微生物学実習 微生物学実習 微生物学実習 微生物学実習 ((((担当担当担当担当::::生体情報学生体情報学生体情報学生体情報学ⅡⅡⅡⅡ講座講座講座)))) 講座 テーマテーマテーマ(1)テーマ(1)(1)(1)環境中環境中環境中環境中ののの微生物の微生物の微生物微生物ののの採取採取採取と採取ととと観察観察観察観察 (a) (a) (a) (a)目的目的 目的目的 水や手を培地にさらして培養し、どのような微生物がどれだけ存在するかを調べる。 (b) (b) (b) (b)材料材料 材料材料 LB 寒天培地(1%Triptone0.5%、乾燥酵母エキス 1%、NaCl1.5%、寒天)、黎明寮(多人数) の風呂の水、西播磨寮 C 棟(1 人)の風呂の水、兵庫県立大学書写キャンパスサークル会館前 の土、兵庫県立大学播磨科学公園都市キャンパス学生用駐車場からキャンパスに向かう途 中の路肩の土 (C (C (C (C))))方法方法方法方法 黎明寮の風呂の水において入浴前は 6 月 20 日午後 5 時ごろ、入浴後は翌日午前 7 時ごろ採 取した。西播磨学生寮 C 棟の風呂、兵庫県立大学書写キャンパスサークル会館前の土、兵 庫県立大学播磨科学公園都市キャンパス学生用駐車場からキャンパスに向かう途中の路肩 の土をサンプルとして採取した。各自が持参したサンプルの水をピペットマン、滅菌済み ブルーチップを用いて、LB 寒天地のプレートに 0.1ml 撒き、アルコールで殺菌したコンテ ージ棒を用いて均一に広げた。手から採取した際は、手の甲、指を直接プレートにつけた。 シャーレのふたにグループ名、採取対象をマジックペンで書き込み、プレートを裏返しに してインキュベータ(37℃)で 24 時間培養した。そして培養したプレートのコロニーの大き さ、形、色、表面の状態などに注意しながらスケッチした。 (d (d (d (d))))結果結果結果結果 1. 1. 1. 1.実験者実験者実験者実験者のののの食指食指食指 食指 人差し指で触れた部分の培地に約 1～3mm の黄色、円形のコロニーと、約 0.1～2.0mm の
白色、円形のコロニーが観察できた。黄色、白色のコロニーとも光沢があった。特に黄色 のコロニーはかなりの厚みがあった。反対側の指で触れなかった培地には何も繁殖してい なかった。 2. 2. 2. 2.多人数多人数多人数が多人数ががが入浴入浴入浴する入浴するするする前前の前前ののの風呂風呂風呂の風呂ののの水水水水 1ヶ所のみ黄色、円形のコロニーができているが、他の部分には何の繁殖も見られなかった。 3 3 3 3....多人数多人数多人数が多人数ががが入浴入浴入浴した入浴したしたした後後の後後ののの風呂風呂風呂の風呂ののの水水水水 白色、円形のコロニーが培地上に広がっていたが、すべてを埋め尽くすほど密集しておら ずところどころ何も繁殖していない隙間があった。コロニーの大きさは約 1～3mm で、表 面は滑らかな光沢があった。
4. 4. 4. 4.個人個人個人が個人ががが入浴入浴入浴入浴するするする前する前の前前ののの風呂風呂風呂風呂のののの水水水水 円形に近い不定形、白色のコロニーが培地ほぼすべてを埋め尽くすように広がっていた。3 の培地と比較してひとつひとつのコロニーの大きさが小さく、数も多かった。 5. 5. 5. 5.個人個人個人が個人ががが入浴入浴入浴入浴したしたした後した後の後後ののの風呂風呂風呂風呂のののの水水水水 4の培地と同じく円形に近い不定形、白色のコロニーが培地ほぼすべてを埋め尽くすように 存在していた。数個の橙色の少し大きな円形のコロニーもできていた。コロニー大きさひ とつひとつが 4 の培地と比較して少し大きくなっていた。 6. 6. 6. 6.兵庫県立大学書写兵庫県立大学書写兵庫県立大学書写キャンパスサークル兵庫県立大学書写キャンパスサークルキャンパスサークルキャンパスサークル会館前会館前の会館前会館前ののの土土土 土
白色の小さなコロニーが培地を埋め尽くすように広がっていた。他の形状のコロニーが見 られないことから 1 種類の菌の繁殖だと考えられる。 7. 7. 7. 7.兵庫県立大学播磨科学公園都市兵庫県立大学播磨科学公園都市兵庫県立大学播磨科学公園都市兵庫県立大学播磨科学公園都市キャンパスキャンパスキャンパスキャンパス学生用駐車場学生用駐車場から学生用駐車場学生用駐車場からからキャンパスからキャンパスキャンパスキャンパスにかけてにかけてにかけてにかけて の の の の路肩路肩路肩路肩ののの土の土土 土 円形、白色のコロニーと線形、白色のコロニーが培地を埋め尽くすように広がっていた。 (e (e(e (e))))考察考察考察考察 1. 1. 1. 1. 実験者実験者実験者実験者のののの食指食指食指 食指 動物は胎内にいるときは皮膚も体内も無菌的であるが、外界へ出てくると、すぐ各種微生 物が住み始める。とくに皮膚や粘膜など外界と接する部分には多くの微生物が生息してい る。これらの微生物は常在微生物叢と呼ばれている。皮膚にはグラム陽性の表皮ブドウ球 菌Micrococcus、嫌気性のPropionibacteriumなどが存在する。これらの細菌は皮膚 1cm2 当りの菌数は 103～104個程である。消毒を行うと一時的に無菌的な環境になるが、汗腺な どから残存した菌が出てくるため元に戻る。今回発見されたコロニーはこの常在微生物叢 だと考えられる。 2 2 2 2....多人数多人数多人数で多人数ででで入浴前入浴前入浴前の入浴前ののの水水と水水ととと入浴後入浴後入浴後の入浴後ののの比較比較比較比較 多人数が入浴する前の風呂の水でコロニーが発見されず、入浴後に多くのコロニーが存在 したのは塩素殺菌のためだと考えられる。また入浴後に繁殖していた細菌も常在微生物叢 であると考えられる。 3 3 3 3....個人で個人個人個人ででで入浴前入浴前の入浴前入浴前のの水の水水水とととと入浴後入浴後の入浴後入浴後ののの水水水水ののサンプルののサンプルサンプルのサンプルののの比較比較比較比較 個人が入浴する前の風呂の水で、入浴後の風呂の水の培地とほとんどコロニーの状況が変 わらなかった。これには 2 つの理由が考えられる。第一に浴槽の洗浄があまり行われてい ない不衛生な環境が水に影響を与えたという可能性。つぎにサンプル採取後、プレートに 移す操作の段階で降下細菌が入った可能性である。繁殖したコロニーの種類も同一である ことから、前者の可能性の方が高いと思われる。
4. 4. 4. 4.多人数で多人数多人数多人数ででで入浴入浴の入浴入浴のの水の水水水とととと個人個人で個人個人ででで入浴入浴入浴入浴のの水のの水水の水のの比較の比較比較 比較 個人が入浴する前の風呂の水による培地で多くのコロニーが発見されたのに対して、多人 数で入浴する前の水ではほぼ無菌状態だった。これは後者の清掃がよく行き届いているた めだと考えられる。 5 5 5 5....書写キャンパス書写書写書写キャンパスキャンパスキャンパスでで採取でで採取採取した採取したした土した土土土とと播磨科学公園都市とと播磨科学公園都市播磨科学公園都市播磨科学公園都市キャンパスキャンパスキャンパスキャンパスしたしたサンプルしたしたサンプルサンプルサンプルのののの比較比較比較比較 書写キャンパスで採取したコロニーはひとつひとつのコロニーの判別が難しいほど密集し ていて、全く隙間のない状況だった。一方、播磨科学公園都市キャンパスで採取した土は コロニーの大きさも大きく、書写では見られなかった線形のコロニーが見られた。 テーマ テーマテーマ テーマ(2)(2)(2)(2)大腸菌大腸菌の大腸菌大腸菌ののの増殖曲線増殖曲線増殖曲線増殖曲線、、及、、及及及びびび抗生物質び抗生物質による抗生物質抗生物質によるによるによる生育阻害生育阻害生育阻害生育阻害 (a) (a) (a) (a)目的目的 目的目的 新鮮な培地において大腸菌がどのような増殖曲線を描くか、抗生物質アンピシリンを加え ることでどの程度増殖が抑制されるかを調べる。 (b) (b) (b) (b)材料材料 材料材料 液体培地、大腸菌懸濁液、アンピシリン溶液(5mg/ml) (C (C (C (C))))方法方法方法方法 1番と 2 番の 2 つ液体培地を用意し、1 番は何も加えないまま吸光度を測定し、2 番は実験 開始から 60 分後にアンピシリンを加えて吸光度を測定した。 液体培地が入った三角フラスコから 2ml の液体培地を無菌的に取り出し、キュベットに入 れ 660nm の吸光度 A660(濁度)を測定し、これを Blank とした。もう一つの液体培地につい ても同様の操作を行った。2 個の三角フラスコの液体培地に大腸菌懸濁液をピペットマン、 滅菌済みブルーチップを用いて無菌的に取り出し、分光光度計で 660nm の吸光度 A660(濁 度) を測定し、これを 0 分の懸度測定とした。37℃で振盪培養を開始し、それぞれの三角 フラスコから 20 分毎に 2ml ずつ無菌的に取り出し、同様にして吸光度 A660(濁度) を測定 した。培養開始 60 分後に片方の液体培地にピペットマン、滅菌済みブルーチップを用いて 滅菌的にアンピシリン溶液(5mg/ml)を 0.4ml 加え、「アンピシリンなし(1)」と「アンピシリ ン入り(2)」の液体培地での培養と 20 分毎の濁度の測定を 180 分まで行った。 (d (d (d (d))))結果結果結果結果 Blankは 1、2 それぞれ 0.089、0.091 となった。表 1 に何も加えない(1)と実験開始から 60 分後にアンピシリンを加えた(2)の吸光度を示す。グラフ 1、2 はそれぞれ縦軸を通常にとっ たグラフと対数をとったグラフである。
表 表 表 表 1111::::アンピシリンアンピシリンアンピシリンアンピシリンなしなしなしなし(1),(1),(1),(1),あり(2)ありありあり(2)(2)(2)のののの吸光度測定値吸光度測定値吸光度測定値吸光度測定値 時間(分) 1 の測定結果 真の吸光度 2 の測定結果 真の吸光度 0 0.193 0.104 0.199 0.108 20 0.235 0.146 0.256 0.165 40 0.329 0.240 0.357 0.266 60 0.526 0.437 0.555 0.464 80 0.734 0.645 0.487 0.396 100 1.007 0.918 0.208 0.117 120 1.278 1.189 0.200 0.109 140 1.680 1.591 0.200 0.109 160 1.990 1.901 0.224 0.133 180 2.200 2.111 0.215 0.124
グラフ1.アンピシリン添加による吸光度の変化(通常)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0
20 40 60 80 100 120 140 160 180
時間(分)
吸
光
度
(n
m
)
アンピシリンなし
アンピシリン入り
グラフ2.アンピシリン添加による吸光度の変化(片対数)
0.1
1
10
0
20 40 60 80 100 120 140 160 180
時間(分)
吸
光
度
(n
m
)
アンピシリンなし
アンピシリン入り
グラフ 2 におけるアンピシリンなし(1)の増殖曲線の形状からどの増殖段階であるかを判断 する。はじめに 0～20 分かけてはおだやかに細胞数が増加していることがうかがえること から、この間が遅滞期であると判断できる。つぎに 20～100 分にかけてほぼ 1 次関数のよ うに細胞数が大きく増加していることから、対数期であると判断できる。最後に 100～180 分にかけて増殖速度が衰え始めていることから、静止期であると判断した。 グラフ 2 におけるアンピシリンあり(2)の増殖曲線からアンピシリンが増加曲線に与える影 響を考える。アンピシリンを加える前までの増殖速度は(1)と一致している。60 分の吸光度 計測後アンピシリンを加えたところ 80～100 分にかけて増殖速度が急激に減少した。これ はアンピシリンによって細菌の細胞壁のペプチドグリカンの架橋合成が阻害され、ペプチ ドグリカンが薄くなり、細胞の強度が低くなる。そのため、浸透圧により水が細胞内に流 入し溶菌し、大腸菌が死滅したことが予想できる。細菌が死滅しても吸光度が Blank 値に 戻らない点については考察で述べることとする。 対数期の細胞増殖速度は細胞数を N、増殖速度定数をμとすると)
(
ln
ln
N
−
N
0=
µ
t
−
t
0 で表せる。グラフ 2 の対数期を 1 次関数とみなし、最小二乗法によって傾きを求めれば、 増殖速度定数μを求めることができる。 グラフ 2 のアンピシリンを入れなかった培地(1)において対数期を 20～100 分と判断し、増 殖速度定数と世代時間を求める。 表 2 の値を以下の式に代入すると増殖速度定数μは
x
x
x
n
y
x
xy
n
∑
∑
−
∑
∑
∑
−
∑
=
2µ
300
300
22000
5
704
.
4
300
87
.
188
6
×
−
×
×
+
×
−
=
=
0
.
139
となる。 よって細菌数が 2 倍になるまでの時間の世代時間は、ln
2
=
µ
t
で表すことができ、μを代入し t を求めると)
(
867
.
49
2
ln
分
=
=
µ
t
となった。 表 表 表 表 2222::::増殖速度定数増殖速度定数μ増殖速度定数増殖速度定数μμμををを計算を計算するために計算計算するためにするためにするために 1111 ののの培地の培地の培地培地のの吸光度の吸光度吸光度を吸光度ををを変換変換した変換変換したしたした値値値 値 n x x2 y xy 1 20 400 -1.924 -38.48 2 40 1600 -1.427 -57.08 3 60 3600 -0.828 -49.68 4 80 6400 -0.439 -35.12 5 100 10000 -0.086 -8.56 ∑ 300 22000 -4.704 -188.87 グラフ 2 よりアンピシリンを測定開始 60 分後に入れた培地(2)の対数期を 20～60 分と判断 し、増殖速度定数と世代時間を求める。 表 3 の値を以下の式に代入すると増殖速度定数μはx
x
x
n
y
x
xy
n
∑
∑
−
∑
∑
∑
−
∑
=
2µ
120
120
5600
3
8944
.
3
120
55
.
143
3
×
−
×
×
+
−
×
=
0153
.
0
=
となる。 同様に t を求めると)
(
304
.
45
2
ln
分
=
=
µ
t
表 表 表 表 3333::::増殖速度定数増殖速度定数μ増殖速度定数増殖速度定数μμμををを計算を計算するために計算計算するためにするためにするために 2222 ののの培地の培地の培地培地のの吸光度の吸光度吸光度を吸光度ををを変換変換した変換変換したしたした値値値 値 n x x2 y xy 1 20 400 -1.802 -44.51 2 3 40 60 1600 3600 -1.324 -0.768 -52.97 -46.07 ∑ 120 5600 -3.894 -143.55 (e (e (e (e))))考察考察 考察考察 アンピシリンを加えた培地(2)での吸光度が Blank 値まで下がらない理由を考察する。細菌 の死骸が吸光度に与える影響、アンピシリン溶液が吸光度に与える影響、形質転換しアン ピシリン耐性をもった大腸菌の出現、実験操作の際にペプチドグリカンをもたない細菌の 流入の恐れが挙げられる。 はじめに、細菌の死骸が吸光度に与える影響が挙げられる。Blank と(2)の溶液の違いは大 腸菌懸濁液及びアンピシリンを加えているか否かである。大腸菌が全てが死滅したとして も、その成分は培地中に残っているはずなので、これが濁度が Blank まで下がらなかった 理由と予想できる。 つぎに、アンピシリン溶液が吸光度に与える影響だがこれは大腸菌を加えない培地にアン ピシリンを加えて対照実験を行えば明確な結果が得られるはずである。 さらに、形質転換しアンピシリン耐性をもった大腸菌の出現について考察する。形質転換 しアンピシリンに対して耐性をもつ大腸菌が出現すれば、吸光度はいずれ再び上昇し始め るはずである。実際 160～180 分にかけてわずかに濁度が上昇し始めている。この先も吸光 度を測定し続ければ、対数期になり(1)のような増殖曲線を示したのだろうか。わずか数十 分の間に形質転換が起こるほど、大腸菌の環境に対する適応性は高いのだろうかという点 が疑問となる。しかしながら形質転換が起こったとすれば、ほかの可能性と比較してこれ が最も測定値に影響を与えることとなる。 最後に実験操作の際にペプチドグリカンをもたない細菌の流入の恐れについてである。ペ プチドグリカンをもたない細菌にマイコプラズマが挙げられる。しかし、この菌は多くが 病原菌であり、実験者に症状をもつものもない点、日常生活ではあまり見る機会がない点 から可能性はきわめて低いといえる。
テーマ テーマテーマ テーマ(3)(3)(3)(3)大腸菌大腸菌の大腸菌大腸菌ののの形質転換形質転換形質転換形質転換 (a) (a) (a) (a)目的目的 目的目的 新鮮な培地において大腸菌がどのような増殖曲線を描くか、β-ラクタマーゼ遺伝子をもつ プラスミド(pBR322)によって形質転換を生じさせ、大腸菌の形質転換効率を求める。 (b) (b) (b) (b)材料材料 材料材料 液体培地、プラスミド溶液(pBR322、10ng)、コンピテントセル、希釈用滅菌水 (C (C (C (C))))方法方法方法方法 エッペンドルフチューブ内のコンピテントセルを室温で溶かし、すぐにアイスボックス内 に移した。プラスミド溶液(pBR322、10ng)の入ったエッペンドルフチューブ及びプラスミ ドの入ってない滅菌済みのエッペンドルフチューブに、それぞれコンピテントセルをピペ ットマンで数回吸ったり吹いたりすることで均一な懸濁液にして分注し、ふたをして攪拌 した後すぐにアイスボックス内に移した。次にそれぞれのエッペンドルフチューブにコン ピテントセルを 0.2ml ずつ加え、37℃で 1 時間震盪培養した後、底に沈んでいる菌体を良 く混ぜ、それぞれのサンプルに 0.2ml ずつ、準備しておいた 1.8ml の滅菌水に加え 10 倍に 希釈した。さらに菌体密度が均一になるように攪拌した後、同様の 10 倍希釈を 4 回繰り返 し 10、102、103、104、105倍希釈溶液を作成した。2 つのサンプルの 10、103、105倍希釈 溶液から 0.1ml ずつ取り出し「アンピシリンなし」と「アンピシリン入り」のプレートに 撒き、コンラージ棒を用いて塗り広げ、インキュベーター内で裏返しにして 24 時間培養し た。その後プレートを取り出しプレート内のコロニー数を測定し、大腸菌の形質転換効率 を求めた。 (d (d (d (d))))結果結果結果結果 アンピシリン入り、なし、各希釈倍率による大腸菌のコロニー数の変化を表 4 に示す。 表 表 表 表 4444::::各希釈倍率各希釈倍率各希釈倍率各希釈倍率によるによるによるによる大腸菌大腸菌の大腸菌大腸菌ののコロニーのコロニーコロニー数コロニー数数数 アンピシリンなし アンピシリンあり 希釈倍率 プラスミドなし プラスミドあり プラスミドなし プラスミドあり ×10 一面 一面 0 7 ×103 546 716 0 0 ×105 7 7 0 0 1. 1. 1. 1.プラスミドプラスミドプラスミド 1ngプラスミド1ng1ng1ngあたりのあたりのあたりのあたりの形質転換形質転換した形質転換形質転換したしたした細胞数細胞数細胞数の細胞数ののの算出算出算出 算出 今回使用したプラスミド溶液は 10ng である。希釈倍率 10 倍の希釈液中で見つかった形質
10で割ればいいことになる。計算すると
)
(
7
.
0
10
1
7
×
=
個
がプラスミド 1ng あたりの形質転換した細胞数と考えられる。 2. 2. 2. 2.形質転換形質転換形質転換した形質転換したした細胞した細胞細胞細胞のの割合のの割合割合割合のののの算出算出算出算出 希釈倍率 10 倍のときにのみ形質転換した大腸菌が見られるが、希釈倍率 10 倍のアンピシ リンなしの大腸菌数は膨大で計測できなかった。そこで希釈倍率 103倍の大腸菌数を 100 倍した数をアンピシリンなしで増殖した大腸菌数とする。すると、716×100=71600 個がア ンピシリンなし、プラスミドありで培養した大腸菌数となる。よって形質転換した細胞の 割合を算出すると(%)
10
78
.
9
100
71600
7
−3×
=
×
となる。 (e (e (e (e))))考察考察 考察考察 希釈倍率が 103倍の希釈液中では形質転換してアンピシリンを分解するβ-ラクタマーゼと いう酵素をもつ大腸菌コロニーが数個見つかったが、希釈倍率が 103倍、105倍の希釈液中 では形質転換してアンピシリン耐性をもつ大腸菌はまったく発現しなかった。理論値と比 較しても非常に低い値である。これはプラスミド(pBR322)が壊れて、断片化していたため にこのような結果になったと推測できる。 テーマ テーマテーマ テーマ(4)(4)(4)(4)紫外線照射紫外線照射による紫外線照射紫外線照射によるによる殺菌効果による殺菌効果殺菌効果殺菌効果 (a) (a) (a) (a)目的目的 目的目的 大腸菌に紫外線を照射し、コロニーを計数し生存曲線を作成し、そのグラフから半減期を 求め、大腸菌に対する紫外線の影響を調べる。 (b) (b) (b) (b)材料材料 材料材料 大腸菌懸濁液、蛍光灯スタンド (C (C (C (C))))方法方法方法方法 滅菌した試験管(6 本)に希釈用滅菌水を 1.8ml ずつ分注し、そこに大腸菌懸濁液 0.2ml を無 菌的に取り出し加え 10 倍希釈溶液とした。さらに菌体密度が均一になるように攪拌し、10 倍希釈を繰り返し行い 10、102、103、104、105、106倍希釈溶液を作成した。次にそれぞれ の懸濁液から 0.1ml ずつ採取しプレートに撒き、コンラージ棒と回転台を用いて均一に広 げ、原液、103倍希釈のものは 3 枚ずつ、106倍希釈のものは 4 枚用意した。そしてプレートをふたの上にして紫外線滅菌ランプの中央に置き、ランプが点灯したときにプレートの ふたを開け、原液、103倍、106倍の 3 枚のプレートそれぞれに 10、20、30 秒間紫外線を 照射した。また 106倍希釈のプレート 1 枚は紫外線の照射は行わなかった。すべてのプレー トを裏返しにして 37℃に設定したインキュベーターで培養し、翌日、コロニー数を数えて 生存曲線を描いた。 (d (d (d (d))))結果結果結果結果 希釈濃度と紫外線照射時間の違いによる大腸菌コロニー数の変化を表 5 に示す。 表 表表 表 5555: : : : 希釈濃度希釈濃度、希釈濃度希釈濃度、、、紫外線照射時間紫外線照射時間の紫外線照射時間紫外線照射時間のの違の違違違いによるいによる大腸菌いによるいによる大腸菌大腸菌大腸菌コロニーコロニーコロニー数コロニー数数数のののの変化変化変化 変化 コロニー数(個) 紫外線照射時間(秒) 原液 ×103 ×106 0 53 10 一面 1924 1 20 3108 9 0 30 47 1 0 大腸菌数が一桁のサンプルを除き、その計測数に溶液の希釈倍率をかけて希釈しない場合 の生存細胞数を求め、表 6 に示した。 表 表 表 表 6666::::希釈希釈希釈希釈しししないしない場合ないない場合場合場合ののの生存細胞数の生存細胞数生存細胞数 生存細胞数 紫外線照射時間(秒) コロニー数(個) 0 5.3×107 10 1.924×106 20 3.108×103 30 4.7×10
