博 士 （ 薬 学 ） 曽 根 孝 之
学位論文題名
Roles of Seml/DSSl in Ubiquitin − dependent Proteolysis （ユビキチン依存的夕ンパク質分解におけるSeml/DSSl の役割）
学位論文内容の要旨
ユビキチン．プロテアソームシステムは、細胞周期、シグナル伝達、DNA修復などの多様な生 命現象を制御する。このシステムはATP依存的なタンパク質分解機構で、酵母からヒトに至るま で真核生物において高度に保存されている。このシステムでは、最初に、ユビキチンが標的とな る基質タンパク質にLys残基を介して共有結合し、ポリユビキチン鎖が形成される。このユビキ チン化反応は、El（ユビキチン活性化酵素）、E2（ユビキチン結合酵素）およびE3（ユビキチン リガーゼ）によって触媒され、分解マシンである26Sプロテアソームが、形成されたポリユビキ チ ン 鎖 を 分 解 シ グ ナ ル と し て 認 識 し 、 基 質 タ ン パ ク 質 をATP依 存 的 に 分 解 す る 。 26Sプロテアソームは、活´陸中心を有する20Sプロテアソーム(CP)と、その活´性を制御する19S 複 合体(RP)か ら構成 される。RPは、8つのRpnサブュ ニット から構成される蓋部(lid)と、6 つ のRptサブユニットと2つのRpnサブユニットから構成される基底部(base)の、2つのサブ複 合体から成る。
本研究では、ユビキチンープロテアソームシステムの機構解明を目指し、出芽酵母を用いて、lid サブ複合体の新規サブユニット(Seml）の同定、Semlの機能解析、および、ヒトSemlホモログ
(DSS1）の機能解析を行い、このシステムによるタンパク質分解機構に関する新知見を得た。
1．出芽酵母26Sプロテアソームの新規サブユニットの同定1）
26Sプロテアソームの新規サブユニットを同定するために、PREl (CP)、RPNl (base)および RPNl̲I (lid)の各遺伝子に3xFlagタグを融合した株を作成した。それらの株を用いて、抗Flag 抗体ビーズによるアフイニティー精製を行い、26Sプロテアソーム、baseおよびlidサブ複合体、
CPを 得た。SDS‑PAGEの結果より、26Sプロテアソームとlidサブ複合体の場合に、未知のタン パク質が検出された。そこで、そのバンドをゲル内でV8プロテアーゼにより消化後、得られた ぺプチドをHPLCにより分別・分取し、アミノ酸配列を決定した。その結果、未知タンパク質は Semlであることが明らかになった。
Semlが26Sプロテアソームの新規サブユニットであることを確認するために、抗Flag抗体ビ ーズを用いた免疫沈降実験を行ったところ、Semlが他のプロテアソームサブュニット(Rpn9、 Rpt5)と共沈することが明らかになった。さらに、GST‑Seml融合タンパク質を用いてpull‑down 実 験を行っ たとこ ろ、GST‑Semlが 、SEM1遺伝子 破壊(Aseml）株から精製した26Sプロテアソ ームのみに結合することが明らかになった。
2． Semlの機能解析1）
SEM1遺 伝子は エキソサイトーシスに関与する遺伝子変異体の抑制遺伝子として同定され、
Aseml株は温度感受性を示す。そこで、Aseml変異が26Sプロテアソームの機能に及ぼす影響を 調べたところ、Aseml株において非許容温度下でポリユビキチン化タンパク質の蓄積が観察され た。さらに、Semlの機能を解析するために、野生株とAseml株からアフイニティー精製した26S
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プ ロテ アソ ーム を 用い て、 ポリ ユ ビキ チン 化SiclPYの 分解を 調べた。その結果、前者（野 生株）
の 場合 に比 べて 、 後者(Aseml株 ） の場 合に ポリ ユビ キ チン 化Sicl PYの 分解 速度 が遅いこ とが明 ら か に な っ た 。 な お 、 い ず れ の 場 合 もポ リユ ビ キチ ン化Cdc34と 結合 でき る ので 、Semlは 、ポ リ ユ ビ キ チ ン 化Siclが26Sプ ロ テ ア ソ ー ムに 結合 した 後 の分 解過 程に 関与 し てい ると 考え られ る。
3． SEM1遺 伝子変異体の解析
Semlは 、Pheお よ びTrp残 基 が 種 間 で 保 存 さ れ て い る 酸 陸 タ ン パク 質で あ る。Semlのタ ンパ ク 質分 解に おけ る 役割 を調 べる た めに 、種 問で 保存 さ れてい るアミノ酸残基を置換した22種類の seml変 異 株 を 作 成 し た 。 そ れ ら の 中 で 、60お よ び64番 目 のTrp残 基 をAlaに 置 換 し た 変 異 体 (seml‑17)と 、ニ つの 酸 陸ア ミノ 酸領 域で 置 換を 行っ てほ ぼ 中性 のタ ンパ ク質 に変えた 変異体 (seml‑27)は 、Aseml株と 同様 に 、温 度感 受性 を示 し た。し かし、seml ‑17株では、野生 株の場 合 と 同 様 に 、 非許 容 温度 下に おい ても ポ リユ ビキ チン 化 タン パク 質が 蓄積 し なか った 。semi‑l 株 が温 度感 受性 を 示す のは 特定 の タン パク 質の 分解 が 遅延し ているためではないかと考え 、Seml と 結 合 で き る がSeml‑17と は 結 合 で き な ぃタ ンパ ク質 の 探索 を行 った 。LC‑MSfMS解析 によ り、
Seml結 合 タ ン パク 質 とし てGa180、Sps19及びSte23を 得た 。こ れら の タン パク 質がseml‑17株の 表 現 型 に ど の よ う に 影 響 を 及 ば し て い る か に つ い て 検 討 す る こ と が 今 後 の 課 題 で あ る 。 4．ヒトSemlホモログ(DSSl)の機能解析
DSS1は、 発生 期 の末 端形 成異 常 を示 す遺 伝病 に関 わ る候補 遺伝子産物として同定された 。その 後 、 が ん 抑 制 タ ン パ ク 質BRCA2と 結 合 す ると 報告 され た 。本 研究 によ り、 酵 母Semlが プロ テア ソ ー ム サ ブ ユ ニ ッ ト で あ る こ と が 明 らか にな っ たの で、DSS1もヒ ト26Sプ ロ テア ソー ムの 構成 サ ブ ユ ニ ッ ト であ る と考 えら れる 。そ こ で、HEK293T細胞 でDSSl‑Flagを過 剰 発現 して 免疫 沈降 実 験を 行っ たと こ ろ、DSS1は26Sプ ロテ アソ ー ムと 結合 してい ることが明らかになったl、 。従つ て 、 ヒ ト の 場 合も 、DSS1がプ ロテ アソ ー ムサ ブュ ニッ ト であ ると 考え られ る 。な お最 近、DSS1 も ヒ ト26Sプ ロテ アソ ーム の 構成 タン パク 質で あ るこ とが 報告 され た 。次 に、26Sプロ テア ソー ム とBRCA2と の 関 係 を 調 べ る た め に 、RPN11‑ Flagを 安 定 に 発 現 するHeLa細 胞株 を樹 立し た。
抗Flag抗 体 ビ ー ズ を 用 い た ア フ イ ニ ティ ー精 製 によ ルヒ ト26Sプ ロテ アソ ー ムを 精製 した とこ ろ 、 プ ロ テ ア ソー ム がBRCA2と結 合し てい るこ と が明 らか にな った 。 そこ で、Seml‑17と同 様の 変 異 を 導 入 し たDSSl‑W39/43Aを 作 成 し 、BRCA2のC末 端 フ ラ グ メ ン ト と 共 にHeLa細 胞 に 発 現 さ せ 免 疫 沈 降 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、DSS1ーW39/43Aは 、 野 生 型DSS1と 比 べ て 、BRCA2のC末端 フラグメン トとの結合が弱いことが明ら かになった。
上 記 の 結 果 か ら 、DSS1は26Sプ ロ テ ア ソ ー ム の サ プ ユ ニ ッ ト と し てBRCA2と 結 合 し 、DSS1 とBRCA2と の 結合 にはTrp残基 が関 与し て いる こと カ§ 示 唆さ れた 。今 後、DSS1を 介し てプ ロテ ア ソ ー ム がBRCA2と 相 互 作 用 す る 意 義 を 検 討 す る こ と が 必 要 であ る 。BRCA2はプ ロテ アソ ーム と 結 合 し た 状 態 で 存 在 し 、DSS1が プ ロテ アソ ー ムとBRCA2と の相 互作 用の 足 場と なっ てい る可 能性が考え られる。
【まとめ】
1． Semlは 酵母26Sプロテアソームの新 規サブュニットである。
2． Semlは ユビキチン依存的タンパク質 分解に関与している。
3． ヒ トDSS1を 介 し て26Sプ ロ テ ア ソ ー ム はBRCA2と 結 合 し 、DSS1のTrp39/43残 基 がBRCA2 との結合に 関与している。
【参考文献 】
1． Sone，T．，Saeki，Y．，Toh‑e，A．，and Yokosawa,H．(2004)メBiol. Chem．279，28807‑28816
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学位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教授 教授 准教授 准教授
横沢 有賀 川原 松本
英良 寛芳 裕之 健一
学位論文題名
Roles of Seml/DSSl in Ubiquitin − dependent Proteolysis （ユビキチン依存的夕ンパク質分解におけるSeml/DSSl の役割）
ユ ピキチン・プ口テアソームシステムは、細胞周期、シグ ナル伝達、DNA修復など の多 様な生命現象を制御する。このシステムはATP依存的なタンパク質分解機構で、
酵 母か ら ヒト に至るまで真核生物において高度に保存されている。 このシステムで は、 最初に、ユピキチンが標的となる基質夕ンバク質にりシン残基を介して共有結合 し、 ポリユビキチン鎖が形成される。次に、26Sプ口テアソームが、形成されたポル ユ ビキ チ ン鎖 を分 解シ グナ ルと して 認識 し、基質夕ンパク質をATP依存的に分解す る 。分 解 マシ ンで ある26Sプロ テア ソ ーム は、 活性 中心 を有 する20Sプ口テアソー ム と、 そ の活 性を 制御 する19S複合 体 から 構成 され 、後 者の19S複 合体はさらに、
蓋部(lid)サブ複合体と基底部(base)サブ複合体から成る。
本 論文提出者は、出芽酵母およびヒトの19S複合体の構築機構と新規サブュニットの 機能 に関する一連の研究を展開し、以下の成果をおさめた。
（1）プロテアソームサブュニット遺伝子にFlag夕グを融合した出芽酵母株を用いて、
baseおよびlidサブ複合体を単離 して解析し、lidサブ複合体の新規サブュニットを発 見 し、 そ れがSemlであることを明らかにした。そして、GST‑Seml融 合夕ンパク質を 用 い てpull‑ down実 験を 行い 、GST‑Semlが 、SEM1遺伝 子破 壊株 から 精製 した26S プ口 テアソームのみに結合することを明らかにした。
（2）出芽酵母のェ9EM1遺伝子破 壊株は温度感受性を示し、非許容温度下でポリユビ キチ ン化夕ンパク質が蓄積すること、そして、エ9EM1遺伝子 破壊株から精製した26S プ口 テアソームは、野生株から精製した26Sプ口テアソームに比較して、ポリユピキチ ン化Sicl夕ンパク質の分解が遅いことを明らかにし、Semlがユビキチン依存的夕ンバ ク質 分解において重要な役割を果たしていると結論した。
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（3）Semlに おい て種 間で 保存 さ れて いる アミ ノ酸 残基を 置換した22種類の出芽酵 母 変異株を作成して解析し、60および64番トリプトファン 残基をアラニンに置換した 変 異体(seml‑lカと、二つの酸性アミノ酸領域におけるアス パラギン酸残基とグルタ ミン酸残基をそれぞれアスパラギンとグルタミンに置換した変異体(seml ‑27)が、．鑓ロげ J遺伝子破壊株の場合と同様に 、温度感受性を示すことを明らかにした。また、前者の seml ‑17株の場合では、野生株の場合と同様に、非許容温度下においてもポリユビキチ ン 化夕ンパク質が蓄積しないことを明らかにした。この場 合に温度感受性を示す理由 は 、 特 定 の タ ン パ ク 質 の 分 解 が 遅 延 し て い る た め と 考 え 、Semlと結 合で きる が Seml‑17とは 結合 でき ない タン バ ク質 の探 索を 行い 、Ga180、Sps19お よびSte23を Seml結合夕ンバク質として同定し、これらのタンバク質が 変異株の表現型に影響を及 ばしていると提案した。
（4） ヒ トSemlホ モ 口 グ で あ るDSS1が ヒ ト26Sプ ロ テ ア ソ ー ムと 結合 する こと を 明 ら かに し、DSS1がプ 口テ アソームサブュニットであると 提案した。また、DSS1が が ん抑制夕ンバク質BRCA2と結合すると報告されているので 、種問で保存されている 2つ の 卜 リ プ ト フ ァ ン 残 基 を ア ラニ ンに 置換 したDSS1変異 体 を作 成し てBRCA2のC 末 端 フラ グメ ント との 結合 を解 析し 、野 生型DSS1の場 合と 比 較し て、BRCA2のC末 端 フラグメントとの結合が弱いことを明らかにした。さらに、精製したヒト26Sプ口テ ア ソームとBRCA2との結合を解析し、両者が結合することを 明らかにした。以上の結 果 か ら 、DSS1は26Sプ 口 テ ア ソ ー ム サ ブ ュ ニ ッ ト と し てBRCA2と 結 合 し 、 そ の BRCA2と の 結 合 に は 2つ の ト リ プ ト フ ァ ン 残 基 が 関 与 す る と 提 案 し た 。 以上の新知見およびそれらを得るために用いた新研究方法は、26Sプロテアソームの 構 築機構やユビキチン依存的夕ンバク質分解の分子機構の理解にとどまらず、ユピキチ ン ‐プ口テアソームシステムによる細胞機能の制御機構を理解する上で重要な寄与をな すものである。
審査委員一同このことを高く評価し、本論文提出者が博士（薬学）の称号を受けるに ふさわしいものと一致して判断した。
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