プロテアソームの活性化因子
PA28
ファミリーの分子的性質と
γ
－イン
ターフエロンによる調節機構
棚 橋 伸 行
徳島大学酵素科学研究センター・酵素病理部門（主任：福井 清教授〉 （平成8 年 11 月5 日受付）2M
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〔Di γotce γ：Pγf Ko ihsyoi i)ukuF
SUMMARY
The
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( r e c e i v e d November ,52 1996)Key words : Proteasome, P A28, ,nroferetni-y antigen ng,essicorp Ki antigen プロテアソームは沈降係数 20S の巨大な多成分複 合 体 と し て 発 見 さ れ た 細 胞 内 プ ロ テ ア ー ゼ で あ る ( R i v e t t , 1399 ; Coux ら， 6991 ）.本酵素は真核生物に のみに広く存在すると言われていたが，最近古細胞や 真 性 細 胞 に も 存 在 す る こ と が 明 ら か に な っ た (Tamura ら， 5991 ）.真核生物のプロテアソームは α リングとβリング（各々 7 個の相向性の高い蛋白質か ら構成されている）がαββα の順に会合した分子量約 7 0 万のシリンダー型粒子である（Lupas ら，.)3991 プロテアソームは細胞周期，遺伝子の転写そして代 謝調節などの様々な生体反応を制御する調節蛋白質の 代 謝 的 安 定 性 の 決 定 に 関 与 し て い る ほ か に -eiC( c h a n o v e r , 4991 ,r; Hesasrtshco 5991 ），このような本 来の短寿命蛋白質の異化作用に関与するのみならず， 様々なストレスや遺伝的変異によって生じる異常蛋白 質の選択的な分解をも触媒すると考えられる ,tliH( W o l f , 5991 ）.また，プロテアソームは MHC rmajo( h i s t o c o m p a t i b i l i t y complex ： 主 要 組 織 適 合 性 複 合 体〉クラス
I
分子に提示される内在性抗原ペプチドの 生 成 に も 関 与 す る こ と が 最 近 明 ら か に な っ た ( M o n a c o , ,dianN ;5991 ,slemeeH ,hgoelP ;5991 Y o r k , k,Roc .)6991 プロテアソームは細胞内蛋白質の約1-3% を占め， 主に細胞質や核に局在するが通常は不活性型として存 在し，これまでの研究から特異的な複数の調節蛋白質 によって活性化されることが判明している．そのよう な 調 節 蛋 白 質 の 1つ で あ るPA700/19S 複 合 体 ( D e M a r t i n o , ,rethgualS 3991 ）はプロテアソームとエ ネルギー依存的に会合し，分子量約002 万の巨大な ATP 依存性プロテアーゼ（26S プロテアソームと命 名）を形成すると考えられている（Yoshimura ら， 1 9 9 3 ,s; Prete .)4991 .giF 1 （下部のパネル〉に示すよ うに6S2 プロテアソームは触媒機能を有するシリンダ ー型の 20S プロテアソームの両端に分子量25-112 kDa の複数のサプユニットから構成されたV字型の PA700 が会合したダンベル型粒子である（Lupas ら， 1 9 9 3 ,s; Prete .)4991 26S プロテアソームによる蛋白 質 の 分 解 はATP 依 存 的 な メ カ ニ ズ ム で 起 こ り ( R e c h s t e i n e r ら，3991 ），その標的蛋白質はポリユビキ チン化されることによって分解シグナルを獲得する (Hko,rshe ,revoancheiC 2;991 ,ressartshcoH 9591 ). しかし，ポリアミン生合成の代謝律速酵素で短寿命の オルニチン脱炭酸酵素（ODC ）は意外にもユピキチン 非依存的に 6S2 プロテアソームによって分解される (Mural 王ami ら， 2991 ）.一方，最近不活性型の 20S プ ロテアソーム（本論文では以後，単にプロエアソーム と記載し， 26S プロテアソームと区別して記述する必 要がある場合のみS20 プロテアソームと記載する〉を 活性化する新たな因子の存在が判明している．この分 子はサプユニットの分子量が8 kDa2 であることから p r o t e a s o m e rotavitca 82 (P A28 ）と名付けられた (Ma ら， 2991 ）が，天然、型分子は比較的大きな複合体 を形成し S11 レ ギ ュ レ ー タ ー と も 呼 ば れ て い る ( D u b i e l ら，.)2991 .giF 1 C上部のパネル〉に示すよ うにPA28 はATP 非依存的にプロテアソームに会合 し，フットボール型粒子を形成する（Gray ら，.)4991 PA28 はプロテアソームのベプチダーゼ活性を非常に 強く促進するが，変性蛋白質やュピキチン化の有無に かかわらず未変性の天然蛋白質には全く作用しない(Ma ら， 2991 : Coux ら， 6991 ）.最初に PA28 が精 製されたとき，単一成分の複合体として存在すると考 えられていたが（Ma ら， 2991 ），蛋白化学的解析から 相向性の高い二成分から構成されていることが判明し た（eliubD ら， 2991 ; Mott ら， 4991 ）.最近，我々は これらの PA28 をコードする二種の cDNA をクロー ニングし一次構造を決定した結果，それらが約50% の 高 い 相 同 性 を 持 つ こ と が 判 明 し た の で ， 各 々 を P A 2 8 α およびβPA28 と名付けた（Ahn ら，.)5991 さらにホモロジー検索の結果，驚いたことにPA28 と 約40% の相向性を持つ分子， Ki 抗原の存在が判明し た（Ahn ら，.)5991 Ki 抗原は自己免疫疾患として知 られている全身性エリテマトーデスの自己抗体に反応 する抗原として同定された分子である（Nikaido ら， 1 9 9 0 ）.そこで，本研究ではプロテアソームと Ki 抗原 の関係を解析し， Ki 抗原が28αPA および8βPA2 と 同じ方法で精製されること，さらにn viorti でプロテ アソームと会合することを明らかにした．この結果， Ki 抗原が新しい PA28 ファミリーの一つであること が強く示唆されたので、Ki 抗原をγPA28 と再命名し た． 他方， αPA28 とA28βP をコードするmRNA が免 疫インターフエロンとも呼ばれているfretnl-y oner
（γ－IFN ）の処理に よって強く誘導されることが判明 プチドの生成に必須な役割を担っていることが判明し
した（Honore ら， 3919 ; Riinlae ら， 4;991 Ahn ら， た（Dick ら， 6991 ）.γ －IFN はMHC ク ラ スI拘束性
1 9 9 5 ）.そして PA28 αを細胞内に強制的に高発現させ の抗原プロセシングに重要であり，実際プロテアソー ると特異的な細胞障害性
T
細胞が誘導されること，即 ムを構成する 三種のサプユニットの発現を特異的に誘 ちPA28α が内在性抗原のプロセシング反応を促進す 導することが判明している（Monaco, ,idnaN .)5991 ることが示唆された（ttrupGroe ら， 9619 ）.さらにご 一方我々はこれらの γ－IFN で誘導されるサブユニツ く最近， PA28 がMHC ク ラ ス I分子に提示されるべ トLMP2, LMP7, MECLl と高い相同性を有し，そのP A28-20S
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Proteasome
F i g. 1 Averaged image , sedba on enortcle ,shpraogrcim tfo eh PA288 )S11( -rotavitca
2 0
S proteasome complex (Upper )leanp and fo eht S26 aemosetorp erowCl
p a n e l
) from tar.revil The α－ and βs－gnir tfo eh 0S2 smoeeatorp era.detacidni
P h o t o g r a p h s were entak by cniotarballo thiw W. Bisteraume .
発現が逆に抑制されるサブユニットX, Y, Z を同定 しそれらの分子クローニングに成功した（Akiyama ら，5991 ; Hisamatsu ら，6919 ）.さらに我々はこれら の三種のベアサフ守ユニットは γ－IFN 依存的に分子内 置換することを示唆し，このγ－IFN で誘導されたプロ テアソームが内在性抗原のプロセシング酵素として作 用することを示唆した．そしてこのγ－IFN 誘導型プロ テアソームが免疫応答に特異的に作用することを強調 するために“免疫プロテアソーム”と命名した（Tana-ka ら， 7991 ）.本研究では γ－IFN 遺伝子を組み込ん だトランスジェニックマウスを用いて PA28 ファミリ ー蛋白質と γ－IFN の関係についても解析した． 実験材料と方法 1 . 実験材料
Suc-LLVY 』1CA: laV-ueL-ueL-lyniccuS ・Tyr-4 ・
methylcoumaryl-7-amide ; Boc-LRR-MCA: -t
butyloxycabon yトL eu-Arg-Arg-4 ・
methyl-courmaryl-7-amide ; Cbz-LLE －βNA
c a r b o b e n z o x y -L e u -L e u -G l u －β－ledimahythpan （ペプ チド研究所） ; ATP （オリエンタル酵母） ; immobilon PVDF 膜（M)eropilli ; BleGo-i 1.5A- m, Hydrox-y l a p a t i t e , dneitaesrP SDS-PAGE dardsStan Maker
くlow Range> (BIO RAD ）；ダイアフローメンブレ
ンくPM-30) (Amicon) ; Block-Ace （大日本製薬〉， Q -S e p h a r o s e oseeSpharain-preH B,L4-C An-teiroP -S e p h a r o s e ,4FF Resource-Q ，低分子量マーカー蛋白 質（Pharmacia) ; ECL ウエスタンブロックティング 検出システム； Hybond-N+ (Amersham); -itlum p r i m e DNA gnillebal tik (TAKARA ）；マルチゲル 10-20 % SDS-PAGE C第1 化学） ; NTB : Notri elub
tetrazolium ; BCIP : 5・B romo-Chloro ・3・
indolylphosphaste (Promega) ; pET16b
(Novagen ；） γ－IFN 遺伝子を肝特異的な血清アミロ イドP成分のプロモーターを用いて肝細胞で発現させ るようにしたトランスジェニックマウスは熊本大学の 豊長哲至先生（熊本大学代謝内科教室〉より供与され た． 2 . 合成蛍光基質を用いたベプチターゼ活性の測定 法 2 . .1 プロテアソームの活性測定 Suc-LLVY-MCA などの蛍光ペプチドを基質とし て 遊 離 し た MCA を 蛍 光 光 度 計 で 測 定 し た (Kanayama ら，2991 ）.不活性型プロテアソームの試 験管内での活性化は5.00 % SDS を添加して行った． 全量100μ1 の反応系に酵素と基質を加え7 ℃13 0 分イ ンキュベト後， 01 % SDS を001 μI加えて反応を停止 させ，さらに1.0 M TICH-sir (pH 0.9 ）を2ml 加え てから蛍光強度（励起波長380nm ，蛍光波長046 nm) を測定した．プロテアソ一ム活性の1 単位を l 分間に 1 nmol のSuc-LLVY 2 . .2 PA28 の活性測定 PA28 標品を不活性型プロテアソーム（05. μg）と 共に001 m M Tsir -HCI (pH 0.8 ）緩衝液の溶液で4 ℃， 1 5 分プレインキュベーとした後， 01. m M Suc-LLVY-MCA を加えプロテアソームの活性を. 1 で、述べたよ2 うに測定した.PA28 活性の1 単性を 0.5μg の20S プ ロテアソームを1 分間に 1 nmol のSuc-LLVY-MCA を分解する量と定義する． 3 . 不活性20S プロテアソームの精製 不活性型20S プロテアソームは,esorahpeS-Q -oiB G e l .5-1A m, ,etitpalaxyordyH e-SepharosepHrina CL-4B 等の各種クロマトグラフィーを用いて単ーま で精製し実験に用いた（Tanaka ら，.)6891 4 . PA28 の精製方法 雄ウイスター系ラットの肝臓に3 倍重量の lOmM 2－メルカプトエタノーノレ， 1 m M P-esulahntnylmeeh f o n y l ediroulf (PMSF), μg/ml 02 ,46E 5.20 M ショ 糖を含む5 m M T2 is-HCIr (pH 5）緩衝液を加え，.7 P o t t e r -E l v e h j e m 型ホモジナイザーでホモジナイズ後， 8 , 0 0 0 ,gx 0 分遠心し，さらにその上精を 73 0500, ,gx 6 0 分遠心した．得られた上精分画を組抽出液として使 用した．粗抽出液を5 m M T2 CIs-Hir (pH 5.7,) 01 m M 2 メルカプトエタノール， 20 %グリセロール ( s t a n d a r d bu 妊r ）で平衡した Qe -Sepharose と混和し た後，カラムにつめ， rdandast bu 百r で洗浄した．吸e 着した蛋白質を.800- M NaCl の直線勾配で溶出し， 得られた各分画のプロテアソームと PA28 の活性を測 定した. 20S プロテアソームと26S プロテアソームは 0 .
4 M NaCl 近辺の分画に， PA28 は30. M NaCl の
分画に溶出された. PA28 が溶出された分画を集めて s t a n d a r d reffub で透析した後， drandats ffub r で平e 衡化したesopraheS-nHirape CL-4B にかけた. PA28 は非吸着分画に回収されたので，その分画をlOmM p o t a s s i u m htaepsohp (pH 8.6,) m M 2－メルカプ01 トエタノール， 0 %グリセローノレにて平衡化した2 H y d r o x y l a p a t i t e に か け ， 洗 浄 後01 030 m M の p h o s p h a t e bu 百r (pH e 86. ）の濃度勾配で溶出させた． PA28 は5 m M p7 hosphate 近辺に溶出されたのでそ の分画を回収しアミコン PM-30 膜を用いた限外漉過
で2 mg/ml まで濃縮した．次にプロテアソームと PA28 の複合体を形成させるために，この試料C 1 mg ) と精製したプロテアソーム （50. mg ）を 4 ℃で 30 分 インキュベートし， 10-30 %のグリセロール密度勾配 溶液（約30ml) に上層してから，,ihctaiH SRP28SA1 にて00081, ,gx 2 時間， 4 ℃で遠心した後遠，心チュー2 ブの下から 1 ml 毎に分画した．プロテアソームと PA28 の複合体は分画番号14-18 範囲に回収された． この複合体からPA28 を解離させるために，陰イオン 交換体である Resource-Q に結させ，吸着した蛋白質 を0 -.80 M NaCl で溶出させた．溶出されたPA28 の 分画を最終標品としてdtandars bu 百r で透析した後，e 実験に用いた． 5 . 免疫学的解析 PA28α （22CTKENLLGSYFDKKl37)' p A8β2 （3 KPCGVRLSGEARKQVE18), PA28γ(71CLLTNSH DGLDGPTYK85 ）のペプチドを合成し，ヘモシアニン に結合させてから，ウサギに免疫し抗ペプチド抗体を 作製した（大海ら，.)4991 SDS-PAGE は市販の 10-20% ポリアクリルアミド・グラジエント・ゲルを用い て， Laemmli の方法（1079 ）に従って行った．イムノ プロ ッ ト分析はTowbin らの方法（1799 ）で、行った． 電気泳動後，ウエット式のゲ／レメンプラン転写装置を 用いて immobilon PVDF 膜へトランスファーした． その膜をcelock-aB でプロッキングし各々の一次抗 体で反応させた後，二次抗体として enialkla -osph p h a t a s e が結合したウサギ IgG 抗体もしくは-esorh r a d i s h aseoxidper が結合したウサギlgG 抗体で処理 した後， NTB とBCIP を基質とし発色するか， ECL を用いた化学発光で検出した． 免疫沈澱法はSong らく1699 ）の方法をもとに行っ た．抗PA28α ，β，γ抗体と PesoreahpAS--nietor 4FF を4℃1時間反応させ，低速遠心で回収したゲルを 0 . 1 %の Tween 0 を含む TBS2 C washing ffub r ）でe 4 - 5 回洗浄した．その後，精製した PA28 C 5 μg）と 2 0 0 μ BSA l 25.(0 mg/ml) をその抗体結合ゲルと1 時間4℃で混和させた後，遠心で上精を除いた沈澱物 をwashing bu 百r で 4-5e 回洗浄した.SDS-PAGE 用 のsample bu 百r を加えて be gnilio した後の上精をイ ム ノ プ ロ ッ ト 分 析 に 用 い た ． 対 照 と し て は -erp immune lgG を用いて同様に行った． 6 . リコンビナント PA28 の調製と不溶化PA28 の 再生
PA28α ，β，γの全長鎖 cDNA を各々Nco I とBam
H I
, Xba I とXho ,I Nco I とBamHI 部位でカット
してインサートを切り出してから T7 -raseymepol dopendent orctve pET16b にライゲーションし， BL21 (DE3 ）のコンピテントセルにトランスフォーム した．本法ではN 末端に Hgta-is の付加した融合蛋白 質として合成される．その菌を LB プレートに播き 3 7 ℃で培養後，増えてきたコロニーをさらに IPTG の 有無でLB 培地中で 37 ℃で 3 時間培養した．予備実験 から発現させた PA28α ，β，γ はほとんどが不溶性沈 澱となることが判明したの変性状態で、精製した後， ni v i t r o で再生した．すなわち，回収した細胞を6mM I m i d a z o l e , 8M 尿素を含む 25 m M TClris-H (pH 7 .5 ) ( b u f f e r A ）にて破壊し， 30,005 ,gx 1 時間遠心後， その上精をi2N ＋ーアガロースに結合させた. 1 MNaCl を含むrfefub A で洗浄後，吸着した蛋白質を 350mM I m i d a z o l e を含むreffub A にて溶出した．尿素と I m i d a z o l e を除くため， 1.0 m M EDTA (pH ,)0.8 1 m M Dlotierhtoihti (DTT), %グリセローノレを含む02 2 5 m M THCIris- (pH 7 .5 ）で透析した．この方法によ り精製された全蛋白質の約50% が可溶性蛋白質とし て回収された． 7 . ノーザンプロ ッ ト分析 チ オ シ ア ン 酸 グ ア ニ ジ ン 法 に よ り 精 製 し たyolp CA ）十RNA μg をホルムアルデヒドを含むアガロ01 ースで電気泳動をした後， Hybond-N ＋にトランスフ ァーし， p23 で標識したプロープとハイプリダイゼー ションした. PA28α ／β／γ，LMP2, LMP7, MECL-1 な どのヒト 20S プ ロ テ ア ソ ー ム の サ プ ユ エ ッ ト (Akiyama ら， 9591 ; Hisamatsu ら1,)699 EFlα ， β,n－itca 3-lroceylg ・phosphate dehydrogenase (G3PDH) のcDNA の標識はemirpitlum DNA l-eba l i n g tik で行った．ハイフ．ルダイゼション後，メンプ ランを洗浄し， Kodak XAR ・5 fmli を用いて－70 ℃で オートラジオグラフィーにより現像した． 8 . トランスジェニックマウスの作成方法 γ－IFN 遺伝子を肝特異的な血清アミロドP 成分の プロモーターを用いて肝細胞で発現させるようにした トランスジェニツグマウス (SAP －γ－IFN) (C57BL/ 6+DBA/2 ）を実験に用いた（Toyonaga ら，.)4991 対照としてはveatiegn setamerttil C同腹正常マウス） を実験に用いた． 実験に供した7週令のトランスジェニ ックマウスの 血清中γ－IFN の濃度は3533 pg/ml であり，これは約 30-40 U/ml に相当する． 9 . その他の方法 蛋白質の定量
蛋白質濃度は，牛血清アルブミン (BSA ）を標準蛋 白質をして Bradford の方法 （6971 ）によって測定し Tこ． ウサギに免疫して作製した抗体の特異性を調べるため に， リコンビナント蛋白質との反応性をイムノプロ ッ ト法で検討した. Fig . 2. B , C に示すように作製した 結 果 I . 新しいPA28 ファミリーのメンパーとしてのKi 抗原の免疫学的同定 プロテアソームに対する Ki 抗原と 二種の PA28 の 関係を解明するため，各々 三種の蛋白質に対するペプ チド抗体を作製すると同時にこれらをコードする cDNA をpET の発現ベクターに組み込み大腸菌に導 入してリコンビナント蛋白質を調整した （.giF 2A ). 三種の抗体は各々免疫した蛋白質に特異的に反応し， 交差はわずかであった．興味深いことにKi 抗原に対 する抗体は精製したPA28 標品にも強く反応し，その パンドはPA28α ／β より少し分子量が大きい位置で検 出され，これはcDNA 構造から推定した分子量 と一致 した．この結果は精製したPA28 標品中にKi 抗原が 含まれていることを示しており，従って Ki 抗原が第 三のPA28 のメンパーであることが強く示唆された． そこでKi 抗原を PA28γ と再命名した． F i g
. 2 Ensoiserpx fo eht P A28a, P A28βand Ki aengtin ni .Eiloc and immunoblot
a n a l y s i
s . A : The lluf -lhtnge cDNAs rof eht PA28α ，PA28βand Ki angetin were
s u b c l o n e d ni pET-16b dasmipl aemrifn with eht lOX-His agt and dseesxpre sa d e s c r i b e d erndu
“
laetnrmiepxE seruedcorp ’＇. Whole sniteorp (30 μg) Efoilo.c c e l ls dseresxpe eht P A28α(lane ) , 1 P A28β(lane 2) and Ki ngeinta enal( 3)
were ddeloa ni eht 12.5% SDS -PAGE .leg tsirF μg tfo eh Ni 2+ esorhaspe 6B p u r i e
d nietopr tfo eh P A28α(lane 4), P A28β(lane 5) and Ki aenigtn Oane 6)
were ddeoal ni eht .leg B: Immunoblot siylnaa hitw α8A2P-tina
，
8β2A-Pitna and i aK enigtn sediobitna isadetacidn tsnaiga μg o03 f mbinantreco PA 28α ( l a n es 1, 4 and 7), PA28β(lanes 2, 5 and 8) and aKi neigtn enal( ,3 6 and 9). C :
Immunoblot sisylana thiw anti-PA28α(lane ,)1 anti-PA28β(lane 2) and -itna
K i
aengtin enal( 3) asediobitn isadetaicdn stnigaa 5 μg o tf eh PA28 deifirup
from tar revil . The orraws etacidni eht noitisop fo eht larlecumo marker
p r o t e i n .s
次に PA28α ，PA28β ，PA28γ の動態をクロマトグ ため，各分画と不活性型プロテアソームとを4℃でプ ラフィーで検討した．組抽出液をQ-Sepharase に吸着 レインキュベートした後基質を加えベプチターゼ活性 させ蛋白質を0-0.8 M NaCl にて溶出させて得た各分 を測定した．プロテアソームを活性化するPA28 の分 画のプロテアソーム活性を Sue-LL VY-MCA を基質 画は約3.0 M NaCl に単一 ピークとして検出された として測定した．以前に報告したように （Kanayama (F.gi 3）.この Q-Sepharose クロマトグラフィーにお
ら， 2919 ), 20S プロテアソームと 26S プロテアソー ける PA28α ，PA28β ，PA28γ の蛋白質の動態を検討
ム （これらは5.00 % SDS の有無で検出可能〉は等電 するため各々の特異抗体を用いてイムノブロ ッと分析 点が.05 と類似しているためともに0.45M NaCl の を行った..giF 3 C上パネル〉に示すように， PA28α お 塩濃度で溶出された（.giF 3）.次に PA28 を検出する よびPA28β はベプチダーゼ活性に一致した分画に回 7 . 5
書
意
=
"
1 2
i t!
.
F i g . 3 Qrose-Sepha chromatography fo tar revil .stcartxe The deruc tacrtxe fo tar l i v er was dedoal ot a QseSepharo- ,nmuocl and eht derbosda sliarteam were
e l u t e d hitw O 0.8M NaCl ni eht 25mM IHCs-Tir (pH7.5 ,) lOmM 2・ m e r c a p t o e t h a n o
l and 20% .lorecylg Lower slenap Suc-LLVY -MCA hsisylrody
o f
teh S20 and 26S ssemoeatrpo was ydesasa hwit （・） wro thouit
CO )
0.05 %SDS, ylevitecpser . The PA28 ytivitca was edsyasa by mignsruae Suc -LLVY
-MCA hsislyoryd , dsadebricse Enilaetnmirepx resduoecpr .(.& , shaded .)niteoPr
（一）were .uredeasm Upper :selnap Immunoblot lanaa yssi thiw α82A-Pitna ，
anti-PA28βand 28γ-PAnti.sdaieobitna Numbers ta eht bottom fo eht pperu
p a n e l s ndspoorrec otnoitcarf numbers ni eht rlowe .lenap
収された．興味深いことにPA28γ もPA28α および mental seurodecrp の 項 で 述 べ た よ う に 精 製 し た P A 2 8 β の溶出分画に回収されたが，その免疫学的反応 PA28 を不活性型プロテアソームの有無でプレインキ 性はPA28α およびPA28β と比較すると非常に弱い ュベートした後，グリセロール密度勾配遠心法で分画
ことが分かった．この結果は用いた三種の抗体の力価 しSue-LL VY-MCA の分解活性を測定した. Fig.4A
がほぼ閉じ程度であることを考えると（F.gi 2），ラッ に示すように， PA28 は分画番号3025- に回収された． ト肝臓の可溶性分画に含まれる PA28γ の量が少ない 一方，プロテアソームと結合したPA28 は8-115 の分 ことを示唆している． 画に回収された（F.gi 48 ）.この PA28 －プロテアソー 最近， PA28α とPA28β が プ ロ テ ア ソ ー ム と 仇 ム複合体の沈降する速度は精製したプロテアソームが ばかo で会合することが報告されているので（Song ら， 単独で沈降する速度（分画0 前後〉より早いことが分2 1 9 9 6
; Kuehn, Dahlmann, 6991 ,) PA28γ もプロテア かった（未発表〉．また各分画に精製したプロテアソー
ソームに会合するか否かについて検討した. i-perEx ムを加えて Sue-LL VY-MCA の分解活性を測定する a b 27 A 40 1ト 』 l i f J 1 却 〜 愉 抑 制 四
（ 一
翼 連
g
） h w芸
若
気
認
F i g . 4 Aontiiaocss tfo eh αPA28 ，PA28βand PA28γwith eht 20S tnetal ,omeeasotpr l e a d i ng ot eht tciamard .noitavitca A: Samples mg) 1( fo eht PA28 were
a n a l y z e d lorecylg tneidagr-ytisned .noitagufirtnec B: Samples 1( mg) fo eht
PA28 were dteubacnierp hitw eht deifirup 0S2 aemosetorp 0 . ( 5 mg) rof min 03
a
t 4 ℃ and enht were edlyzana fsa ro .A nsiotacFr 1 ml were fo detcelloc from
t h
e bottom tfo eh egufirtnec esbtu . Sample tfo eh snoitcarf were dyeaass rof
Suc-LL VY-MCA siyslorydh tnieh ncebsea
)
O
C
proceenesrC
企） tfo eh deirrfup r a t me.sotearop ,a :b oblotImun sisylana were peformedr gnsiu editpep-itna a n t i b o d i e s tnsiaag P Aα82，
PA28βand PA28γ. nietorP ni 051 μ elcha noitcafrwere detatipicerp hwit etoncea and dtecjebus ot immunoblot .sisylana
Num-b e r
s tta eh bottom tfo eh erupp ,slenap a and ,bondesprroc fotnoitcar numbers
i
と，プロテアソームに結合しいないPA28 がFig.4A 蛋白質の新しいファミリーに属することを強く示唆し と同じ分画（5 -32 0 ）に検出されたがその活性のピーク ている．
は非常に小さくなっていた．そこで次にイムノプロッ .II PA28γ はPA28α とPA28β からなるヘテロポ ト分析により PA28α ，PA28β ，PA28γ の動態を調ベ リマー複合体とは異なる複合体を形成する．
た．予想されたようにPA28 プロテアソーム複合体が 最近， PA28α とPA28β がPA28 （αβλの分子構成 回収された分画にはPA28α とPA28β の両方が検出 を有したヘテロポリマー複合体として分子集合するこ された （Fig .4a , b）.そして， PA28γ もPA28 －プロ とが示唆されている （Kuehn, Dahlmann, 9691 : Song
テアソーム複合体の回収分画に検出され， PA28γ が ら， 6991 ）.そこで， PA28γ がαとβサプユニットか
PA28α とPA28β と同様にプロテアソームに会合し ら構成される異型六量体に会合するか否かを検討した．
ていることが判明した．この結果はPA28γ がPA28 PA28γ とPA28α ／βとの相互作用を解析するため，
43
…
JI-
28-A
B
C
Aa
泌
PA28y
F i g . 5 Inoiittacipenropumm siyslana tfo eh deifirup PA28 by aα82AP-itn β，82PA-itnaand 28γPAi.-stnaiebodtina For ,sliated ees lamtenriepxE .seruedcorp A20 μI
o
f eerht α82AP-itna ，anti-PA28βand Aγ82tPina-dseiiobtna , and preimmune
s e r
a taht had been bound ot neitoPr A -Seoshrape were detabucni thwi eht
p u r i f i e d PA28. rteAf low dpees ,noitagufirtnec eht elbulos CS ) and elbulosni (P )
were edsu rof immunoblot sisylaya gnisu α82AP-tina （A ),β82PA-itna CB ) and
a n t i -P A 2 8 γ CC ) a.seidobitn
各々の抗体を用いた免疫沈澱実験を行った. igF . A,5
B に示すように抗PA28α 抗体および抗PA28β 抗体
は共に単独でPA28α とPA28β の両方を免疫沈澱さ
せたがPA28γ は全く沈澱させなかった．これらの結
果とは逆に，抗PA28γ 抗体はPA28α とPA28β を
沈澱させることなく，PA28γ のみを特異的に沈澱させ た（F.gi 5C ）.これらの免疫沈澱反応は pre-immune lgG で全く観察されなかった．これらの結果から， P A 2 8 γ の複合体にはPA28α とPA28β が含まれてい ないことが判明した．そしてグリセロール密度勾配遠 心法により， PA28γ 一プロテアソーム複合体が PA28 （αβλープロテアソーム複合体と同じ分画に沈降して くることから， 28γPA はPA28α とPA28β から構成 されるヘテロポリマー複合体とほぼ同じサイズを有し ていることが考えられた．従ってPA28γ はPA28 （γ）6 のホモポリマー複合体を形成すると推定された． I I I . プロテアソームに対するPA28α ，β および P A 2 8 γ の効果 R e a l i n i ら499(1 ）は大腸菌で発現させたPA28α が 単独でプロテアソームを活性化することを示した．ま 2 0
l
s
． 司宮
f
51 1 0 5。
5 01 51 02 たPA28α をコードする cDNA を発現ベクターに組 み込んで抗原提示細胞にトランスフェクションすると 特異的にキラーT
細胞が誘導されることが判明してい る（Gpttruroe ら， 9691 ）.しかし，他の PA28 分子， βとγ，のプロテアソームに対する効果は明らかにさ れていない．これら三種のPA28 分子のプロテアソー ムに対する影響を大腸菌で発現させたリコンビナント 蛋白質を用いて検討した.pET システムで発現させた 三種のPA28 はいずれもそれらのほとんどが不溶性に なるため 8M 尿素を含む緩衝液で溶解し， 2iN ＋を固 定したアフィニティークロマトグラフィーで精製した． このように変性状態で分離した PA28 を透析により 徐々に尿素を除いて再生処理するとそれらの約50% が可溶性蛋白質となって回収されたので、これらを用い てプロテアソームに対する効果を調べた. .giF 6 に示 すように， PA28α は単独で加えると蛋白濃度依存的 にプロテアソームのペプチド分解反応を顕著に活性化 した．本実験ではN 末端に Hgtas-i の結合したリコン ビナント PA28 を使用したので， ctorFa Xa で処理し てgta 部分を除去して同様に行ってもプロテアソーム+
B
。
5 IO 51PA28α
（
μg)
F ig . 6 The tceffe fo nnatmbiocer PA28 sniteorp on teh Suc-LLVY -MCA ingradegd
a c t i v i t y tfo ehdeifirup 20S tnetal .emoasetorp Recombinant P A28αwas added w i t h usoriav noitatrnecnoc isadetacidn nieht encbesa (0 μg) proecenesr (fo 2
μg) of 01( μg) PA28βCAfo ) o PA28γCB) r roirp measure ot Suc-LLVY-MCA
d e g r a d a t i o n .
様々なヒトの組織における PA28α とPA28β そし てPA28γ をコードするmRNA の発現レベルをノー ザンプロット法で比較した （.giF 7）. 三種の mRNA は調べた全ての組織で検出されたが特に心臓と骨格筋 で高く発現していることが分かった．これらPA28 の 発現は20S プロテアソームや26S プロテアソームを構 成する調節サプユニットのmRNA の動態と 一致した (Tsurumi ら,5991 9619 ）.興味深いことは， PA28α と PA28β のmRNA のサイズが約.90 kbp であるにも かかわらず，PA28γ は52. kbp と非常に大きいことで ある．これはPA28γ をコードするcDNA の3’側に 長い非翻訳領域が存在することに起因すると思われる (Nikaido ら， 9319 ）.対照として EFα ，G3PDH ，そ の活性化にする効果には全く影響しなかった．この結 果は， PA28 がそのC末端を介しプロテアソームに会 合するとし、う以前の報告と一致した（Ma ら，.)2991 一方，PA28β 単独ではプロテアソーム活性化に全く影 響しなかった．しかし， PA28α が低濃度存在した場合 にPA28β を加えると著しい活性化の増強が観察され たが， PA28α が過剰に存在する場合にはPA28β の添 加効果は全く認められなかった. PA28γ はPA28α も
しくはPA28β の有無にかかわらずSue-LL VY-MCA
を基質としたプロテアソームのペプチド活性には全く 影響しなかった． I V . 3種のPA28 をコードするmRNA のヒトにお ける組織分布 （ 官 、 ）
Z
民 同 ・ ヤ 向 剛 吋 め （ 川 町 ）Z
民 同 目 ト ・ 島 ぜ ∞ （ 丈 、 ）g
m
g
l
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お 沼 言 明 書 同 一 切ω
Z
2
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l
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m w A 同 h ω 間 同 開 》 明 凶 れ W 向 山 混 同 M W 回 目 符 】 志 向 ＠ ぷ ∞ M w g g 吋1 5
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縄問内問 同 酬 明 m w h 信 玄 m w 山W
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5
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P
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E
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-0.9
PA28α
G3PDH
9
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n
t
i
c
A
PA28y
PA28~
E
F
l
α
-2.1
The mRN A lselve encoding eethr p r o t e a s o m a l rotaivtca snietorp nieht revil of ciengsnart mice ngiryrca SAP －γ－IFN
g e n e
. The revil from hace evitgaen -rettil
mate C♂） and cinegsnart mice （♂ ，♀〉
e x p r e s s i n
g γ－IFN gene CIAP －γ－IFN ) were
a n a l y z e d by RN A btol noitazdiirbyh rof t h e slevel fo mRN A engodicn P Aα82 ， PA28βand A28γP ． F i g . 8
RNA tolb noitzadirbyh fo human PA28
cDNAs hwit lypo (A )+ RN As from -irav o u s human .seussit Amounts fo mRN A e n c o d i n g P Aα82 ，PA28βand PA28γwere a n a l y z e d by RN A btol noitazidirbyh (Aki e t .la , 1499 ). The snoitisop fo RNA ezis markers era shown ni( )sesabolik on teh r i g h t . F i g . 7
cDNA をハイプリダイゼーションすると 二 つのノ〈ン ドが検出されたが，これらが同ー のPA28γ をコード しているか否かは不明である． 次にこれらのトランスジェニックマウスの肝臓から 調整した粗抽出液を用いて三種のPA28 蛋白質レベル の変動をイムノプロット法で検討した. Fig.9A に示 すように， PA28α とPA28β はSAP －γ－IFN で明確
に増加していた． 一方，驚いたことにPA28y は二種 の PA28 蛋白質と異なり完全に、消失することが分か った．そこでさらに培養細胞を用いてγ－IFN の影響を 同様にイムノプロット法で検討した. .giF 9B に示す ように PA28α とPA28β の蛋白質レベルは共に γ－ IFN の処理に応答して増加したが，逆にPA28γ は時 間依存在に減少した．これらの結果から， γ－IFN が
PA28α ／PA28β とPA28γ の発現を転写レベル及び転
写後のレベルを介して相反的に調節していることが示 唆された．
次にγ－IFN の処理で増加したPA28α とPA28β が
してβ－nitca のmRNA のレベルを検討したところ， E F l α はヒトの調べた全ての組織において比較的均一 に発現していたがG3PDH とβn－itca のmRNA レベ ルはPA28 と同様に筋組織で高く検出された． V. PA28 ファミリー蛋白質のγ－IFN による調節 Ahn ら5991( ）は ヒトの培養細胞を γ－IFN で処理 すると PA28α とPA28β のmRNA レベルが21 時間 以内に顕著に増加するが， PA28γ のmRNA レベルは γ－IFN に大きく影響しないことを報告した．そこで本 実験では， γ－IFN 遺伝子を肝特異的な血清アミロイド P成分のプロモーターを用いて肝細胞で発現させるよ うにしたトランジェニツクマウス（SAP －γ－IFN ）の肝 臓 （Toyonaga ら， 4991 ）を用 いて三 種のPA28 の蛋 白質の発現レベルの変動を調べた..giF 8に示すよう
に， PA28α とPA28β のmRNA はSPA －γ－IFN では
雄，雌ともに対照マウス （veegtiN etamretitl ）に比較 して著しく増加しているが， PA28γ のmRNA はほと んど変動しないことが分かった．このとき， PA28γ の
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and ciengsnatr mice （♂，♀） were detdjebus ot ttolbonummi .sisylana B : The c e l l tcartex 05( μg) fo hwit ro uthotiw y-lFN tnematert rof suoriav days sa i n d i c a t e d were detcejbus ot bttoluonmmi .sisylana F i g . 9
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B : lmmunoblot sisylnaa tfo eh rotavitca snietorp , P Aα82 ，PA28βand PA28y ,
and elbicduni-NFl-y aemosetorp ,stinubus LMP2, LMP7 and MECL-1, ni eht
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t h o s e ni .A Immunoblott sisylana were rdmeofrep gnius itna e-pdtipe -itna b o d i e s tsnaiga eht evitcepser .snietorp neitroP ni 051 μ eIcha noitcarf were p r e c i p i t a t e d ithw netocea and detcjebus ot immunoblot .sisylana sksriestA i n d i c a t e tcafitra bands by A82i-Ptna ,seidobitna useaceb eyth were ton d e t e c t e d ni eht deifirup s82 esampl . プロテアソームに会合し，プロテアソームの活性化に ロテアソームに結合していないPA28 複合体が回収さ 寄与しているか否かを検討した．このためマウスの肝 れる分画 （50-22 ）での増強がSAP －γ－IFN からの試料 臓の粗抽出液をグリセロール密度勾配遠法で、分画した． で観察された．しかしながら不思議なことに， PA28-本法により 26S プロテアソームと 20S プロテアソー 20S プロテアソーム複合体の沈降分画（51 ～81）には ムが明確に分離できることが分かっているので （Aki, ベプチダーゼ活性，すなわち活性化したプロテアソー 1 9 9 4 ），最初にこれらの分布を調べた．このため，プロ ムが認められなかった．そこで γ－IFN で誘導された テアソームの三種のペプチド分解活性，すなわちキモ PA28α とPA28β が実際にプロテアソームに会合し トリプシン様活性である Sue-LL VY-MCA, トリプ シ ているか否かをイムノプロット法で検討した. .giF
ン様活性である Boc-LRR-MCA そしてV8 様プロテ 10B に示したように PA28α とPA28β の蛋白質の量 アーゼ様活性である Cbz -LLE －βNA を基質としてベ は， 02-51 の分画で明確に増加し， γ－IFN で誘導され
プチダーゼ活性を測定した. .giF lOA に示すように たPA28α とPA28β が20S プロテアソームに会合し
SAP －γ－IFN のマウス肝臓においては，20S プロテアソ ていることが判明した．一方PA28γ の蛋白質は完全
一ムと 26S プロテア ソームのキモトリプ シン様，酸性 に消失した．また免疫プロテアソームのサプユニ ッ ト プロテアーゼ様活性はほぼ完全に減少したが逆にトリ であるLMP2, LMP7, MECLl は以前報告されている プシン様活性は大きく増加した．そこでPA28 活性を ように（Akiyama ら， 4991 : Hisamatsu ら，,)6991
において増加していることが観察された． 考 察 本研究ではプロテアソーム活性化因子 PA28 が
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β，γの少なくとも三種の相向性の高い蛋白質から構 成されていることを明らかにした．そして密度勾配遠 心法の実験から，PA28α ／PA28β ープロテアソーム複合 体と PA28y －プロテアソーム複合体が同じ分画に沈降 してくること（.giF 4） ， 及 び 免 疫 沈 澱 実 験 に よ り P A 2 8 γ がPA28α とPA28β から構成される複合体に 含まれないこと（.giF 5）から， PA28γ はPA28α と P A 2 8 β のヘテロボリマー型複合体とは異なるホモポ リマー型複合体を形成することが示唆された．それで はなぜ細胞内に二種の，恐らく PA28 （αβ）3 とPA28 （γ）6のPA28 複 合 体 が 存 在 す る の か ？ 三 種 の PA28 分子の機能は何か？ ということが問題となっ てくる．そこで今回の研究結果について現在までの知 見を合わせて考察する． これまでの研究から， PA28 は変性状態の基質蛋白 質あるいはユビキチン化蛋白質の有無にかかわらず全 く作用せず，蛍光ペプチド基質の分解活性を顕著に促 進するということが報告されている （Ma ら， 2991 . D u b i e l ら， 2991 ）.そして精製した PA28 ，おそらく P A 2 8 α とPA28β の複合体がプロテアソームのベプ チターゼ活性に対して Vmax の増加と Km の減少を 導くとし、う結果を示し， PA28 がアロステリック効果 のように作用する可能性を示唆した．また大腸菌で発 現させたリコンビナ ン トPA28α は単独でも不活性型 プロテアソームを十分に活性化できることが明らかに なった く.giF 6A ; Rniilae ら， 4991 ）.しかし PA28β とPA28y は各々単独ではプロテアソームの活性に全 く影響しなかった， PA28β は活性化に必要なPA28α の濃度を見かけ上減少させる効果を示すことが判明し た （igF .6). この結果， PA28α とPA28β は機能的 に相互作用していることが示唆された．実際， PA28αとPA28β が 細 胞 内 で PA28 （αβ）3 の
hetro-o l i g o m e r i c 複合体を形成することが示唆されている (Ahn ら， 96;19 Song ら， 6991 ). F.gi 1 C上部のパネ ノ レ〉 に示したように，電子顕徴鏡による解析から精製 したPA28 はディスク粒子であるがプロテアソームの 両端に会合するとフ ッ トボール型粒子を形成すること が判明している くLupas ら， 3919 ; Gray ら， 4991 ). 従ってPA28 はATP 依存性プロテアーゼであるダン ベル型の 26S プロテアソームを形成するもう一つの 調節複合体， PA700 ，と20S プロテアソームの同じ部 位に競合して会合していると推定された （Fig .1の上 下 パ ネ ル を 比 較 ；Yoshimura ら， 3919 ; P,srete 1 9 9 4 ) . Ki 抗原は最初，自己免疫疾患として知られている全 身性エリテマトーデスの患者血清に見つか った自己抗 体 に 対 す る 抗 原 と し て 同 定 さ れ た （Nikaido ら， 1 9 9 0 ）.その後 PA28α とPA28β のcDNA がクロー ニングされると，これら PA28 がKi 抗原と高い相向 性があることが判明した （Ahn ら， 5991 ）が， Ki 抗 原が実際PA28 を構成するサブユニットであるか否か は不明であった．本研究では Ki 抗原に特異的な抗体 を精製したPA28 に明確に反応すること （gFi .2），お よびKi 抗原がプロテアソームに会合すること （igF . 4）を証明し， Ki 抗原が新しいPA28 のメ ンバーに属 することを提案した．これまでの報告では精製した PA28 が二種の蛋白質から構成されていることが判明 しているが（Ma ら， 2991 ），なぜPA28γ が検出され なかったのかは不明である． 一つの可能性としては赤 血球から単離したPA28 標品にはA28γP の含量がき わめて少ないことが考えられる．実際，抗8γPA2 抗 体を用いたイムノ プロッ ト分析では赤血球の粗抽出液 においてはPA28γ が検出できなかった （未発表〉．さ らに， Ki 抗原，すなわちγPA28 が核内蛋白質として 同定されたことから細胞質にはわずかしか含まれてい ないとも考えられる （Nikaido ら，0991 ）.またイムノ プロット解析よりヒトの癌細胞においては8γPA2 は 正常細胞に比較して多く発現しているように観察され た （未発表）．実際A28γP のmRNA の発現レベルは 細胞周期のS期において増加することが示唆されてい る（Nikaido ら， 0919 ）.これらの結果から考えると， PA28γ はPA28α ／βの機能とは異なり，細胞の増殖 に関与している可能性が高いと思われる．また， P A 2 8 γ はこれまで使用してきた蛍光ペプチド分解活 性には明確な効果を示さなかったので，現在 PA28y の分子機能は不明であるが，適当な標的基質が見つか れ ば28γPA のプロテアソームに対する作用が明らか になるかもしれない． PA28 の生物化学的意義はまだ確立されていないが， 最近PA28 が免疫学的に重要であることが強く示唆さ れている．それは， PA28α がケラチノサイト細胞にお いて y-IFN に最もよく応答する遺伝子として同定さ れたUPI-5111IG と同一分子であることが判明したこ とがきっかけとなった くHonore ら， 3991 ）.次に Ahn ら5991( ）はγ－IFN がPA28α をコードする mRNA のみならずβPA28 も誘導させることを最近報告 した．
5 7 成を変化させるのと同様にPA28 ファミリー蛋白質の 分子構成をも変化させることが判明したが，その意義 は不明である．しかしγ－IFN の作用から考えるとこの サイトカインで誘導される PA28α とPA28β は内在 性抗原のプロセシング提示と関与することが予想され る．実際， 8αPA2 のcDNA をトランスフェクション してこの分子の発現を増強すると，特異的なキラーT 細胞を誘導させること（puttroerG ら， 5991 ），さらに PA28 がn viorti でMHC クラスI分子のリガンドを 効果的に産生させることが最近報告されている（Dick ら， 9691 ）.一方 8γA2P はγ－IFN に応答して発現が 減少するので 28αPA ／PA28β の作用とは異なり免疫 応答には無関係で、あるのかもしれない． ごく最近Kasahara ら（6991 ）は免疫プロテアソー ムを構成するサプユニット群が MHC 遺伝子領域に コードされた遺伝子群と共に染色体重複によって造成 され，これらの遺伝子群の起源が背椎動物が抗原特異 的な免疫システムを獲得する時期に一致することを提 案し．従って γ－IFN に応答する PA28 遺伝子の分子 進化は興味深く，これがPA28 の機能を解明する鍵に なるかもしれない．実際，PA28 の活性が免疫システム を持たない酵母や植物などの粗抽出液には同定されな いことを確認した（未発表〉．またPA28 に相当する遺 伝子が酵母のゲノム上に見つからないことが判明した． これらの結果はPA28 の遺伝子が真核生物の進化の初 期には存在せず，生物が多くの抗原提示を担当する遺 伝子群と共に免疫システムを収得した段階で新たに獲 得したとし、う可能性が考えられる．今後はPA28 の構 造と機能の関連性について分子レベルで、の解析を進め ると共に，三種のPA28 遺伝子を単独あるいは重複し て破壊したノックアウトマウスを作製し，これらの生 理機能を解析する必要があると考えている． 稿を終わるに臨み，御指導と御校聞を賜った徳島大 学酵素科学研究所，酵素病理部門福井清教授，東京都 臨床医学総合研究所，化学療法部門田中啓二部長に深 く感謝します．また本研究を行うにあたり御協力頂い た徳島大学医学部泌尿器横田欣也助手，住友電工バイ オマテリアル研究所の皆様方に深謝致します． 文 献 Ahn,
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,.Y ,ihsahanaT ,.N Akiyama, ,.K H i s a m a t s u , ,.H Noda, ,.C Tanaka, ,.K C h u n g , ,.H.C aar,bihSm ,.N ,ylliW .P,.J M o t t ,.
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,.D ,rethgualS .C,.A and DeMar-t i n o , N.G . )5991( : Primary sertucurts fo プロテアソームの活性化因子PA28 ファミリー さらに本研究ではαPA28 とPA28β の蛋白質レベル もγ－IFN に強く応答して増加するが，逆にPA28γ は mRNA が変化しないにも関わらず蛋白質レベルが時 間依存的に消失することを見出した（.giF 9）.従って PA28 ファミリー蛋白質に対する γ－IFN による調節 は多様であると考えられ．しかしながら， γ－IFN は P A 2 8 α ／βのmRNA を上昇させるので，これらをコ ードする遺伝子の転写を促進させると推定されるが P A 2 8 γ のmRNA レベルには影響しないので， γ－IFN 処理による A28γP の消失の分子機構は転写後レベル であることが示唆された． γ－IFN は免疫インターフエロンとも呼ばれ免疫制 御に作用する最も重要なサイトカインであり，実際抗 原提示に応答するTAP トランスポーターやMHC 分 子の遺伝子発現を強く増強させる方向に導くことが知 られている（,uailliB 6991 ）.また我々（ Akiyama ら， 1 9 9 4 : Hisamatsu ら， 6991 ）や他のグループ（hclieB ら，4991 ; Fhilr ら，4991 〕の研究において， γ－IFN は 内在性抗原のプロセッシングにより適しているプロテ アソームのサプユニット， LMP2, LMP7 そ し て MECLl を特異的に誘導してプロテアソームの分子構 成を変換させる作用があることを証明している．そし て我々はこの γ－IFN にて誘導されたプロテアソーム を“免疫プロテアソーム”と命名することを提案した ( T a n a k a , 7991 ）.実際， γ－IFN は塩基性あるいは疎水 性アミノ酸のC 端側ペプチド結合を加水分解する活性 を増加させるが逆に酸性アミノ酸のC端側ペプチド分 解活性は抑制させる（Gaczynska ら， 3991 l; Dlocsir ら， 3991 ）.細胞表面の MHC クラスI分子に結合し ている抗原ペプチドの C 末端には酸性アミノ酸がほと んど存在せず，疎水性あるいは塩基性アミノ酸をC 末 端にもつペプチドが高頻度にクラスI
分子に結合して いることから（Rammennsee, 5991 ，）γ－IFN 依存的な プロテアソームの基質特異性の変化はMHC クラス I分子に提示されるペプチドの生成に適していると考 えられる．一方逆に， γ－IFN によるキモトリプシン様 活性の減少が他のグルーフ。から報告された (Boes ら， 1 9 9 4 : U sllert ら， 5991 ）.我々も培養細胞を一時的に γ－IFN で処理すると，キモトリプシン様活性が増加す ることが報告した（Aki ら， 4991 ）が，本研究で示す ように（.giF lOA ，）γ－IFN を持続的に長期間処理する 条件ではキモトリプシン様活性は逆に減少することが 判明した．このように，キモトリプシン様活性は様々 な細胞の状態で容易に変化すると考えられる．他方， 本研究により γ－IFN が20S プロテアソームの分子構 E B E E － E E E E E 昨 K F E き E s t u dtwo homologous sitnuubs fo P A,28 a y -i n t e r f e r o n -i n d u c i b l e nietorp rotavitca tfoeh 2 0 S .meoeastorp FEBS ,.tteL ,663 2-473 2 Ahn, ,.K rnedalrE ，乱1.,L,qcruet ,.D ,norseteP .P A . , ,huFr K. , and Yang, .Y 699(1 ) : I vn ovi c h a r a c t e r i z a t i o n tfo eh emosaetorp -aluger t o r PA28.
.
J
.loiB ,.meCh ,172 73281 -14228 3 A,ik M. , Shimbara , N ., Takashina, ,M.Akiyama, ,.K Kagawa, ,.S Tamura, T. ,
Tanahashi , N ., Yoshimura , . , T Tanaka , K. ,
and ,arahihcI A. )4991( : Inorefertn －γ i n d u c e s tnereffid tinbuus snoiatzniagro and f u n c t i o n a l ytisrevid fo s.eomasoterp
.
J
B i o c h e m . , ,511 752 -2964 Aki yama, ,.K Yokota , K. , Kagawa ,, .S ra-Shimb a
, N ., Tamura, ,.T ,kaiokA ,.A Nothwang, H
.
G. , Noda, ,.C Tanaka, K. , and araihhcI ,
A . )4991( : cDNA ginnolc and norofretni －γ d o w n -r e g u l a t i o n pfo slaomaetor stinbuus X and .Y encieSc , 2,56 42311-312 5 B,hcile M . ,.P ,neynGl .R
,
J.
,ergenS ,.G ,reehS D ., and d,laesworT.
J
(1499 ) : Proteasome components hwit lacorpcier noisesprxe ot t h a t fo eht MHC-encoded LMP .snietorp C u r r . ,.loiB ,4677-697 6 B,uailli .A )6991( : Inorferetn －γ：bygloio and r o l e ni.issneghotap .dvA ,ol.munIm ,26 16 -1 3 0 7 Boes , B,. Hengel , H,. trepuRp , ,.T ,plthauuM . , G K o s z i n o w s k i , ,H..U and ,lezteolK .P M. ( 1 9 9 4 ) : y-norferetnI noitalumits modulates t h e cityloetorp ytivitca and evgaaelc etis p r e f e r e n c e fo 20S .semosaetorp.
J
.Exp Med. , 1,97 9901-90 8 Bradford ,.M. M . (6791 ) : A ridpa and evitisnes method rof eht noitattinauq microgram fo q u a n t i t i e s pfonietro gnizilitu eht elpicnirp o f pnietor -dye .gnidnib .lanA hem.Bioc , 72 , 2 4 8 452 9 Cover,chanei A. 9419( ) : The intuiiqub -p r o t e a s o m e cityloetorp a.ytwhap ,lleC ,97 1 3 12 10 Coux , 0 ., Tanaka , ,.K and ,gredbolG A . .L
( 1 9 9
6 ) : Sreucturt and snoictnuf tfo eh 20S and 26S semosaetorp . Annu . Rev . B-oi
c h e m . , ,56 108 -874 1 1 artino,eMD G . ,.N and ,rethugalS .C 3991( ) : R e g u l a s t o r y snietopr fo eht .omeasterop Enzyme ,nietorP ,74 432-143 1 2 ,kciD T. ,.K ertRupp , ,.T p,urtteorG ,.M -teolK z e l , P . M ., Kehn,u . , L .kiwsinoszoK U ., S t r v a n o v i c , ,.S dlihSc , H,. and Rammensee, H . G. 6991( ) : Cdenatidroo laud segvaecl i n d u c e d by teh aeosmetorp roatlugre P A28 l e a d ot dominant MHC sdnagil . Clle , 8,6 2 5 3 -2 6 2 1 3 llocsirD , ]. , Brown, M. G,. eylniF , D ., and Monaco,
