学位論文内容の要旨

博 士 （ 医 学 ）    駒    貴 明

学 位 論 文 題 名

Studies on methods of differentialdiagnosis ， epidemi010gy     andpathologiCalmeChaniSmofhantaViruSinfeCtion

（ハンタウイルス感染症の鑑別診断法、疫学および病態機構に関する研究）

学位論文内容の要旨

【 緒 言 】 ハ ン タ ウ イ ル ス は 粒 子 内 に3本 の マ イ ナ ス 鎖 のRNA（S、M、Lセ グ メン ト ） を ゲ ノ ム と して 有 す る 。 ハン タ ウ イ ル スは 主 に げ っ 歯類 を 自 然 宿 主 とし 、 自然 宿主内 では不 顕 性 に 持 続感 染 し て い る。 ヒ ト ヘ は ウイ ル ス に 汚 染さ れ た 糞 尿 等 を介 し て呼 吸器感 染する 。 南 北 ア メリ カ 大 陸 に 棲息 す るげっ 歯類由 来のハ ンタ ウイル ス（新 世界ハ ンタ ウイル ス）は 、 重 篤 な 肺水 腫 を 特 徴 とし 、 高 い 致 死率 を 示 す ハ ンタウ イルス 肺症 候群(HPS)を引 き起こ す。

一 方 で 、ユ ー ラ シ ア 大陸 に 棲 息 す るげ っ 歯 類 由 来の ハ ン タ ウ イ ルス （ 旧世 界ハン タウイ ル ス ） は 腎 機 能 障 害 と 肺 水 腫 を特 徴 と す る 腎症 候 性 出 血 熱(HFRS)を 引 き 起 こ す。 本 研 究 で は 、 ハ ン タ ウ イ ル ス 感 染 症 の 診 断 法 、 疫 学 お よ び 病 態 機 構 の 解 析 に つ い て 実 施 し た。

（1）組 換 え 核 タ ン パク を 用 い た 血清 型 鑑 別ELISA法 の開 発

【 背 景 と 目 的 】 南米 のAndesvirus (ANDV)とLaguna Negra virus  (LANV)は 同 所 的 に 存在 し 、 ど ち ら もHPSを 引 き 起 こ す 。ANDVは ハ ン タ ウ イ ル ス の 中で 唯 一 ヒ ト か らヒ ト ヘ の 感 染 を 引 き 起 こ し 、 致 死 率 も45％ 前 後 と 極 め て 高 い 。 一方 、LANVに よ るHPSは 軽 症 型 （致 死 率15％ 以 下 ）で あ る 。 同 様に 北 米 のSin Nombre virus (SNV)に よ るHPSの 致 死 率 は40％ 前 後 で ある の に 対 し 、同 所 的 に 存 在す るCarizal virus (CARV)は 病 原性 がほと んど ない。

こ の た め、 流 行 国 で は臨 床 や 疫 学 調査 に 有 用 な 迅速 な 血 清 学 的 鑑別 診 断法 の開発 が望ま れ て き た 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 血 清 型 鑑 別 診 断 法 の 開 発 を 行 う こ と を 目 的 と し た 。   Sゲ ノ ム セ グ メ ン ト が コ ー ド す る 核 タ ン パ ク(N)の ア ミ ノ 末 端 よ り100番 目 ま で の ア ミ ノ 酸 領域 に は 交 差 反応 エ ピ ト ー プが 存 在 し 、230‑302番目の アミノ 酸領域 は低 保存領 域で 血 清 型 特異 的 エ ピ ト ープ が 存 在 す る。 そ こ で 、 新世 界 ハ ン タ ウ イル ス の低 保存領 域のア ミ ノ 酸 の ー致 度 を 比 較 し、 一 致 度 を もと に 血 清 型 の予 測 が 可 能 で ある か 検討 した。 さらに 、 ア ミ ノ 末端 の 交 差 反 応エ ピ 卜 ー プ を削 除 し た 組 換え抗 原(trNloo）を 作出し 、血 清型鑑 別診 断ELISA用 抗 原と し て の 有 用性 に っ い て 評価 を 行 っ た 。

【 材 料 と 方 法 】SNV、ANDV、LANV、CARVのtrN100を バ キ ュ ロ ウ イ ル ス 発 現 シ ス テ ム に よ り 作 出し 、 各 ウ イ ルス に 感 染 し たヒ ト お よ び げっ 歯 類 の 血 清 との 反 応性 を検討 した。 対 照 と し て各Nの 全 長 を発 現 さ せ たwholerNを 用 い た 。

【 結 果 と 考 察 】 ヒ ト お よ び げっ 歯 類 の い ずれ の 血 清 を 用 いて も 、wholerNをELISA抗 原 と し た 場 合 、 抗 原 間で 強 い 交 差 反応 が 認 め ら れ た。 一 方 でtrN100をELISA抗 原 と し た 場合 で は 各 抗 原と ホ モ の 血 清が 最 も 強 く 反応 し た 。

【 結 論 】こ の 鑑 別 法 によ っ て 、 新 世界 ハ ン タ ウ イル ス の 鑑 別 が 血清 学 的に 迅速に 実施出 来 る た め 、病 原 性 の 強 弱の 推 定 、 自 然宿 主 動 物 の 予測 な ど が 可 能 とな り 、本 疾患の コント ロ ー ル の た め に 有 用な 情 報 を 与 える と 考 え ら れ る。 こ の 鑑 別ELISAシス テ ム は ヒ トだ け で な く げ っ 歯 類 の ハ ン タ ウ イ ル ス 感 染 の 疫 学 調 査 に も 有 用 で あ る と 考 え ら れ た 。

（2） ベ ト ナ ム 北 部 に お け る 野 生 ラ ッ ト が 保 有 す る げ っ 歯 類 媒 介 性 病 原 体 の 調 査

【 背 景 と 目的 】 げ っ 歯 類 は種 々 の 人 獣 共通 感 染 症 病 原体 を 保 有する 媒介 動物で あり、 ヒト の 居 住 地 に棲 息 す る野生 ラット(Rattus spp.） はヒト の脅 威とな るハン タウイ ルス 、レプ ト ス ピ ラ 、 ラ ッ トE型肝 炎 ウ イ ル ス(HEV)お よ ぴ ペ ス ト等 の げ っ 歯 類 媒介 性 病 原 体 の主 要 な 感 染 源 で ある 。 従 っ て 、 げっ 歯 類 に お ける げ っ 歯 類 媒介 性 病 原体の 感染 状況を 知り、 げっ 歯 類 と の 接触 を 避 け る こ とが 感 染 予 防 に重 要 で あ る 。し か し 、東南 アジ アを中 心とし た途

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上 国 では げ っ 歯 類 にお け る 病 原 体の 感 染 状 況 が十 分 に 把 握 さ れて いない 。近 年、ベ トナム の 都 市部 で ハ ン タ ウイ ル ス 感 染 患者 が 報 告 さ れた 。 ま た 、 レ プト スピラ 抗体 陰性の 不明熱 患 者 から も ハ ン タ ウイ ル ス に 対 する 抗 体 が 検 出さ れ た 。 そ こ でべ トナム の都 市部に 棲息す る げ っ 歯 類 が 保 有 す る げ っ 歯 類 媒 介 性 病 原 体 の 抗 体 保 有 調 査 を 実 施 し た 。

【 材 料 と 方 法 】2011年1月 に ベト ナ ム 北 部 のハ ノ イ と ハ イフ オ ン 市 街 で220個 の トラ ッ プ を 用 いて 捕 獲 調 査 を行 な ぃ 、100匹 の ラ ッ 卜を捕 獲し、 血清を 採取し た。 げっ歯 類が媒 介す る ハ ン タ ウ イ ル ス 、 レ プ卜 ス ピ ラ 、 ラッ トHEVなら び に ペ ス トに 対 す るIgG抗 体 保 有 状況 をELISA法に より調 査し た。

【結 果】IgG抗体保有率はハンタウイルス（14％）、レプ卜スピラ(22％）、ラットHEV (23％）、

ペス ト（O％） であっ た。

【 結 論】 人 口 密 度 が高 い 市 街 地 にお い て 、 ハ ンタ ウ イ ル ス 、 レプ ト ス ピ ラ 、ラ ッ トHEVの 抗 体 を保 有 し た げ っ歯 類 が 棲 息 して い る こ と が明 ら か と な り 、ヒ トへの 感染 症とし ての危 険 性 が示 さ れ た 。 今後 も 継 続 し たげ っ 歯 類 の 調査 が 必 要 で あ り、 さらに これ らの地 域の不 明熱 患者を 中心と した抗 体保 有調査 の実施 が必要 である 。

  （ 3） 肺 水 腫 を 呈 す ハ ン タ ウ イ ル ス 感 染 SCIDに お け る 好 中 球 の 役 割   【 背 景 と 目 的1ハ ン タ ウ イル ス 感 染 に よっ て 引 き 起 こさ れる 肺水 腫は非 心原性 で肺血 管透 過 性の 亢 進 に よ り起 こ る と 考 え られ て い る が 、そ の 機 序 は 明ら か で は な い。 ハ ンタ ウイル ス は 細 胞 傷 害 性 が な く 、 患者 に お い て は 好中 球 や ウ イ ルス 特 異 的T細胞 の 増 加 が 認め ら れ る こ と か ら 、 疾 患 は 免 疫 病原 性 に よ る も ので あ る と 考 えら れ て い る 。好 中 球 は 、HPSと 症 状 が 類 似 の 急 性 呼 吸 窮 迫 症 候 群(ARDS)の 発症 機 序 に 大 きく 関 与 し 、 様 々な 血 管 透 過 性因 子 を産 生 す る こ とが 知 ら れ て い る。 こ の た め 、ハ ン タ ウ イ ルス 感 染 症 に おい て も好 中球が 肺 血 管 透 過 性 を 亢 進 さ せ 、獅 水 腫 を 引 き 起こ し て い る 可能 性 が 考 え られ る 。 近 年 、HPSウ イ ルス 感 染 で 致 死的 と な る ハ ム スタ ー モ デ ル を用 い た 実 験で、T細 胞以外 の細 胞がハ ンタウ イ ルス 感 染 の 免 疫病 原 性 に 関 与 して い る こ と が示 唆 さ れ て いる が 、 好 中 球の 役 割は 明らか で はな い 。

  一 般 に 、 ハ ムス タ ー モ デ ルで は 免 疫 学 的解 析 試 薬 な ど の研 究 手 段 が マウ ス に 比べて 限ら れ てお り 、 詳 細 な解 析 に は 限 界 があ る 。 ー 方 、マ ウ ス に ハ ンタ ウ イ ル ス を感 染 させ てもウ イ ルス は 早 期 に 排除 さ れ 、 症 状 は現 れ な ぃ こ とが 知 ら れ て いる 。 し か し 、申 請 者は 、機能 的 なT細 胞 、B細 胞 を 欠 失 し て い るCB17 Scid (SCID)マ ウ ス に ハ ンタ ウ イ ル ス を感 染 さ せ る と、 重 篤 な 一 過性 の 肺 水 腫 が 出現 す る こ と を発 見 し た 。 そこ で 、 本 研 究で は 、こ の肺水 腫 を呈 すSCIDマ ウ ス モ デ ルを 用 い て 、 好中 球 の 肺 水 腫出 現 へ の 役 割に つ い て 明ら かに する こ とを 目 的 と し て実 施 し た 。

【 材 料 と 方 法 】6‑8週 齢の メ ス のSCIDマ ウ スにHantaanvirus (HTNV) cl‑lを 腹 腔 内 投 与 し た 。7日 お き に 肺 水 腫 の 程度 、 好 中 球 数を 調 べ 、 肺 水 腫が 出 現 し 始 める 感 染28日目 の 肺 中 の 好 中 球 の 割 合 を 調 べ た 。 ま た 好 中 球 と 肺 水 腫 と の 関 係 を 調 べ る た め にHTNV感 染SCID マ ウス に お い て 、好 中 球 の 枯 渇 を行 い 、 肺 水 腫の 程 度 と 肺 血管 透 過 性 へ 与え る 影響 を調べ た 。

【 結 果 と 考 察 】 感 染28日 目 か ら 肺 水 腫 が 観 察 さ れは じ め 、 感 染35日 日 の マウ ス の 肺 で は 約80％ の 肺 胞 に滲 出 液 を 認 め、 そ の 割 合 はピ ー ク に 達 し た。 好 中 球 数 は感 染21日 目か ら有 意 に 増 加 し 、 感 染28日 目に は 非 感 染 群の そ れ の 約3倍 ま で 増 加 して い た 。 肺 水 腫が 出 現 し 始 める 感 染28日目 の 肺 中 の 好中 球 の 割 合 は非 感 染 群 と 比 ベ有 意 に 増 加 して い た 。好中 球の 枯 渇実 験 を 行 っ たと こ ろ 、 感 染33日 目 の 肺で は 水 腫 の 出 現が90％ 以上 抑 制 さ れ、 肺血 管透 過 性も 有 意 に 抑 制さ れ た 。 従 っ て、 こ の ハ ン タウ イ ル ス 感 染SCIDマウ ス に お いて は好 中球 が 肺血 管 透 過 性 の亢 進 を 引 き 起 こし 、 肺 水 腫 の出 現 に 関 与 して い る と 考 えら れ た。 今後、

ウ イル ス と 好 中 球、 好 中 球 と 血 管透 過 性 亢 進 との 関 係 性 に っい て 詳 細 に 解析 し て行 く必要 が ある 。

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学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

Studies on methods of differential diagnoslS ， epidemi010gy     andpath010giCalmeChaniSmofhantaVlruSinf ・ eCtion

（ハンタウイルス感染症の鑑別診断法、疫学および病態機構に関する研究）

申請者は新世界ハンタウイルス感染の鑑別診断法を開発するために、ハンタウイルスの 核夕ンバクの交差反応エピトープを欠損させた

抗原を作出し、鑑別ELISA に応用し た。今回の研究により新世界ハンタウイルスに感染したヒトおよびげっ歯類の血清型鑑別 を可能とした。またべ卜ナム北部のラットにおけるレプトスピラ、ソウル型ハンタウイル ス、ラ ットHEV およびべスト菌の抗体保有率を調べるために、ハノイ市内とハイフォン港 湾内でラットを捕獲した。この病原体の保有調査から、ハノイやハイフォンの都市部のラ ットに おいてはレプトスピラ、ソウル型ハンタウイルス、ラット

型肝炎ウイルスが流行 していることが明らかとした。次に、ハンタウイルスを感染させたSCID マウスにおいて認 められた肺水腫について、申請者は好中球の関与を疑い枯渇実験を行った。その結果、好 中球を枯渇したマウスでは肺血管透過性の亢進が有意に抑制され、肺水腫も認められなく なることを証明した。この結果から好中球がハンタウイルス感染で認められた血管透過性 の 亢 進 や 肺 水 腫 形 成 の 中 心 的 役 割 を 果 た し て い る こ と を 解 明 し た 。

審査会での質疑応答では、4 人の審査担当者より以下の質問がなされた。副査の大滝教 授より、日本国内でのヒトおよびげっ歯類におけるハンタウイルスの感染状況について、

鑑別診断を行う際のカットオフ値および感度、特異性について、また鑑別診断法の臨床で の有用性についての質問があった。これに対して申請者は現在、国内では患者が発生して いないこと、北海道においては感染したげっ歯類が存在すること、および、カットオフ値、

感度、特異性を説明した。副査の瀬谷教授より、モノクローナル抗体による治療に関連づ けてアンデス型ハンタウイルスがヒト―ヒト感染を起こすウイルス学的な知見について、ま た好中球を枯渇する際に用いた抗Gr −

抗体の特異性についての質問があった。これに対し て申請者は、アンデス型ハンタウイルスのどの部分がヒトーヒト感染を引き起こしているか は現在のところ不明であるが、その部分に対するモノク口ーナル抗体が作成出来れば予防 や治療にっながると回答を行った。また抗

−1 抗体の投与を行った際には、マク口ファー ジに影響しないことを確認しており、さらにマク口ファージについてはクロド口ネートリ ポソームを用いて単独枯渇を行い、肺水腫に影響を及ばさないことを確認していると回答 を行っ た。主査の玉城教授より、鑑別診断法としてELISA 法を選択した理由と、アメリカ

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彦 司

司 郎

英 純

二

城 滝

谷 川

玉 大

瀬 有

授 授

授 授

教 教

教 教

査 査

査 査

主 副

副 副

大陸で流行しているウイルス感染の鑑別診断法を、日本に在籍している申請者が研究を行 った理由について質問があった。こ れに対して申請者は、既存の中和試験法やPCR 法の問 題点を述ベ、イムノストリップ法については別の研究員が作成中であると回答した。また 国内で研究を行っている理由については、輸入感染症が危惧されるためであると回答を行 った。副査の有川教授から腎症候性出血熱を引き起こすハンターン型ハンタウイルスを感 染させて肺水腫が認められた理由お よび本肺水腫モデルの妥当性についての質問があっ た。これに対して申請者は、腎症候性出血熱とハンタウイルス肺症候群の両疾患は血管透 過性の亢進に起因する疾患であり、肺水腫も共通して認められるため、またハンターン型 ハンタウイルスは特に肺への親和性が高く、肺でウイルスが大量に複製されるために肺水 腫が認められたと回答を行った。さらに、本モデルの肺水腫がヒトと同じ血管透過性の亢 進に起因するという共通の病態機構で起きているのであれば、モデル動物としては妥当で あると回答を行った。

この論文は、新世界ハンタウイルスの鑑別診断法を開発し、ラットにおける各種病原体 の保有率を明らかにし、さらに好中球が血管透過性の亢進および肺水腫の形成に関与して いることを明らかにしたことで高く評価され、今後のさらなる診断・疫学研究およびウイ ルス 感染 にお け る病 原性 発現 機構 解明 への 基礎研究の発展 を期待させるものである。

審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども 併せ申請者が博士（医学）の学位を 取得するのに十分な資格を有するものと判定した。

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