佐大農終 48: 73-77 (1980)
ラ ッ ト 肝 臓 ミ ク ロ ソ ー ム の チ ト ク ロ ー ム
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量および
過酸化脂質生成量ならびに尿中アスコノレピン酸最に
及ぼす
DEHP
の影響
柳 田 晃 良 ・ 葛 原 祥 二 ・ 富 永 明 宏
柳 田 栄 子 九 榎 本 則 行
(食機管理化学研究室) 昭和54年10月30B 受理E
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DEHP.
緒 言 可塑性として広範に使用されているフタル酸ヱステノレをラットやマウスに経口投与すると，肝!
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j疫系の脂質代謝の変動が認められる1-4) とくに，肝臓リン脂質(
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の顕著な増加と質 的変動が特徴的である. フタル援金エステルは， 環境および主主体汚染物質として知られる親泊伎の主主体異物， いわゆるX
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の一つである.一般に， ':.主体にとりこまれたX
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は{仔臓ミク口ソーム(Ms)
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を中心とする薬物代謝酵素ζ
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より代謝される. ζの薬物代謝野手 素は，元来ステロイドや脂肪酸などの生体物質の代謝l
乙働いているが，基質特異性が低いため， *依賀短期大学~48 号 (1980) Xenobioticsも代謝することができ，また多くの Xenobiotics~とより誘導される ζ とが知られて いる.本実験では，フタノレ毅ヱステノレの1つである Di-2-ethylh巴xylphthalate (DEHP)が，
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j描Msのチトクローム P-450iitと過駿化脂質生成f立とに及ぼす彩鳴を調べた.また， Xenobio-tics摂取との関述で注目されている尿中アスコノレピ、ン駿 (V-C)の変動についても誠べた. 実 験 方 法1
.
実験動物と餌料 Wistar系雄ラット(初体重約 90g)を2群 (1君
4
:
6頭〕に分け， 22-240 Cの餌育室中で， 1 頭ずつ代謝カゴで飼育した.対照群l乙は， 2096カゼイン食を基本食とした飼料を1手え，処理郡qと は，基本食に0.596DEHPを添加した飼料を与えた.飼料組成は前線lと従った1.2) 7日間自由摂 食させたのち，肝臓を摘出して分析1
乙供した.2
.
尿中総アスコルピン酸 (V-C)の測定 飼育開始後， 5日目から6日自にかけて， 1096メタワン費量 5mlを入れた三角フラスコに尿を 採取し，尿中総V-Cf設を 2，4-dinitrophenylhydrazine法5)で測定した. 3. 肝 蹴Msのチトクローム P-450盤およびThiobarbituricacid (TBA)値の測定 肝臓約3gを31庁長の 0.25Mシコークロースでホモジナイズし， 12，000 rpm， 15分間遠心分 離した.その上清5mlをさらに， 24，000 rpm， 60分間遠心分離し，得られた Msペレットを0.15 MKClを含むTris-HCl緩衝液 (pH7.4)~[l怒濁させて凍結貯蔵し，チトクローム P-450 の定 およびTBA徳の測定7)に供した.4
.
肝臓臨閣の分析 Folchらの方法的に従って抽出，純化したのち， PLおよびその組戒を既報1.9)K従って分析しT
こ. 結 果 と 考 察 体議，肝臓璽盤および肝臓PLの変動 DEHP投与により，体重増加;誌とJ
菜食堂との低下および肝臓重最の増加が認められた (Table 1) .肝臓肥大は，既報1-4)の結来と一致した. Table 1 E汀ectsof DEHP on weight gain，
food intake and liver weight') weight gain Food intak巴 Liver weight GroupSb) (gf7 days) (gfday) (gflOO g body wt.) Control 51.7+
1.2 13.6土0.3 5.94とご0.12 DEHP 39.4とこ3.0* 11.3とこ0.5* 7.05土0.33* a) Values arc the mcans土SEof six rats. b) Rats wcre fed a 20% casein diet with or without (control) addition ofDEHP at the 0.5% levelad libitumfor 7 days. * Difference from the control is significant at pく0.01.肝臓PLf設の変動ならびに phosphatidylcholine(PC)および phosphatidylethanolamine (PE)
柳田晃良・葛原・2吉永・柳凶・援本:ラット肝臓ミクロソームのチトクロームP-450笠および 過酸化脂質生成主iならびに成中アスコノレピン駿f誌に及ぼすDEHPの影響 75 Table 2 Effects of DEHP on the concentration and composition of hepatic phos -pholipidsa) Groupsu) Phospholipids PC PE (mgfg liver) (μphglogsplhivoerru) s % (phosplihvoerru) s % μgfg Control 25.3土0.52 619土 7.6 56.0 228土6.9 21.0 DEHP 34.0+1.15* 662土10.5* 48.3 420土5.9* 30.6 a) Values are the means土SEof six raぉ. b) See Table1. 傘 Differencefrom the control is significant at pく0.01. PL成分中の PCおよび PEの増加に起園しており，とくに PEの増加が顕著であった.しかし， PL構成成分の百分率を求めると， PEの割合は著しく増加しているが， PCの割合は低下してい た.肝臓PLの増加は，ミトコンドリア (Mt)および Msli!ii分での増加に組悶するが，とくに Mt 蘭分での増加割合が悲しL
、
2) DEHPを投与したラット肝臓では， condensed configur丘tionした Mtおよび細胞封人体 (myeline.・likefigure)の出現が観察されへ他方， peroxisome (microbody) やs
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酸化系の酵素の誘導も見いだされている10)ので， PLのI強力Ilにはこれらが一部関与してい るものと推察される。 肝 臓Msのチトクローム P-450盤，過酸化指誕生成盤および尿中総 v-C鰻 DEHPを投与したラット肝臓 Ms中のチトクローム P-450，過酸化脂質生成議および隊中総 v-C 排池;泣を Table3
!乙示した.DEHP投与により，チトクローム P-450:泣は約1.5倍の増加が見ら れ， TBA値は約2096の減少を示したが，いずれも有意の惹ではなかった.成中総 v-C:
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はほと んど変動しなかった. Xenobiotics によって肝臓 Msのチトクローム P-450盈が増加したり，他の薬物代議t
醇索活 性が上昇することは良く知られている11) ~t} 1Iは12) 極々の化学物質の投与による肝臓チトクロ ーム P-450最の増加は，食品の安全性評価の指標になしうる可能性を示唆しているが， DEHP K関しではなお検討を要するといえよう. 生体内における指質過酸化反応には， NADPHを介して薬物代謝酵素系と共役する酵素反応 (Msでみられる〉と，アスコノレピン酸と ADP-Feにより促進される非酵素的反応 (Ms と Mt でみられる〉とが知られている. 前 線2)で示したように， DEHP投与・ラットの肝臓では脂質過 酸化反応の基質である高度不鈎和総肪駿， とくにアラキドン酸 (20: 4) が顕著にi増加する. し かし， TBA反応陽性物質は， DEHP投与により減少の傾向を示し， 1if(t
者H O設加する PL:母と TBA値とは，相関しなかった.これは， E色体系で測定される過酸化脂質生成;泣は，生成系とscav -anger系(ビタミン E，グノレタチオンベノレオキシダーゼ， スーパーオキサイドディスムターゼ， カタラーゼなど〉との総決算として現われることによるものと考えられるので， DEHP投与ラッ トにおける scavanger系の動向を知ることが，今後の研究課題の一つで・あろう. X叩 obiotics摂取による薬物代謝系醇索の誘導に伴ない， ピ、タミン類の要求i
立にも変化が生じ る可能性が示唆されている.印南ら13)は， PCB含有飼料をラット lζ与・えると，ビタミン A欠乏症 が誘導されるが，ビタミンA
を¥-分i
乙与えておくと，欠乏症状は現われないことそ認めている. 一方， Xenobiotics摂取によって， V-Cの要求最が増す可能性も指摘されている14) モノレモット をv-C欠乏飼料で飼育すると，肝臓 Msのチトクローム P-450盆や他の薬物代謝酸素活性が低 下することから， V-Cは NADPHからの電子伝迷系に何らかの役割を来しているものと推察さ れている15) PCB， DDT， BHTなどを与えると，ラット尿中 V…C の誹地盤は;増大する16) その76 佐賀大学j箆学芸露戦 第48号 (1980) 増加は，体内での
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合成の高進によると考えられている.吉自ら 16)は， Xenobiotics投与に よる肝臓薬物代謝際索活性の変動と隊中v
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排波最とが相関することから，成r
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排液量は，対日夜ラットと比較して著しい差異はな かった (Table3).ζ の ζとは，上記のスクワーニング法が，すべての化学物質について適用で きるものではないことを示唆している.Table 3 Effects of DEHP on thc content of cytochrome P-450， TBA value in live1 microsomes and the amount of ur・inaryascorbic acid札) GroupSb) Control DEHP Cytochrome P-450 (LlOD. (450-480nm)f mg Ms protein) 0.0585土0.0077 0.0883土0.0242 TBA value (nM MDN) fmg Ms protein) 1.46土0.09 1.23土0.16 a) Valucs are the means土SEof伝vcrats. b) Sce Table 1. c) MDA: Malondialdchydc Urinary ascorbic acid (mgfday) 0.150土0.007 0.154土0.005
DEHPは，肝臓 Mtの swellingrate2)や lysosome系の酵素活性17>に影響を及ぼす. また， 血竣コレステローノレの代謝と筏接 lζ関i準ずる lecithin-cholesterolacyltransferaseへの阻害作用 が殻近報告された18) フタノレ援金エステノレの生体 lζ及ぼす影響については，今後も詳細に検討され る必要があろう. 要 約 可製剤として知られる DEHPが， ラット肝臓ミクロソームにおけるチトクローム P-450 過酸化脂質生成長および成中総アスコルビン駿排法
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誌に及ぼす影響を調べた. Wistar系雄ラットに， 2096カ ゼ イ ン 食 l乙 DEHP 0.596を含む飼料を7
日間自由摂食させた. DEHP 摂取により，肝臓窓量の増加およびワン脂質の増加が認められ， リン脂質の増加は PE と PCの増加に起顕していた.百分率でみると， PEの割合の増加と PCの割合の低下が観察さ れた. DEHP投与・により，肝臓 Msのチトクローム P…450は対照ラットの約1.5倍 l乙増加したが， 有窓差はなかった.一方， TBA鏑はいくらか低下の傾向を示した.尿中アスコノレピン綾排池援 は， DEHP投与により著しい変動を示さなかった. 文 献1) Yanagita， T.， Kobayashi， K.and Enomoto， N. (1978) Biochem. Pharmac.， 27， 2283.
2) Yanagita， T.， Kuzuhara， S.， Enomoto， N.， Shimada， T. and Sugano， M. (1979) Biochem. Pharmac.， 28，3115.
3) 柳町晃良， 11&ll京株二，後本則行 (1979) 医学のあゆみ， 108，224. ，1) 柳田Jもよミ，桜木別行， ~1τ)11 法殺 (1979) 佐賀大学政学終報， 46，17. 5) 火幡キIJ-，八木国夫 (1958) 光22比色法各論 2，pp. 228， f句江没. 6) Omura， T. and Sato， R.(1964) よBiol.Chem.， 239， 2370.
柳田晃良・葛原・2富永・柳田・援本:ラット肝臓ミクロソームのチトクロームP-450蕊 お よ び 過酸化脂質生成:叡ならびに
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アスコルビン激怒f[及ぼすDEHPの彩悪事 77 8) Folch， J" Lee， M. and SIoan巴司Stanley，G.H.(1957) よBiol.Chem.， 226， 497.9) Yanagita， T.， Enomoto， N. and Sugano， M. (1979) よNutr.，投稿中. 10) 大関 経，総本 経(1979) 脂質主主化学研究， 21，128.
11) 佐 藤 了 (1975) 薬物代謝，講談社サイエンティフィク. 12) 北川泰雄 (1978) 化学と生物， 16，232.
13) Innami， S.， Nakamura， A.，Miyazaki， M.， Nagayama， S. and Nishida， E. (1976) J. Nutr. Sci. Vitami -no，.l22， 409.
14) 吉岡 i沼(1978) 生化学， 50，347.
15) Zannoni， V. G. and Sato， P.狂.(1976) Federation Proc.， 35， 2464. 16) Kato， N. and Yoshida， A. (1979) Agric. Biol. Chem.， 43， 191.
17) 柳田晃良， .認原祥ニ，援本則行 (1979) 昭和54年度臼本
