臨 床 的研 究 動 脈痛形成 機序 関す 実験的な 大

大動脈 痛 形 成機序^に関す^る実 験 的 な^{ら び}に臨床的研究

金 沢大 学 医 学 部 医 学 科 外 科 学 第^一 講座 ( 主任: 渡 辺 洋字 数 授)

原 田 猛

大動 脈 癒は細 胞 外マ ト リ ク^ス成 分^の破 壊に伴 う 動 脈 壁の脆 弱 化^{に よって 生}ず^{る. ウロ}キ ナ ^ー ゼ な どの線 溶 系 因子は 血栓 溶 解^に直接 作 用 す^{る ほ か}, マ トリ クス分解 酵 素 活 性 化^カスケ ^ー ドの初期 因 子^{と し ての}機 能 を 担^い細 胞^の遁 走, 組 織 構 築, 創 傷 治 癒 など にも 深く 関 与 す^{ること が}明ら か に さ れ ている. 本研 究で は動 脈 硬 化 性 大 動 脈 痩 形 成^{に おい}て局 所 線 溶 活性^の果たす 役 割 を検 討 す^る目 的で, 実 験 的^{に ラッ}トに腹 部 大 動 脈 痛 作 成を行^い, また, 手 術 時に採 取さ れ た腹 部 大 動 脈 癖 壁, 閉塞 性 動 脈 硬 化症^の大 動 脈 壁 を 用^いて免 疫 組織 染 色, ザ イモグ ラフ イ ^ー _, 酵 素 産 生 量^の測私 ^{エ ラスタ ー ゼ}活 性^の測 定 を 行^った^. ラット の実 験に お^いて プ ラスミン

, ウロ キ ナ^ー ゼ型プ ラス ミノ^ー ゲンア ク チ^{ベ ー} タ ^ー (u r ok in a s e^‑t yPe pla s min og^{e n} a ctiv ato r, u^‑P A),

組 織 型^{プ ラス ミ ノ ー ゲン}ア ク チ^{ベ ー} タ ^ー 田s s u e^‑tyPe pla s min og^{e n a c}tiv ato r_,t^‑P A) ^の単 独 投 与^で動 脈 壁^の破 壊^は起こ らず, 拡 張 性 変 化 も きた さ な かっ た(1 4 日後 平均 大動 脈 径1･3 5m m)･ これ ら に チ オ グ リコ レ^ー ト処 置 を 加 える と プ ラス ミン追 加 群 (^{1 4 日} 後 平 均 大 動脈 径^{3･3 Am m}), また はu^‑P A 追 加 群 (^{1 4 日}後 平 均 大 動 脈 径^{2.5 2m m}) で は癌 化が起^こり, t^‑P A 追 加 群^{で は}動 脈 壁^に変 化は認め な かっ た^■ 痛 化し た動 脈 組 織は中 膜 弾性 線 維^の断 裂 及び罪 薄 化^が認^{め ら れ た･ ゼ ラ チン}ザ イ^モグ ラフ イ ^ー の結 果, 癌 化し た組 織に は 9 2k Da･ 7 2k Da, 6 6 k D a, 6 0 k Da の部 位に ゼ ラ チ^ン分 解 活 性 を 認^め, 全ての バ ン ド に お^いて対 照ラッ ト と比 較 し増 幅^を認^{め た･} 9 2 k Daは^マ ト⁷) ク^{ス メ}タ^ロ プ^ロティナ ^ー ゼ(^{m atrix m etallo}pr otein a s e,M M P)^‑9, 7 2 k Da, 6 6 k Da, 6 0 k D aは M M P^‑2 に よ る分 解 活性と考 えら れ た･ ヒト腹 部 大 動 脈腐 組 織^と閉塞 性動 脈 硬 化 性 大 動 脈 組 織^の培 養上清 中^{の エ} ラスタ ^ー ゼ活 性 を測 定^{し た}結 果, 大 動 脈 疇 全 体と閉 塞 性 動 脈 硬 化 性 病 変^{と で はエ ラスタ ー ゼ}活 性^に有 意 差 を 認^めなかった が, 痛 径 を6c m

で 2 群に分 ける と痛 径6c m 未 満 群に おいて内, 中, 外 膜^の全ての層^が閉 塞性 動 脈 硬 化性 病 変に対し て有 意に^エ ラスタ ^ー ゼ活 性が高 く 認め ら れ た･ 癖 径^{6c m} 未 満 詳^は痛 径6c m 以上の群に対し ても 有 意に^エ ラスタ ^ー ゼ活 性が高 く 認^{め ら れ た.} 中膜 培 養 上帝 中^のu^‑P A, t^･P A, プ ラスミノゲンア ク チ^ベタ ^ー イ^{ン ヒ}ビ タ ^ー b^{la s min o}g^{e n a c}tiv at_{o r}inhibito r,PJu) ^‑1 の量の検 討で は, ｡^一

弘量は癖 径6c m 未満^の大 動 脈 痛 中 膜 組 織 群 (平 均2 2 0･5咽/g) で閉 塞 性動 脈 硬 化 病 変 群 ( 平 均^{1 8 7.}7 咽/g) ^に比^べて有意^に高値 を 示^{し た} 肝^{< 0･}0 5)^▲ また, u^‑P A 量は痛 径での比 較でも 痛 径6c m 末 浦 群が疇 径^{6c m 以 上}群 (平 均^{1 6 0.}3ⁿg/g) に比^べて有 意に高 値 を 示し た(^{P < 0･0 5})^{･ t‑P A}量は大動 脈 痛^で平 均^{3 0 0.8n}g/g^, 閉 塞 性 動 脈 硬 化 病 変^{で は 2 5 2.On}g/gで有 意 差は なく, P A I^‑1量は 大 動 脈 痩^{は 4 2 5 2･3n}g/gで･ 閉塞 性 動 脈 硬 化 病 変^{の2 6 1 4･5n}g/gより 有 意に高 値 を 示し た(^{P < 0.0 1})^. 大 動 脈 癌 壁の t^‑P A , P A I^‑1 量は癖 径との相 関は認め な か^っ た･ 免疫 組 織 染色上, 内膜^{で は}粥状 硬化^の周 辺 部に存 在 する泡 沫細 胞, 紡 維形 細 胞, 類 円形 細 胞^の胞体^{にu‑P A}･ ウロ キ ナ ^ー ゼ型^{プラ スミノ}ゲ^{ン ア}ク チ^ベタ ^ー受 容 体 (r e c ep to rfo r u r okin a s e^‑t y P^e pla s min og^{e n a c}tiv ato r,u^‑

P A呵,トm が多^数の細 胞に強く 染色さ れ て^いた. そ れ に比^べて P 瓜 1の陽 性 細 胞^は少 数であ^った^. 中 膜の紡 錐 形 細 胞にも｡^一玖

u^‑P A R, t^‑P A が多 く 陽 性^であった. P A l^‑1も 中 膜^の紡 錐 形 細 胞に弱 く 陽性^であった^. 以 上の研 究 結 果か ら, 実 験 的に ラッ ト に おいてu^一弘 で癖 作 成^が可 能^であること, 臨床 的に癖 径が小さな^ヒト腹部 大動 脈 癌^の中 膜^{にu‑P A の}増 加が認め ら れ_, か^{つ エ} ラ スタ ^ー ゼ活性が 上昇 して^いる^こと が明ら か に さ れ, u^一拍 が大 動 脈 噛 形 成^{の 一} 因であること が示 唆さ れ た.

鮎_y w rd s ab d o min al a o rtic a n e u ry^{s m} , athe r o s cle r o sis_, pla s min og^{e n a c}tiv ato r_, m atrix m etallopr otein a s e

大動 脈 嗜^は, 大 動 脈 中 膜の エラスナンが断 裂 破 壊さ れ中膜が 非 滞 化^{し 血}圧に て進 展さ れ, 異 常 拡 張^{し た}状 態である^. 大 動 脈 壁 構 造の形 状 維 持 を 担 う^のは主に中膜で, 中 膜^{エ ラスナン}や^コ

ラ ^ー ゲ^ンが動 脈 壁^に弾 性お よ び抗 張 力をもた ら し ている¹⁾²⁾³⁾ こ れ らの線椎^の崩 壊^は大 動脈 壁^の脆 弱 化 を きた し大 動 脈^の拡 張 をもた らすと考 え ら^{れ る が}, そ^の過 程に お^いて細 胞 外^{マ ト リ ク}

ス の主 要構_{成 蛋 白 質}である^エラステンやコ ラ^ー ゲ^ンに作 用 する

マ ト リ クス分 解 酵 素が関 与し てい る と考 え^{ら れ ている. な か で} もマ ト リ クス メタ^ロプロ ティナ ^ー ゼ(m atrix m etallopr otein a s e,

M M P) と呼ば れ る ^一 群^の酵 素 群は 生体 内^のほ と ん ど全て^の細 胞 外マ ト リ ク^ス成 分 を 中性 域^で分 解 す^る. 特^に大 動 脈 癖 発^{生 で は}

マクロ フ ァ ^ー ジ か ら産 生さ れ る ゼ ラ チ ナ ^ー ゼ B (M M P^‑9) が^エ ラスナンそ^の他^の細 胞 外マトリ クス成 分 を 分 解 す^{ること に よ}り 墳 形 成^に関 与し た役 割 を 果た し て^いる と報 告さ れ て^いる^射.

平^{成1 1} 年⁸ 月^{1 1} 日受付, 平 成1 1 年¹⁰月¹ 日受理

A bbr e viatio n s : E V G, ela stic a v an Gie s o n;M M P, m atrix m etallop^{r o}tein a s e; N E M

, N ^‑eth _ylm aleimide; O P D, O rtho^‑ Phe nyle n edia min e;P A J, pla s min og^{e n a c}tiv ato r inhibito r;P E T, P B S^‑E D T A 昔w e e n2 0;P M S F ,Phe nd ^{m eth a n e s ulfo n}yl

大 動 脈 痛 形成 機 序に関 する検討

M M P 群は そ れぞれ異なった基 質 特 異 性 を持 ち, 種^{々 の}細胞で

滞 在 型 酵 素^{と し て}分 泌さ れ細 胞 外^で活 性 化さ れ る. 滞 在 型 M M P ^の活 性 化に は プ ラスミンが最 初の引 金^{と し て}作 用し て^い る と考^{えら れ ている5)6).} プ ラ^スミ ^ンは問 質^{コ ラ ゲ ナ ー ゼ} (^{M M P‑1}), スト^ロムラ イ シン(^{M M P‑3})お よ び M M P^q9を 活性 化 す^{ること が で}きる が, プ ラスミン のM M P^‑1 や M M P^‑9 に対 する 直 接 的な活 性 化 能は弱 く, 最 終 的 な 活 性 化に は M M P^̲3 が主に 作 用^{し プ ラス ミ ン}( また は ト リ プ シン) ^→ M M P^‑3 ^→ M M P (M M P^‑1

,M M P^‑9) と^いう 滞 在 型 酵 素^の活性 化カスケ ^ー ドが最 近 で は考 えら れ ている^.

細胞 外^{マ ト リ クス}分 解 酵 素^の 1 ^つである ウ^ロ キ ナ^ー ゼ型プ ラ スミ^{ノ ー} ゲン アク チ^{ベ ー} タ ^ー (^{u r okin a s e‑}t y p^e pla s min oge n a ctiv ato r, u^‑P A)^{は プ ラスミノ ー ゲン}を 限 定 分 解し, 酵 素 的に活 性な プ ラ^スミ^{ン へ}と変 換 す為^. ひP A は活 性 部 位に セ リ ^ン残 基 を もつ こと よりセ リ^ンプ^ロティナ^ー ゼ と し て分類さ れ る^. u^‑P A に より 活 性 化さ れ た プ ラ^ス ミ^ンはフ ィプ リ^ン, Ⅳ型お よ び Ⅴ型

コラ ^ー ゲンなどを 基 質とする ほ か, プ ラ^スミノ ^ー ゲン, P A,

M M P などの潜 在 型 酵 素 を 活 性 化 する^. u^‑P A の他, P A に は租 織 塑プ ラ^ス ミノ^ー ゲンア ク チ^{ベ ー} タ ^ー 担^{s s u e‑}t y p^e pla s min og^{e n}

a ctiv ato r,t^‑P A)^が存 在^し, それ ぞ れ は構 造 的にも 機 能 的^にも 異 な^る.

u^‑P A を 含め た線 潜 活 性は 血栓 溶 解^に直 接 作 用 する ほ か_, マ

トリ クス分 解 酵 素 活性 化^カスケ ^ー ドの初 期 因 子と し て機 能 する た め細 胞^の遊 走⁷⁾⁸⁾, 組 織構 築, 創 傷 治 癒^{9 )}, 排 卵^や着 床 現 象^な ど にも 深 く 関 与 す^ること が明ら 射^こさ れ た^川. また, 膿 瘍 細 胞

の悪 性 化^に伴 う 線 溶 活 性^の克 進は古 くか ら注目 さ れ, 浸 潤 性 増 殖に おける組 織 破 壊^と密 接 な 関 連^があ^ること が示 唆さ れてき た. 現 在で は P A を多^くの癌 細 胞が分 泌し ていること が証 明さ れ ている^{1 1).} し か し大 動 脈 痛と線 溶 系 因子^の関係 を 論じ た研 究 は少なく^{1 2)1 3)1 4)}, 仮 説^の域 を 出な^い. 本 研 究で は特に弾 牲線 椎

の破 壊^に関わ る細 胞 外マ ト リッ ク^ス分 解 酵 素と してu^‑P A に焦 点 を 当て, 組 織 破 壊に おけ^る線 溶 糸 田子^の役 割に^ついて検 討し

た.

材 料^{お よ び}方 法 l∴ 大 動 脈 癌 形 成の実 験 的検 討 1 . 実 験 動 物

生 後^{1 0}週 齢,体 重3 0 0 ^､ 3 2 0g のウ イ^ス タ ^ー系 雄ラッ ト を実 験 に用^いた.

2 . 実 験 方 法

An idj^{a r ら1 5)1 6)の}方 法に従^い, 6 % ベ ントパ ルビ タ ^ー ルナ ト^･) ウム ( 投 与 量0^.1ⅠⅥ1/1 0 0mg体 重) を腹 腔 内 投 与し麻 酔し た後,

手術 台^に仰 臥 位^で固 定し腹 部正中 切 開^{に て}開 腹^{し た.} 手 術 用 顕 微鏡 使 用下 に腹 部 大 動 脈を 下大 静 脈より 剥 離^し, 分 枝である腰 動脈お よ び 下腸 間 膜 動 脈を腹 部 大 動脈 左 腎 静 脈横 走 部より 罵 倒

へ絶 勝 骨 動 脈 分 岐 部 ま^で結 紫し た^. 次に左 鼠 径 部 を 縦 切 開^し,

ポ リエチ レンカ テ ^ー テルを左 大腿動脈より 腎動 脈下腹 部 大 動 脈 に留 置し た( 図¹)^. 腹 部 大動 脈^を左 腎 静 脈下 で微 小^血管 紺 子 を かけ, さら に^ここ より1 c m 尾側に絹 糸 を二重に通し て遮 断し た･ カ テ ^ー テルを通じu^‑P A (^{6 0 0 I U}/^ml) (^Sigm a,St.I,O uis,U S A),

t^‑P A (^{5 0},0 0 0 I U/^ml) (Sig^{m a}), プ ラ^スミ^ン(1 I U/ml) (Sigm a),

5 5 5

マ クロ ファ ^ー ジ活 性 化 物 質^である チ オ グ リコ レ ^ー ト(1皿g/ml) (^Sigm a) 又 は生理食 塩 水を 1 0 0m m Hg圧 に て l 時 間浸 透さ せ た.

魔 流 終 了後大 動 脈 遮 断を解 除, カ テ ^ー テ^ルを抜 蓋^し, 左 大腿 動 脈^を結 致^し創 を 縫 合 閉 鎖し た^. 普 通 飼 料 自 由水^{に て}飼 育し, 1,

2, 3, 5, 7, 9, 1 1, 14 日後に後 述^の如 く 標 本 を 摘 出^{し た.} 6 % ^{ペ ン}ト^{パ ル}ビ タ ^ー ルナ ト リ ウムを腹 腔 内投 与し麻 酔 を 行^い,

前 回 手 術創^より 切 開 開 腹^{し た.} 大 動 脈 を 遊 離し腎動 脈下腹部 大 動 脈での最 大 横 径を自 然 拍 動^{下 に て}測 定^{し た.} 嶺 径 測 定 後,

6 % ペ ントバ ル ビ タ^ー ルナ ト リ ウ^ムを 急 速に静 注し深 麻 酔に て 屠 私 腎 動脈下腹 部 大動 脈より 総腸 骨 動 脈 分 岐 部 ま^で摘 出^{し た.} 摘 出し た大 動 脈 片^は縦 切 開 し^二分 割 した^{. 一} 方を観 織 標本^に,

他 方 をザ イ^モ グ ラフ イ ^一 に供し た^. 3 . 実 験 群の設定

ラッ ト は生 理 食塩 水 群, ひP A 群, トP A 群, プラスミン群, チ オ グ リ^コ レ^ー ト群, u^‑P A加チ オ グ リコ レ^ー ト群, トP A 加チ オ グ リコ レ ^ー ト群, プ ラスミン加チ オ グ リ^コ レ^ー ト 群の8群に分 け た^. ま ず大 動 脈 癖^の形 成^の有 無を調^べる た め に各々5匹を手 術 後1 4 日日に て犠 牲^{死 さ せ た.} 次^いで痛 形 成 をみ た群に お^いて 径 時 的 変 化をみ る た め に 1, 3, 5, 7, 9, 1 1 日目に各^々2匹を 犠牲死 さ せ た. また, コントロ ^ー ルと し て生 理 食塩 水 群^{で 1},3,

7 日 に, チ オ グ リコ レ^ー ト群^で1, 3, 5, 7, 9, 1 1 日 に各^々2 匹を 犠 牲^{死 さ せ}径 時 的 変化を み た.

4 . 組織 標 本^の作 成

上述し た方 法^で得ら れ た ラッ ト腹 部 大 動 脈 標 本を直 ちに 1 0 % 中 性 権衡ホ^{ル マ}リ^ン液^に投^{入 し 6 〜2 4} 時 間 固定 後, パラ^フ ィ ン包 捜し た^{. パ}ラフ ィ ン切 片は H E 染 色お よ び^エラスチ カ ^･ ワ ンギ^ー ソ ン(ela stic a v a n G ie s o n,E V G) 染 色^を行^い, 光 学顕 微 鏡 的^に観察^{し た.}

5^. ラッ ト腹 部 大 動 脈 組 織 内^{ゼ ラ チン}, α^tエラ^スナ^ン分 解

パタ ^ー ン の検 討

ラット^の初 回 開 腹3, 5, 7, 1 1, 1 4 日後 及び無処 置^のラッ ト 腹 部 大動 脈切片を Pol_{y t}r o n (^{Ki n e m atic a},Switz e rla nd) ^を剛^一て 0･1 M リン酸 緩 衝 液 中に懸 濁し, 採 取 後, 1 0,0 0 0rpm , 5分 間 遠 心し て その

【^l二清を‑ ^{8 0 ℃ で}保 存し た. 口ib bsら^{1 7)の}方 法に従^い,

ゼラチ^ン(^2m g/^ml) ^を含^{む ポ リア}ク リル アミ ド ゲル(8 % ア ク リ ル アミ ド) を 作 成し, 上述し た培 養̲̲^{L酒を非 還 元状 態, 4 ℃ で} 電 気 泳 動し た. 培 養上宿^の量は培 養^の際^に用^いた組 織^の乾 燥 電 量^が一川^一定と な る よ う に調 整し た^. ゲ^ルを洗 浄 周 緩 衝 酒 (^{50m M} Tris^‑H C l, 1m M ZnC 12_, 2.5 % ト リ ト^ンⅩ, 0.0 2 % NaN3, pH 7.5)

で洗 浄し た後, n ^･is^‑NaC l^qCa 汀N C) 緩 衝 液 (^{50m MoI Tris‑H Cl},

0^.1 5 M N aC l, 1 0m M C aC 12, 2^.5 % ト リ ト^ンⅩ, 0.0 2 % NaNこ〜,

pH 7.5) 中^{に 37}℃で17時 間 反 応^{さ せ た. ゲルは クマ シ ー} プ リ リ アント ブ^{ル ー} で染 色し た後脱 色し ゼ ラ チン分解^パタ ^ー ンを 検討 し た^. 分子 量標 準マ ^ー カ ^ー と し て, ホスホ リ ラ ^ー ゼ b (^{94k Da}) (^{S i}gm a), ヒト ト ラン ス フェリン(77 k Da) (S igm a), ウ シ 血清^ア

ルブ ミン(6 8 k Da) (^Sig^{m a}), ヒト免 疫グロ ブ リ^ン重 鎖 (^{5 5 k Da}) (^{S i}gm a), 卵 白^{ア ルブ ミン}(^{4 3 k Da}) (^Sigm a)^{, カル}ポ^ニ ックア ン ヒド ラ^ー ゼ(2 9 k Da) (Sigm a), を用^いて そ れぞれ^の消 化^{バ ン}ド

の蛋白 分 子 量 を 算 定^{し た.} 同様^{にα‑エラスチン}(^1.2m g/^ml) を 含む ポ リ ア ク リル ア ミ ド ゲ^ル (8 % ア ク リルア ミ ド) を作 成し て, 培 養 上 帝^の電 気泳動 を 行^い α^‑エ ラステ^ン分 解 活 性^の検 討

f

l_{u o r}ide; ¶ M P_,ti s s u einh ibito r of m etal lop^{r o}tein a s e s; t^‑P A,tis s u e^‑t yP^e Pl^{a s m}in og^{e n a c}tiv ato r; ^u‑P A, u r Okin a s e^‑ty P^e pla s min og^{e n a c}ti_{v at}o r;^u‑P A R,r e C ep t^{O r}fo r u r okin a s e^‑typ^epla s min og^{e n a c}tiv ato r