博士（水産学）井上 晶 学位論文題名
cDNA クローニングおよび変異体作製によるホタテガイ類 トロポニン T とトロポミオシンの構造・機能の解析
学位論文内容の要旨
魚介 類の 筋肉 の加 工・ 利用 方法 の理 論 づけ や新 用途 の開 発のためには、筋肉夕ンバク質の 構造 と機能に関する多くの研究晴報が必要である 。軟体動物ホタテガイ類の筋肉はミオシン やア クチンが哺乳類のそれらと比較して、種々要 因に対して不安定であるだけでなく、エネ ルギ ーをほとんど消費せずに闘埓間収縮状態を維 持できるキャッチ機構を有したり、筋収縮 調節 機構 とし て哺 乳動 物と 同様 のト 口 ポニ ン(Ih)ー ト口 ポミ オシ ンmめ 系に 加え 、ミオシ ン軽 鎖系 をも 有す るな ど非 常に 特異 的 であ る。 この よう なホ タテ ガイ 類O'Ih‑Tmもまた特 異 な 性 状 を も っ て い る 。 例 え ば 、rrhの3種 の サ ブュ ニッ ト のう ち、aを 結合 するn11は4 個の（貧＾結合部位のうち第4音5位にただ1個くオ゛を結合し、ミオシン←アクチン相互作用を阻 害する′IMは分子量52，000と19騏めの2種（ウサギでは21，000）発見されている。さらにm1くンお よぴhIのアミノ酸配列も解析されている。
一フ亨、Wnま分子量が40願め（ウサギでは31，000）で、ウサギn1Tとは異なり生理的塩濃度 でも 可溶 性で ある 。さ らに 、も う一方の調節夕ンパク質である′nnはウサギnnと同様に2本 の分 子量34頒 めの サプ ュニ ット から 成 るが 、重 合能 が高 く、 アク トミ オシ ンMすAI珊Se活 性を 強く阻害することが分かっているにすぎない 。その上、それらのタンパク質のアミノ酸 配列は未解明であり、性質・機能についても不明の点が多い。
そ こで 、本 研究 では アカ ザラ ガイ と ホタ テガ イのn1TおよびTぬの：）NAクローニングと 塩基 配列解析によルアミノ酸配列を演繹するとと もに、大腸菌によるそれらの変異体の発現 と変異体を用いた性質・機能の検討を行った。
ま ず、 アカ ザラ ガイ 横紋 筋の 入gt11．江 幟ラ イブ ラリ ーを 抗ア カザ ラガ イm矼 抗血清で スクリーニングし、約15，伏X）個の組み換えファージから16個の陽性クローンばP1〜16クロ ーン ）を 得た 。そ れら のd）NAを、Bh8Q成矼KS（ ＋）プラスミドに組み込み、両端から各々
約400 bpの配 列を 解析 した 結果 、2種 のク 口ーン、すなわちAT‑3およびAT‑16クローンが翻 訳領 域全 体を 含むことが判 明した。そこで、パr‑3ク口 ーンのcDNAをexo‑deletion法により 末端 から 種々 の長 さの 部分 を除 去し た 組み換えプラス ミドを調製し、全塩基配列を決定し た。そのcDNAは全長1，467 bpであり、その7011，Oll番目の翻訳領域の塩基配列を決定し、
以下の314アミノ酸 配列じ河‐量37，206)が演繹された。
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一方、」¥T‑16ク口ーンのcDNAは1，823 bpから構成され、51ー1，016番目の翻訳領域から322 ア ミ ノ 酸 の 配 列 扮 子 量38，091)カ 灘 さ れ た。 この 配列 は、AT‑3から 演繹 され たア ミノ 酸 配列の8‑9番目 および3051306番目にそれぞ れGlu‑Glu―．1h℃bく泣】Jrhrおよて頗bイぬを挿 入し 、287A弧 を鰤1eに 置換したものであった。得られ た16ク口ーンのうち、AIL3と共通的配 列を もつ もの が12ク口 ーン、A：卜16と共通的なものが4ク口ーンであった。このようにアカ ザ ラ ガ イTHに は 、2種 の ア イ ソ フ ォ ー ム が存 在す ると 考え られ 、ATー3お よなAP16がそ れ ぞれコードするn1Tぞn1T一aおよびRlTもと 称することとした。
次 に、 ホタ テガ イ横 紋筋 ガn1Tのア ミノ 酸配 列を 解析 す るた めに 入酋n， 江外ぬライブラ リー を抗 体で スク リー ニン グ する こと によ り、1個 の陽 性 ク口 ーン に卜1ク 口ーン）を、ま た、上記のAt・3ク口ーンをプ口ープとして1個の陽陸ク口ーン缶I、―2クローン）を得た。それ らの 部分 塩基 配列 を解 析し た 結果 、ET℃ク 口ー ンが 翻訳 領域 全体 を有 する ことが判明した ので全塩基配列（1，939りを解析した。そ の結果、111―1，085番目の 塩基配列がホタテガイ n1Tの翻訳領域 部分であることが分かり、325アミノ酸残基の子量38，438）7う瀞覇澤された。
以 上の 配列 から 、ア カザラガイとホタテガイのn1T間の相同性は92も4％と判明レ、ウサギ nlTと の 相 同 性 ＠4悶 よ り も 非 常 に 高 か っ た 。 ホ タ テ ガ イ 類THの 特 異 的 な 点 は 、 ウ サ ギ n1Tよ りもN端 が27残基 短く 、C端 が80185残 基長 いこ とで あっ た。 一方 、親 水性度プロット を比 較し た結 果、80く 癌番 目 のア ミノ 酸配 列付 近は ウサ ギ冊 こ比 べて 親水 性度が高いが、
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そ れ 以 外 の 領 域 は 良 く 似 て い た 。 さ ら に 、 予 測 二次 構 造 も ウサ ギIhと 類 似 して い た ー 次 に 、 ア カ ザ ラ ガ イA卜3ク口 ー ン のcDNAを 用 い て 、大 腸 菌BL21のE3） によ りm1T勹 の 完全 長 、 すな わ ち1−314番目の アミノ酸 配列を もつタン バク質mllも1めの発 現と精 製を行 うこと ができた 。このTH1・314を用い て再構 成しだTnは 、天然 のn1Tを 用いて 再構成し たm1 とほぼ同等に、アクトミオシンMすバIRlse活性に対してCオ゛―闘珂；吐晒けを付与した。また、
cDNAにKRbsedmutagen矧sに よ り 変 異 を 導 入 す る こ と に よ り 、4種 のnn変 異 体mて1― 2m、THヨ3―236、n1Tlー120、およびn1T、浄120）を発現し、精製にも成功した。これらを用いた 再構成T．nは、それぞれ6611％、68．0％、911％、および13．0％のくオ‐lSensitM炒を与えた。この ことか らn1TのC端121ー314番目の 領域の存在がCオ゛調節に重要であることが分かった。さら に、これらの変異体を用じゝた固定イ匕r、mアフイニティーク口マトグラフイーによルアカザラ ガ イmlpaの33−120番 目 の 領 域 にrr碎 占 合 部 位 が 含 ま れ る こ と を 明 ら か に し た 。 次に、2本の サブュニ ットか ら成るア カザラガイ′rmのサブュニットについてアミノ酸配列 を解 析 し た。 ま ず 、cDNAをク口 ーニング するた めに、約8，O個の 組み換え ファー ジの抗体 スクル ーニング を行った 。その 結果、4個の 陽陸ク口 ーン鹸m、p1〜4ク口 ーン） を得たが 、 それら のうちパIN卜4ク □ーン のcDNAくl，995bp）カ澗訳領域全体を含んでいることが分かっ た。次 いで、27一878番 目の翻訳 領域全体 の塩基 配列を解 析し、 以下に示す284アミノ酸残基 の配列￠｝子量32，540）を演繹した。
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さらに、ホタテガイの´Fmのサブュニットについても約5，頒馴固の組み換えファージを抗体 スク リ ーニ ングし、1個 の陽性ク ローンCE汀‑iク口ー ン）を 得た。挿 スcDNAは986bpから成 り、10r‑958番 目の塩 基配列部 分が翻 訳領域で あり、そ の配列 から284アミノ 酸残基汾 子量 32，596)が演繹された。その配列は、アカザラガイ'IYnの配列中のアミノ酸残基を次のように 変えたものであった。'Ihr→へ′m、75Asp→7sGlu、1°7Ala●10 Le、1りぬ→1 Ser、‖。QL1→
149A叩、1mr→亅50Ser、1やASn→・￣1h、1∞G1n．→】1む、 Serメ rhr、ワmI→23ASn、1a】→
。Na、 Irh1ッ7Vd、ぞA1a→2 GO
ホ タ テガ イ 類Tmと ウ サギnnのアミノ 酸配列 を比較し た結果、 配列相 同性はア カザラ ガイ とホタテ ガイのIぬ間 では96％ であり、 ウサギnnとの間（4争47％）より著しく高かった。ま た、親水 性度プ 口ッ卜を 検討し た結果、 ウサギrInと比 べて18チ200番目付近は疎水性度が高 く、250番目付 近は親水 性度が 高かった が、その 他は全 般的に良 く似て いた。二 次構造 予測 では 、 ウ サギTmは全 体 の 約96％ がa― ヘ リ ック ス 構 造を形成 してい るという 結果に なった が、ホタテガイ類nnでは約83％であった。
次に、ア カザラ ガイ′Imを 大腸菌 で発現さ せるこ とを試み 、全長ガIbが発現されることが 分かった 。しか し、N末端はア セチル 基による ブ口ッ クはされ ていな かった。 また、ブ 口ッ ク の 代 用 と し てN末 端 に1アミ ノ 酸 残基 鰰 あ また は2アミ ノ 酸 残基Q＄ 一Aめ を 付 加し だnn を発 現 さ せた 。 こ れら の 発現rmは 、極めて 低い相 対粘度を 示した ことから 重合能を 失って いる と 考 えら れ た 。さ ら に、ア クチンと の親和 性も天然 ガnnと比 べて低か ったこと から、
発現Tmは他 種グT、mで報告さ れてい るものと同様にN末端の数残基部分の機能が天然（7ブTh1 と著しく異なっていると推察された。
最 後 に、 ウ サ ギn汀 どTmに お け る構 造 と 機能 の 知 見に基づ き、ホ タテガイ 類］と ′rmの 一次構造 から、 それらの 相互作 用部位を 検討した 。その 結果、ウサギn1Tの71―158番目の配 列に相当 する領 域は、ウ サギrrlTと 同様に酸 性およ び塩基阯 アミノ酸残基から成るクラスタ ーを形成 してい ることが 示唆さ れた。ま た、この 領域ばn1T変異 体を用 いた実験 結果か らも nnと の 結合 に 関 与す る こと が示さ れた。一 方、ホ タテガイ 類11nの21か275番目の アミノ酸 配列はウサギnnと相同性が・6（％と高く、しかも酸性および鑑淕劃生のアミノ酸残基が多く存 在し て い たこ と か ら、 ウ サ ギmp，mと同 様 、 ′Mrと の静電的 相互作 用に関与 すると 考えら れ た 。 さ ら に 、 ウ サ ギn1Tの150259番 目 に 相 当 す るTHの 配 列 とウ サ ギnnの1501180番 目 に相当す る′rmの配列には、いずれもod］edてdJ構造を形成するタンバク質に特徴的な疎水性 アミノ酸 の周期 配列カ瀞 められ たことか ら、ウサ ギのTrlT可 ぬ問で推定されているように、
これらの領域が疎水的に相互作用すると考えられた。
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学位論文審査の要旨
； 学位論文題名
cDNA クローニングおよび変異体作製によるホタテガイ類 トロポニン T とトロポミオシンの構造・機能の解析
軟 体 動 物 の 筋 肉 は キ ャ ッ チ 機 構 や 、 二 重 の 筋 収 縮 調 節 機 構 す な わ ち ト ロ ポ ニ ン(Fn)― ト ロ ポ ミ オ シ ン mゆ 系 と ミ オ シ ン 軽 鎖 系 を 有 す る な ど 非 常 に 特 異 で あ り 、 そ の タ ン バ ク 質 も 特 異 な 性 質 ・ 機 能 を 有 し て い る 。 そ れ ら の タ ン バ ク 質 の 構 造 と 機 能 の 関 係 を 解 明 す る こ と は 、 筋 肉 の 比 較 生 化 学 及 び 高 度 利 用 の 見 地 か ら 重 要 で あ る 。
本 研 究 は ア カ ザ ラ ガ イ 及 び ホ タ テ ガ イ の 横 紋 閉 殻 筋 TnのTH、 サ ブ ュ ニ ッ ト と 、 そ れ に 結 合 す る 1、n1の 計5種 の タ ン バ ク 質 に つ い てcDN气 ク 口 ー ニ ン グ と ア ミ ノ 酸 配 列 解 析 を 行 い 、 さ ら に ア カ ザ ラ ガ イ グ I、 n1｀ と 1hの 変 異 体 を 大 腸 菌 に よ り 作 成 し 、 そ れ ら を 用 い て 性 質 ・ 機 能 の 検 討 を 行 っ て い る 。 本 論 文 に つ い て 審 査 員 一 同 カ 鋸 平 価 し た 点 を 以 下 に 述 べ る 。
（1） ア カ ザ ラ ガ イ 横 紋 筋n、 の スgt11．d〕NAラ イ ブ ラ リ ー を 抗 体 ス ク リ ー ニ ン グ し 、16個 の 陽 性 ク ロ ー ー ン を 得 た 。 そ れ ら のcDN气 をpBh髑 面ptHKS（ ＋ ） に 組 込 み 、 全 翻 訳 領 域 を 含 む2種 の ク 口 ー ン を 得 た 。 そ の 一 方 の ク ロ ー ン （A1、 ―3） に つ い てex：oldeb甘on法 を 適 用 し な が ら 全 長1，467bDの 全 塩 基 配 列 を 決 定 し 、314ア ミ ノ 酸 配 列 （ 分 子 量37，a）6） を 演 繹 し た 。
め 他 方 の dい nク ロ ー ン （ AJし16） の 1，823bpの 塩 基 配 列 を 同 様 に 決 定 し 、322ア ミ ノ 酸 の 配 列 紛 子 量38，091冫 を 演 繹 し た 。 こ の よ う に ア カ ザ ラ ガ イTrfrに は2種 の ア イ ソ フ オ ー ム7う 潮 生 す る こ と を 明 ら か に し 、 パI℃ お よ び ′ ・ ヽ1、 ー16が コ ー ド す るTrlTを そゎ ぞ れTrlnおよ び ］、n1、 ―1〕 と称 し た。
（3） ホ タ テ ガ イ 機 紋 筋nrlTの 翻 訳 領 域 全 体 を 有 す る ク 口 ー ン を 得 て 、 全 塩 基 配 列 （1，9391瑚 を 解 析 し 、325ア ミ ァ ′ 酸 配 列 （ 分 子 量38，438） を 演 繹 し た 。
＠ ア カ ザ ラ ガ イ と ホ タ テ ガ イ ￠ ）1Hr問 の ア ミ ノ 酸 配 列 相 同 性 は9オ 鋼 ％ で あ り 、 そ れ ら は ウ サ ギ TrlTよ り も 附 嵩 が27残 基 短 く 、C端 が80185残 基 長 か っ た 。 一 方 、8〔 ｝ や5番 目 の ア ミ ノ 酸 配 列 付 近 は ウ サ ギ r111｀ に 比 べ て 親 水 性 度 が 商 い が 、 そ れ 以 外 の 領 域 は 良 く 似 て い た 。 さ ら に 、 予 測 二 次 構 造 も ウ サ ギTrlTと 類 似 し て い た 。
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義 夫
雄 男
清
伸
徳
孝
田
上
島
西 関
猪 尾
授 授
授 授
教
教 教
救 助
査 査
査 査
主 副
副 副
(5)ア カ ザ ラ ガ イAT‑・3ク 口 ー ン のcDNA及 び やく ：Rbased mutagcnesisに よ り 変 異 を 導入 し たcDNA を用 いて、 大腸菌L3L21 (DE3)によりTifla及び・ニ1JのTnT楚巽体(TnTl‑236, TnT33ー236、′『ln丶1−120． お よ びTr11っ120） を 発 現 し 、 精 製 に 成 功 し た 。 こ れ ら を 用 い た 再 構 成rnは 、 それ ぞ れlO〔％ 、66
％ 、68％ 、9％ 、 お よ び13％ のCず 一 ℃n鑷auけ を 与 え た。 こ の こ と からTr汀 のC端121も14番 目 の 領域 の 存 在が ・ ぱ 調 節に 重 要 で あ るこ と を 明 ら かに し た 。 さ ら に、 固 定 化1、mア フ イ ニ テイ ー ク 口 マト グ ラ フィ ー によ ルアカ ザラガ イT111、 一司の33―1額）番 目の 領域Ia111結合 部位 が含ま れるこ とを明 らか にし た。
（6） ア カ ザ ラ ガ イTrnの サ プュ ニ ッ ト を コー ド す るd）Nへ を 約8，（ 膕 の 組 換 えフ ァ ー ジ か ら ク口 ー ニ ング し 、 翻 訳 領域 全 体 を 含 むd）NA（1，995bp） の 塩 基 配列 を 決 定 し 、284ア ミノ 酸 の 配 列 （ 分子 量32， 閉0） を 演 繹 し た 。 さ ら に 、 ホ タ テ ガ イ ′nnの サ ブ ュ ニ ッ ト を コ ー ド す るdつNA］ 種 類 を約 5， ∞ 〔 膕 の 組 換 え フ ァ ー ジ か ら 得 た 。 そ のc匸 ）NAは986bpか ら 成り 、 翻 訳 領 域は107も58番 目 の 塩 基 部 分 に あ っ た 。 そ の 配 列は284ア ミノ 酸 残 基 扮 子量32，596） を 演 繹し 、 ア カ ザ ラ ガイ ′n11の 配 列 と13残 基の違 いがあ った 。
（ の 配 列 相 同 性 は ア カ ザ ラ ガ イ と ホ タ テ ガ イ のTm問 で は96％ 、 そ れ らと ウ サ ギnn間 で46・47％ で あ っ た 。 ま た 、 ウ サ ギnn1と 比 べ て1801額K膰 目 付 近 は 疎 水 性 度 が 高 く 、250番 目 付 近 は 親 水 性 度 が 高 か っ た が 、 そ の 他 は 全 般 的 に 良 く 似 て い た 。 二 次 構 造 を 予 測 し た 結 果 、 ウ サ ギnnは 全 体 の 約 吋 ／oがaヘ リ ッ ク ス を 形 成 し て い た が 、 ホ タ テ ガ イ 類Th1で は 約83％ で あ っ た 。 （8） ア カ ザ ラ ガ イ1、mを 大 腸 菌 で 発 現 さ せ る こ と に 成 功し た が 、N末端 は ブ 口 ッ クは さ れ て い な か っ た 。 そ こ で 、N末 端 に1ア ミ ノ 酸 残 基 紬 ） ま た は2ア ミ ノ 酸 残 基 （A耳h气Dを 付 加 し だT、mを発 現 さ せ た 。 こ れ ら の 発 現Th1は 、 重 合 能 を 失 っ て い た 。 さ ら に 、 発 現nnは 既 報 の 結 果 とI司 様 に 、 N端 の数残 基部 分の機 能が天 然ワ）Th1と 著し く異な ってい た。
（9） ホ タ テガ イ 類n1Tと ′rn1の 一 次 構 造 から 、 両 者 の 相 互作 用 部 位 を 検討 した 結果、 ウサ ギT11Tと Tmの 場 合 と 同 様 に コHrの 酸 陸 お よ び ・ 塩 基 陸 ア ミ ノ 酸 残 基 の ク ラ ス タ 一 部 分 にmnと の 結 合 領 域 が 存 在 し た 。 一 方 、 ホ タ テ ガ イ 類Th1に お い てTrlTと 静 電 結 合 す る と 思 わ れ る 領 域 を 認 め た 。 さ ら に 、coi闇 一con構 造 を 形成 す る タ ン パク 質 に 特 徴 的な 疎 水 ｜ 生 アミ ノ 酸 の 周 期 配列 が 認 め ら れ、 こ れ らの 領域が 疎水的 に相互 作用 すると 考えら れた。
以 上 、 本 研 究 がcDNAク ロ ー ニ ン グ に よ ル ア カ ザ ラ ガ イ 及 び ホ タ テ ガ イ の3種 のrrlTと2種 のI、m の ア ミ ノ 酸 配 列 を 決 定 し 、 ア カ ザ ラ ガ イ の そ れ ら 変 異 体 を 作 成 し て 相 互 作 用 部 位 を 検 討 し 、新 た な 知 見 を 得 た こ と を 審 査 員 一 同 は 高 く 評 価 し 、 申 請 者 が 水 産 学 博 士 の 学 位 を 授 与 す る に 適 格で あ ると 判定し た。
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