特異免疫グロブリンと し、これをPBST
で希釈する。3
．室温で2
時間インキュベートする。4
．ステップ4
「抗原のコーティング」と同様に洗浄する。2
次抗体の利用1
．酵素標識2
次抗体をPBST
で希釈する。この溶液を、各ウェルあたり0.2mL
添加する。滴定により至適希釈倍率を決定しておく。2
．室温で2
時間インキュベートする。3
．ステップ4
「抗原のコーティング」と同様に洗浄する。注意：最終インキュベーション中の使用直前に酵素基質を調製するか、又はあ らかじめ作成した液体基質を室温に戻します。
発色
用時調製した基質を、各ウェルあたり
0.2mL
添加する。陽性のウェルでは
30
分後に発色を認めるはずである（pNPP
の場合は黄色、OPD
の場合はオレンジ）。注意：吸光度はマルチウェルプレートリーダーで直接読み取るか（
pNPP
では405nm
、OPD
では450nm
で）、又は適切な停止試薬を1
ウェルあた り50
µL
添加して反応を停止してから吸光度を読み取ることができます。関連製品
CAT.NO.
価格リン酸緩衝生理食塩水
P4417-50TAB 12,000
リン酸緩衝生理食塩水（
BSA
含有）P3563-10PAK 8,600
アジ化ナトリウム
S2002-5G 1,600
炭酸
-
重炭酸バッファーC3041-50CAP 17,400
SIGMAFAST ™ p-NPP
タブレットN1891-5SET 5,000
SIGMAFAST OPD P9187-5SET 5,000
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製品名 説明 適用 CAT.NO. 価格(¥)