納豆菌(Bacillus subtilis var.natto)菌体外DL-γ-ポリグルタミン酸の機能および合成・分解に関する研究

納豆菌(Bacillus subtilis var.natto)菌体外DL-γ

-ポリグルタミン酸の機能および合成・分解に関す

る研究

著者

木村 啓太郎

号

701

発行年

2005

URL

http://hdl.handle.net/10097/16755

氏

名(本籍)

学 位 の 種 類

学 位 記 番 号

学位授与年 月日

学位授与 の要件

き む ら けい た ろ う 木 村 啓 太 郎 博 士(農 学) 農 第701号 平 成17年11月10日 学 位 規 則 第4条 第2項 該 当

学 位 論 文 題 目

納 豆 菌(Bacillussubtilisvar.natto)菌 体 外DL一 γ一 ポ リ グ ル タ ミ ン 酸 の 機 能 お よ び 合 成 ・分 解 に 関 す る 研 究

論 文 審 査 委 員

(主 査)教 授 (副 査)教 授 教 授

是

一

也

好

瞭

勝

尾

亦

味

神

勝

五

一83一

論

文

内

容

要

旨

第1章 序論 納 豆 の 粘 質 物 で あ る γ 一ポ リグ ル タ ミ ン酸(以 下YPGAと す る)は 、納 豆 に独 特 の テ ク ス チ ャー を もた らす 他 、 吸 水 性 、保 湿 性 、凝 集 性 、 金 属 イ オ ン結 合 性 に優 れ た 生 分 解性 高 分 子 と して の 利 用 が 注 目 され て いる 。 ま た 、 ガ ン マ線 照 射 によ るゲ ル 化 や側 鎖 の アル キル 化 修 飾 に よ る 溶 解 性 の 調 節 な ど化 学 的 な ア プ ロ ー チ によ る性 状 改 変 も盛 ん に研 究 され て いる_。

この よ うな 用 途 のた め のYPGAは 、納 豆 菌(βao〃'{ノSεαわガ〃Sρ7a温0ゾ)によ る発 酵 生 産 で 作 られ る が 、 生 産 量 の不 安 定 さや 再 現 性 の な い こ とが 問題 とな って お り、この 現 象 の 微 生 物 学 的 な 背 景 や 原 因 、特 にYPGAの 合 成 と分 解 の 仕 組 み とそ の 制 御 機 構 を 明 らか にす る こ とが 求 め られ て い る。

微 生 物 学 的 に は、納 豆 菌 以 外 に もグ ラ ム陽 性 細 菌 βao伽s属 の βaσ〃'μssuわ〃〃5、 βad伽s〃 酌 θη施A翻3、 βad〃αsaη伽a(お な どが この グ ル タ ミ ン酸 が γ一ペ プ チ

ド結 合 で 直 鎖 状 に つな が った 高 分 子 を 菌 体 の 最 外 層 へ 生 産 す る こ とが 知 られ て いる 。βa{別μssμわ撚sと8ac〃 μs〃o々θ耐 窃翻3の 作 るYPGAは 、D一お よびL一グル タ ミ ン酸 の 共 重 合 体 で あ り、分 子 量 は2MDaを 超 え る。一 方 、8ad〃usaη 伽ao佑 のYPGAはD一 鏡 像 体 の グ ル タ ミ ン酸 の み か らな り、細 胞 表 層 に強 固 に結 合 して

いる 点 で 他 の2つ と異 な る 。YPGAは 細胞 の 最外 部 へ 作 られ る ことか ら、多様 な 環 境 変 化 へ の 対 応 、 栄 養 素 の 取 り込 み 、外 敵 か らの 自 己保 護 、 細 胞 間情 報 伝 達 な どの 細胞 機 能 と関係 が あ る と考 え られ る。

YPGA合 成 酵 素遺 伝 子(oaρ8CA:3っORFか らな る オ ペ ロ ン)は 、Makino 'ら によ

って βao伽saη 伽ac∫sの 感 染 因 子 と して 同定 され 、 そ の 後 、相 同性 を手 が か りと して 、Ashiuchiら が βao1伽s5め 伽 か らク ロ ー ニ ング して い る。 近 年 蓄 積 した ゲ ノム情 報 を調 べ る と、8ad〃us〃 肋eη施 ハmlsもoaρ β伽 と相 同性 の高 い遺 伝 子 を も って い るの で 、それ ぞれ のYPGA合 成 酵 素 遺 伝 子 は 、共 通 の祖 先 遺 伝 子 に 由来 す る と考 え られ る。

YPGAの 機 能 と して 、βa(説〃μsaη伽ads(炭 ソ菌)のYPGAが 感 染 因子 で あ る こ とが 知 られ て い る。実 際 、8ao〃 ロsa力伽a(お のYPGA非 生 産 変異 株 は家 畜 用 生 ワ クチ ンと して 使 わ れ て い る。8ao〃 レsaη伽a(お のYPGAは 宿 主 進 入 シ グ ナル で あ るCO2分 圧 に応 答 して 発 現 し、宿 主 免 疫 系(フ ァ ゴサ イ トー シス)か ら逃 れ る た め の 防 御 カ プセ ル と して の 機 能 を持 って い る。

8ac〃 σssσb棚sのYPGAは 細 胞 密 度 に応答 して 定常 期 に生 産 され る。主 な 生 息

場 所 で あ る 土壌 中 で は 、定 常 期 の 細 胞 は コ ロニ ー を 形 成 して お り、 栄 養 飢 餓 対 応 や バ クテ リオ フ ァー ジな どの 外 敵 か らの 自 己保 護 が 生 存 戦 略 上 重 要 で あ る 。 Bao〃 σssμ加 〃sのYPGAは 、そ う した 定 常 期 の 細 胞 生 理 と関 係 が あ る と推 察 され る が 、 そ の機 能 お よ び合 成 制 御 系 の 詳 細 は 不 明 で あ る。 研 究 が 進 展 しな か った 一 因 は_{、 ゲ ノム 解 析 に使 用 され 多 くの 知 見 が 蓄 積 して い る 実 験 室 株(8ad〃us} sμわ棚s168株)で はYPGA合 成 酵 素 遺 伝 子(oaρβ(酒orγws(》yw加 句 が 発 現 して いな い こ とで あ る 。 納 豆 菌(βa(淵 μssub欄sのaπoの は、 実 験 室 株 と非 常 に保 存 性 の 高 いゲ ノム を も って い る こ とが1tayaら の 研 究 で 明 らか にな って い る。 納 豆 菌 を用 いれ ば 、 実験 室 株 ゲ ノム 情 報 を 利 用 した βaσ伽sεub棚5のYPGA研 究 が 可能 で あ る。 2000年 に(独)食 品 総 合 研 究 所 発 酵 細 菌 研 究 室 の 伊 藤 グ ル ー プ は 、納 豆 菌 (βa(頭伽ssαb謝sのa甜oの のYPGA生 産 が クオ ー ラ ムセ ン シ ン グ(細 胞 密度 応答}に 依 存 す る こ とを 報 告 した 。 クオ ー ラ ム セ ン シ ング は、 毒 素 生 産 な ど の2次 代 謝 やgeneticcompetenceの 誘 導 、 バ イオ フ ィル ム形 成 な ど定 常 期 の 様 々な 細 胞 機 能 を グ ロ ーバ ル に誘 導 ・制 御 す る仕 組 み で あ る。 ク オ ー ラ ムセ ン シ ング 遺 伝 子 は 、 菌 体 外 細 胞 密 度 指 標 物 質 で あ る ク オ ル モ ンoomXと そ の 輸 送 タ ンパ ク 質 oomO、ComX受 容 体 ヒス チ ジ ン リン酸 化 酵 素oomρ 、そ の レス ポ ンス レギ ュ レ ー タ ーcomAのoomQ呪 _{月4か らな る 。βad〃ussμb撚 εのγPGA生 産 は 、細 胞 密度} セ ンサ ー2成 分 制 御 系 を成 す 受 容 体 ヒス チ ジ ン リン酸 化 酵 素一 レス ポ ンス レギ ュ レー タ ー(ComP-ComA)の 制 御 下 にあ る が 、そ こか ら合 成 酵 素caρB(語 発 現 へ 至 る下 流 の 経 路 は不 明で あ る。 一 方_{、生 産 され たYPGAは 生 産 菌 自身の 分 解 ・消 化 作 用 に よ り定 常 期 後 期 に培} 地 中 か ら消 失 す る こ とが 知 られ て お り、これ がYPGA発 酵 生 産 に お け る不 安 定 性 の 原 因 の ひ とつ で あ る。 しか し、 分 解 系 に 関 して は 現 象 論 的研 究 に 止 ま って お り、分 子 レベ ル の 究 明 は 行 わ れ て いな い。 この よ うな 背 景 か ら、私 は 、実 際 に納 豆 製 造 に使 用 され て いる納 豆 菌(βac流伽S sσわ枷sのa跡ql)「 三 浦 株 」(宮 城野 納 豆 製 造 所 、仙 台 市)を 用 いて 、YPGAの 微 生 物 学 的意 義 と合 成 ・分 解 機 構 の 全 容 解 明 を 目指 して 遺 伝 生 化 学 的 手 法 によ り研 究 を 行 った 。 本 研 究 で は 、納 豆 工 場 で 発 酵 不 良 を 引 き 起 こす フ ァー ジの 増 殖 が YPGA分 解 酵 素 生 産 を伴 う こ と、お よ び納 豆 菌 自身がYPGAを 分 解 す る こ とを 手 が か りと して 、YPGAの 生 体 防 御 機 能(バ ク テ リオ フ ァー ジ に対 す る 防 御 機 能) と栄 養 貯 蔵 機 能(分 解 産 物 グル タ ミ ン酸 の 定 常 期 の 細 胞 に よ る 再 利 用)を 明 ら 一85一

か に した 。ま た 、エ ン ド型 ・三[キソ型 の2段 階 か らな るYPGAの 分 解 機 構 を 発 見 して 、 分 解 酵 素 欠 損 変 異 株 に よ るYPGAの 安 定 ・大 量 発 酵 生 産 法 を 確 立 した 。 YPGAの 合 成 制 御 機 構 につ い て は 、 細 胞 密 度 指 標 物 質 ク オ ル モ ンComXか ら YPGA合 成 へ至 る 情 報 伝 達 経 路 がComX→ComP-ComA→DegQ→DegS-DegU →CapBCAで あ り、細 胞 密度 に よ る制 御 が さ ら に栄養 饅 餓 情報 に よ る調 整 を受 け る こと を 解 明 した 。 第2章 フ ァー ジに対する防御機能 納 豆 工 場(埼 玉 県)の 発 酵 不 良納 豆 か ら分 離 され た フ ァー ジ(ΦMT1と 命 名) を納 豆 菌(8ac伽5sμb撚sの 訪oの に感 染 さ せ る と、MOl(multipIicityofinfection) 112000か ら116000で よ く増 殖 し、ホ ス ト細 胞 を 溶 菌 させ た 。培 養 上 清 か ら高 い YPGA分 解 活 性 が 検 出 され 、YPGAの 粘 性 を 急 激 に失 わ せ た(Fig.1A,B)。 一み か け 上 問 題 な く発 酵 した納 豆 の 粘 性 を 急 激 に低 下 させ 、 い ま で も生 産 現 場 を悩 ま せ て い る 原 因 は 、この酵 素 活 性 で あ った。この 活 性 を精 製 した と ころ 、25kDa の 単 量 体 タ ン パ ク 質 を 得 る こ と が で き た(Fig.2)。 こ の 酵 素 (poly-gamma-glutamatehydrolaseP=PghP)はYPGAを エ ン ド型 に切 断 し、重 合 度3か ら5の オ リゴ γ一グ ル タ ミ ン酸 を生 成 した。 精 製 酵 素 のN末 端 ア ミノ酸 配 列 を も と にフ ァー ジゲ ノ ム か ら該 遺 伝 子 を ク ロ ー ニ ン グ しその 一 次 構 造 を 明 らか に した(配 列 情 報 はDDBJaccessionnumber ABO91475へ 登 録)。 既 知 の配 列 との相 同性 は見 あ た らず 、 新規 な 酵 素 で あ る と 考 え られ た 。 ク ロ ーニ ン グ した ΦMT1の ρφP遺 伝 子産 物 を大 腸 菌 で 生 産 し、 そ の活 性 を確 認 した 。 PghPを 生 産 す る フ ァー ジ(ΦNIT1)は 、YPGA生 産 菌 で も指 数 関数 的 に増 殖 で きた(Fig,3A)。PghPを 生 産 しな い フ ァー ジ(BS5)はYpGA生 産 菌 で は増 殖 で きな か った が 、精 製 したPghPに よ ってYPGAを 分 解 す る と増 殖 で き た(Rg. 3B)。 この こ とか らYPGAは フ ァー ジ感 染 へ の 防 御 壁 機能 を 持 ち 、 フ ァー ジは共 進 化 の 結 果 と して 分 解 酵 素 を 獲 得 した と考 え られ る。 Ackermannら の8ao∬'σsεuわ醐sタ イ ピ ング フ ァー ジ10種 とフ ァー ジ タイ プ が 異 な る49株 のasub撚s系 統 を 調 べ る と、10種 中4種 の タ イ ピング フ ァー ジがPghPを 生 産 し、49株 中23株 がYPGAを 生 産 した 。土壌 な どの 自然 界 か ら 分 離 したasσ わ酬sフ ァー ジ に広 範 囲 にPghPが 分 布 す る こ とは 、'γPGA生 産 株 一86一

で の増 殖 にPghPが 必要 だ とす る実 験 結 果 を 支 持 した 。 PghP生 産 フ ァー ジのゲ ノム を用 い て 、ΦNIT1の ρψ ρを プ ロー ブ と して サ ザ ン解 析 を行 った と こ ろ、 ρψ ρ には構 造 上 の 多様 性 が あ る ことが 示 唆 され た 。 以 上 の 結 果 は原 著 論 文(1)に 発 表 した 。

第3章

分解機構と栄養貯蔵機能

生産 され たYPGAが 培 養 液 中で 除 々 に消 失 す る こ とは 、現 象論 的 に知 られ て い た 。この こ と は、合 成 され たYPGAが 分 解 され 、定 常 期 の 細胞 に栄養 源 と して再 利 用 され る こ とを示 唆 した 。 Abeら は 、培 地 中 に分 泌 され る γ一グル タ ミル トラ ンス フ ェ レー ス(GGT)に 、 伽v1￡mでYPGAか らL一グル タ ミ ン酸 を遊 離 す る活 性 を報 告 して いる 。 しか しな が ら、D一グ ル タ ミ ン酸 残 基 へ の作 用 な ど酵 素機 能 の 詳 細 や 、'η廓0で の機 能 性 、 YPGA分 解 へ の 寄 与 につ いて は不 明 で あ った 。 そ こで 、 精 製 したGGTと 合 成 基 質(テ トラ ー γ 一グ ル タ ミ ン酸)「を用 いた 分 解 機 構 の 解 析 とggf遺 伝 子 破 壊 株 の 機 能 解 析 を 行 った 。 そ の結 果 、GGTはYPGAのN末 端 か らD、Lの 鏡 像 体 の 区 別 な くグル タ ミ ン酸 を遊 離 す る エ キ ソ型分 解 酵 素 で あ る こ と(Fig.4)、ggf遺 伝 子 破 壊 株 はGGT活 性 を 完 全 に失 いYPGAの 分 解 中間 体(分 子 量0.1MDa)を 培 地 中へ 蓄 積 す る こ と(Fig.5)が 明 らか にな った 。 ggf遺 伝 子 破 壊 株 で分 解 中 間 体 が 蓄 積 した こ とは 、GGTと は別 に 中 間体 を生 み 出す エ ン ド型 の分 解 系 が 存 在 す る こ とを 示 唆 した 。βao〃'ussμわ重恥768株 のゲ ノム 情 報 か ら、納 豆 菌(βao1〃 σε5σb撚sのa伽 ゾ)が9び と相 同性 の 高 い(ア ミノ 酸 相 同性=27%)機 能 未 知 遺 伝 子y解Dを もつ こ とが推 定 され た 。そ こで 、納 豆 菌 か らyl〃の 遺 伝 子 を含 む ゲ ノ ム 断 片 を ク ロ ー ニ ング し(配 列 情 報 はDDBJ accessionnumberAB196782に 登 録)、 破 壊 株 を 作 製 して そ の機 能 を解 析 した 。 99'とy1〃 の の2重 破 壊 株 は ま った くYPGAを 分 解 せ ず 、培 地 中 に合 成 直 後 と同 じ分 子 量分 布 を 示 すYPGAを 蓄 積 した。す な わ ち 、分 解 中 間 体 の 生 成(エ ン ド型 分 解)に γ1〃rO遺伝 子 が 必 須 で ある こ とを 見 い だ した 。 この株 はYPGA分 解能 が 全 くな いた めYPGAの 安 定 大 量 生産 株 と して利 用 で き た ・ YPGAの よ うな 高分 子 が 、エ ン ド型 、エ キ ソ型 の2段 階 の分 解 によ って 消 化 さ れ る こ とは 、他 の 多 くの 高 分 子(タ ンパ ク質 、 核 酸 、 デ ンプ ンな ど)に お いて も知 られ て お り、 分 解 の効 率 性 や 制 御 の しや す さ な どか ら、合 理 的 な 仕 組 み と _87_

考 え られ た 。 実 際 、GGTは 細 胞 密 度 に応 答 して 発 現 し、 分 解 産 物 に よ る フ ィ ー ドバ ック制 御 を 受 けて いた(Fig.6)。 この よ うな 巧 妙 な 分 解 制 御 系 を もつ こ と に よ り、 納 豆 菌 は 定 常 期 の 細 胞 に過 不 足 な く貴 重 な グル タ ミ ン酸 を供 給 で き る と考 え られ た 。 培 地 中 に1∼10mglml生 産 され るYPGAは 、 グル タ ミ ン酸 に換算 す る と8∼ 80mMに 相 当 し、定 常 期 の 細 胞 に と って 十分 な 栄養 源 とな りう る。GGT欠 損 変 異 株 は培 地 中 に蓄 積 したYPGAを グ ル タ ミ ン酸 と して 再 利 用 で きな いた め 、エ ネ ル ギ ー 的 に不 利 で あ る こ とが 予 想 され た。 実際 、GGT欠 損 変 異 株 は 、 定 常 期 に 栄 養 細 胞 と して 存 在 で き な くな り、 野 生 型(1∼2%)よ り高 頻 度(40%以 上) で 胞 子 を 形 成 した(Fig.7)。 窒素 源 が 過 剰 に投 与 され た場 合 、野 生 株 、GGT欠 損 株 と も に胞 子 形 成 率 は 、1∼2%で 差 が な か った 。 これ らの 事 実 は 、YPGAの 細胞 外 栄 養 貯 蔵 物 質 と して の 生 理 的 機 能 を 明 瞭 に示 した と言 え る。 以 上 の 結 果 は 原 著 論 文(2)に 発 表 した 。 第4章D一 グル タ ミン酸 の代謝 に関わ るグルタ ミン酸 ラセ マーゼの機能 YPGAの 最終 分 解 産 物 は 、D・お よ びL一 グ ル タ ミ ン酸 モ ノマ ー で あ る 。 定 常期 に お け るγPGAの 再 利 用 の 際 、D・グ ル タ ミ ン酸 の 資 化 に グル タ ミ ン酸 ラ セ マ ー ゼ が 必要 で あ る と考 えた 。 グル タ ミ ン酸 ラ セ マ ー ゼ はb体 、L体 の グル タ ミ ン酸 を相 互 に変 換 す る酵 素 で 、通 常 は ペ プ チ ドグ リカ ン にD一 グ ル タ ミン酸 を供 給 す る増 殖 に必 須 な 酵 素 と して 働 く。 大腸 菌 な ど 多 くの 細 菌 が 、 一 つ の グ ル タ ミ ン 酸 ラ セマ ー ゼ遺 伝 子 を もつ の に対 し、 βao伽ssμO棚sは2種 類 の グル タ ミ ン酸 ラセ マ ー ゼ遺 伝 子(ハaoε お よ びy胆0遺 伝 子)を も って い る 。2つ の グ ル タ ミ ン 酸 ラ セ マ ー ゼ に機 能 的分 業 、 発 現 時 期 の 違 い な どが あ る か ど うか を 明 らか にす る た め 、 遺 伝 子 破 壊 株 お よ びLacZ融 合 遺 伝 子 を作 成 し、増 殖 、圏YPGA合 成 、D一 グ ル タ ミ ン酸 資 化 能 に及 ぼす 影 響 に つ い て解 析 した 。 ノao瓦yη00の2重 破壊 は0.3mMのD・ グル タ ミ ン酸 を 含 む 最 小 培 地 で の み 可 能 だ った 。また ハacεの 破 壊 は最 少 培 地 で の み 可 能 で あ った が 、y/pCの 発 現 が 富 栄 養 な 培 地 で 抑 制 され て い る こ とが そ の原 因 で あ った 。 納 豆 菌(IBac伽5sαb恥 のa施 ゾ)は 、D・グル タ ミ ン酸 を 唯 一 の 窒 素 源 と して 利 用 して 増殖 で き る 。 しか し、 グ ル タ ミ ン酸 ラセ マ ーゼ の 破 壊 はD一 グ ル タ ミ ン 酸 の 資 化能 を 完 全 に失 わ せ た(Fig.8)。 旦5α わ棚5は ε わaθノηo脚oμ5のD一 ア

ミ ノ酸 代 謝 酵 素D一 ア ミ ノ酸 ア ミ ノ トラ ンス フ ェ レー ス と相 同 な(ア ミ ノ酸 配 列 65%相 同)y々eM遺 伝 子 を持 って いる が 、D一グル タ ミ ン酸 の代 謝 に は 関与 して

いな い こ とが 示 唆 され た 。

YPGAがD一 鏡 像 体 を 多 く含 む こ とか ら、Ashiuchiら は、RacEがYPGA合 成 時 の 基 質(D一 グ ル タ ミ ン酸)供 給 酵 素 で あ り、YrpCが ペ プチ ドグ リカ ンへ のD一 グ ル タ ミ ン酸 供 給 酵 素 で あ る と して い る 。YPGA生 合 成 の 基 質 に 関 して は 議 論 が あ り、Urushibaraら の'ηv1椥 合 成 実 験 で は 、L一鏡 像 体 の み が 基 質 とな りうる と い う結 果 が 示 され て い る。Troyら の βa(ゴ伽s〃 酌eη〃窃m后 膜 画 分 を 用 いた 実 験 で も、L一グ ル タ ミ ン酸 か らの みYPGA合 成 が 進 行 した と報 告 され て い る。 raoε、yノρ0い ず れ の グ ル タ ミ ン酸 ラ セ マ ー ゼ 破壊 もYPGAの 生産 量 、 そ の 鏡 像 体 比 に影 響 はな く、YPGAの 基 質 がL一 グ ル タ ミ ン酸 で あ る とす るUrushibata らの 結 果 を支 持 した 。 以 上 の結 果 は 原 著 論 文(3)に 発 表 した。 第5章 細胞 密度 による合 成制御 ク オ ー ラム セ ン シ ング 遺 伝 子oomQXmの 、oomO、oomXとoo加PのComX 結 合 ドメ イ ン(oomω 《P')は系 統 特 異 的 で 多様 性 に 富ん だ 構 造 を 持 っ で い る 。 実 験 室 株 と納 豆 菌 で は 、近 傍 の ゲ ノ ム 配 列 が ほ ぼ 等 しい に もか か わ らず 、 この 領 域 の 相 同 性 は、30%程 度 しか な い。そ こで 、この 領域 にYPGA発 現 制 御 の 手 が か り、 実 験 室 株 がヤPGAを 発 現 しな い原 因 変 異 が あ るの で はな い か と考 え た 。 納 豆 菌(βac〃 σssσわ撚sのa材oの のoomQXP'を 含 むゲ ノ ム領 域 を 実 験 室 株 タ イ プ に変 換 した キ メ ラ株NAFM41(Fig.9)を 作 製 した と こ ろ、YPGAを 生 産 で き な くな った 。この こ と は、変 換 され た 領域 にYPGA生 産 に必 要 な 遺 伝 子 が あ る こ と示 した 。 そ こ で 、納 豆 菌 ゲ ノ ム 断 片 によ る相 補 試 験 を した と こ ろ 、納 豆 菌 のdegO遺 伝 子 が キ メラ株 のYPGA生 産 を 回 後 す る こ とが 判 明 した(Rg.10)。 納 豆 菌 と実 験 室 株 のdθgQ遺 伝 子 を比 べ る と、 ア ミ ノ酸 配 列 は 完 全 に一 致 し て い る。 しか し、5'上 流 の 制 御 領 域 中 には 、転 写 開 始 点 か ら10bp上 流 に一 塩 基 の 違 い(実 験 室 株 で はC、 納 豆 菌 で はT)が 見 つ か った 。 この 変 異 は 、 実 験 室 株 に お い て プ ロ モ ー タ ー 変 異degQんy36と してMsadekら に よ っ て 報 告 さ れ ・ degOの 発 現 量 を 約50倍 に上 昇 さ せ る 。 この こ とか ら推 察 して ・degOの 発 現 量 がYPGAの 生産 に重 要 だ と考 え た 。そ こで 、納 豆菌 のdegO遺 伝 子 を破 壊 した _gg_

と こ ろ予 想 通 りYPGAの 生 産 能 が 失 わ れ 、逆 に形 質 転 換 能 は上 昇 した(胎ble1)。 46ア ミノ酸 か らな る 小 さな タ ンパ ク質DegQはComAに よ って 正 に転 写 が 制 御 され 、そ の 名 前deg(典gradation)が 示 す とお り、プ ロテ ア ー ゼ 、ア ミラ ・一・ゼ 、 キ シ ラ ナ ー ゼ な ど菌 体 外 に生 産 され る`分 解 酵 素'の 発 現 に 必 要 な こ とが 知 ら れ て いる が 、 実 験 室 株 にお いて も細胞 内 で の 具 体 的 機 能 は不 明で あ る。 DegQの 機 能 を 明 らか に し、 細 胞 密 度 応 答2成 分 制 御 系ComP・ComAか ら YPGA生 産(合 成 酵 素oaρ β(訊 の発 現)へ の情 報 の 流 れ を 解 明 す るた め 、degQ 破壊 株 のYPGA生 産 を 回 復 させ る抑 制 変 異 の 同 定 を試 み た 。 同 定 した6つ の 復 帰 変異 はdegS遺 伝 子 に見 つ か った 。DegSはDegUと2成 分 制 御 系 を構 成 し、DegSは レス ポ ンス レギ ュ レー タ ー で あ るDegUを リン酸 化 ・脱 リン酸 化 す る こ とが 知 られ て い る。6つ の 復 帰 変 異(M951,R208Q,D245N, L248FD249qD250N)は す べ てdegSの カ イ ネ ース ドメイ ン に起 こ って いた 。 DegQとDegSに 遺伝 学 的 な 関 連 が あ る こ とが 初 め て 明 らか にな り、DegQの 機 能 がDegSの リン酸 化 能 の制 御 に関わ る こ とが 示 唆 され た 。 dθg3お よ びdθg{ノ のYPGA生 産 へ の 関 与 を 確 認 す る た め 、 そ れ ぞ れ の 遺 伝 子 破 壊 株 を作 成 した と こ ろ 、い ずれ の 破 壊 株 もYPGAを 生 産 で き な くな った 。また 、 degU破 壊 株 で のoaρ オ ペ ロ ンの 発 現 をCapB-LacZ融 合 遺 伝 子 の 発 現 量 で 調 べ た とこ ろ、 定 常 期 で の 発 現 を 完全 に失 って いた(Fig.11)。

DegQがDegSか らDegUへ の リン酸 リレー を活 性 化 し、 活 性 化 型 転 写 因 子 DegU-Pの 量 を 調節 して いる と考 え る と(Fig.12)、DegU-Pの 増 加 が 形 質 転 換 能 を 負 に制 御 す る こ とが 知 られ て い るの で 、この 推 察 は 、YPGA生 産 性 と形質 転 換能 が 反 比例 の 関 係 にあ る こ と(穐ble1)を よ く説 明 で き る。

DegUは 転 写 因子 で あ る の で 、DegUが 直 接YPGA合 成 酵 素 遺 伝 子oaρ βG4を 制 御 して いる か ど うか につ いて ゲ ル シ フ ト法 に よ り検 討 した 。大 腸 菌 生 産DegU タ ンパ ク質 は 、oaρβ(訊 オ ペ ロ ン5'上 流 一497(転 写 開始 点 を+1と す る)ま で の 領域 と結 合 す る こ とが確 認 され た 。 DegQとDegS-DegU2成 分 制 御 系 は 、 栄養 畿 餓 に応 答 して 発 現 し、分 解 酵 素 の発 現 を 誘 導 す る こ とが 知 られ て い る。YPGA合 成 が 細 胞 の 凋 密 さ によ る制 御 (ComP-ComA)と 栄 養 条 件 に よ る調 整(DegS-DegU)を 受 け て いる こ と、実 験 室 株 に お い て も具 体 的機 能 が 不 明 で あ ったDegQが2成 分 制 御 系DegS-DegU の リ ン酸 リ レー系 の 制 御 に 関わ る こ とを 初 め て 遺 伝 学 的 に証 明 した 。 一90一

結論

本博士論文では次の ことを明 らか に した。 1)YPGAは フ ァー ジの 増 殖 を阻 害 す る防 御 機能 を 持 ち 、YPGA生 産 菌 で増 殖 で き る フ ァー ジはYPGA分 解 酵 素(PghP)を 生 産 す る 。納 豆 菌 フ ァー ジΦNIT1が 生 産 す るPghPの1次 構 造 を決 定 した 。 2)YPGAは 定 常 期 の 細 胞 に と って 菌体 外 栄養 貯 蔵 と して の機 能 を持 つ 。 Y-glutamyltransferase(GGT)は 、YPGAのN末 端 か ら鏡 像 体 の 区別 な くグル タ ミ ン酸 を 遊 離 し、定 常 期 の 細 胞 に窒 素 源 と して供 給 す る 。YwrDはYPGAの エ ン ド型分 解 に 関 与 し、GGTの 基 質 で あ るYPGA分 解 中 間体 の生 成 に必須 で あ る。 3)D一 グル タ ミ ン酸 の 資 化 に グル タ ミ ン酸 ラ セ マ ー ゼ が 必 要 で あ る 。 グル タ ミ ン酸 ラ セ マ ー ゼ は ペ プ チ ドグ リカ ン にD一 グ ル タ ミ ン酸 を供 給 す る ア ナ ボ リックな 酵 素 で あ る と同 時 に、D・グル タ ミ ン酸 を代 謝 す る た め の カ タ ボ リ ック な酵 素 で も あ る。 4)菌 体 外 クオ ル モ ンComXの 細 胞 密 度情 報 は 、ComP-ComA2成 分 制 御 系 を介 してDegQの 発 現 を 誘 導 し、DegQは 栄 養 応 答 性 の2成 分 制 御 系DegS-DegUの リ ン酸 化 状 態 を制 御 す る。

5)DegUは 直接YPGA合 成 酵 素 遺 伝 子caρ θ(訊の プ ロモ ー タ ー に結 合 して 発 現 を 誘 導 す る。

原 著 論 文 (1)KimuraK.andY.Itoh.2003.Characterizationofpoly-y-glutamate hydrolaseencodedbyabacteriphagegenome:Possiblerolesinphage infectionofBacillussubtilisencapsulatedwithpoly-y-glutamate. メψ ρ 〃.Eカv7'mη.ル 〃ごroわ わ ∴69=2491-2497. (2)KimuraK.,L-S.P.Tran,1.Uchida,andY.ltoh.2004.Characterizationof Bacillussubtilisy-glutamyltransferaseanditsinvolvementinthe degradationofcapsulepoly-Y-glutamate.M'σmb'o'o動 〆150=4115-4123. (3)KimuraK.,L-S.P.,Tran,andY.Itoh.2004.Rolesandregulationofthe glutamateracemaseisogenes,faoεandyη)C,in8ac1伽ssσ わ酬3・ ル〃cκ)b'010gy150=2911-2920.. (4)KimuraK.,Y.inatsu,andY.Itoh.2002.Frequencyoftheinsertion

sequenceIS4βsμIamongβao〃 如ssuわ 棚sstrainsisolatedfromfermented soybeanfoodsinSoutheastAsia.Biosci.Biotechnol.Biochem.66: 1994-1996. 参 考 論 文 ・ 著 書 な ど (1)KimuraK,,A.Nagasawa,M.Fujii,andY.ltoh.2002.CloningofthepepX geneofLactobacillushelveticusIFO3809encodingsalt-tolerantX-proryl dipeptidyiaminopeptidaseandcharacterizationoftheenzyme.J.Biosci. Bioengi.93:589-594. (2)lnatsuY,KimuraK.,andY睡oh.2002.Characterizationorβao'伽ssσb翻s

strainsisolatedfromfermentedsoybeanfoodsinSoutheastAsia:

ComparisonwithB.subtilis(natto)starterstrains.JARQ(JapanAgricultural

Researchquarterly).36:169-175.

(3)MurakamiA.,K.Kimura,A.Nakano.1999.Theinactiveformofayeast

caseinkinaseIsuppressesthesecretorydefectofthesec12mutant:

一92一

ImplicationofnegativeregulationbytheHrr25kinaseinthevesiclebudding fromtheendoplasmicreticurum.」.β わ'.0力em.274:3804-3810. (4)ArahiraM.,N.V.Hai,K.Kadakura,K.Kimura,K.Udaka,andC. Fukazawa.1998.Molecularcloningandexpressionpatternof Cu/Zn-superoxidedismutaseindevelopingSoybeanseeds.Biosci. 8わ おcね ηo乙 β'oo力eπ7,62=1018-1021∴ (5)SaitohY.,K.Kimura,T.Oka,andA.Nakano.1998.Activitiesofmutant Sarlproteininguaninenucleotidebinding,GTPhydrolysis,andCell-free transporttothegolgiapPara加s.J.」Bわo/7θm.124=816-823, (6)NakanoA.,M.Yamagishi,E.Yamamoto,K.Kimura,S.Nishikawa,andT. Oka.1994.MutationalanalysisofSarlprotein,asmallGTPasewhichis essentialforvesiculartransportfromtheendoplasmicreticurum.」.β わoねem. 116:243-247. (7)KimuraK.,andY.Itoh.Phisiologicalrolesofcapsulepoly-y-glutamatein βao〃ussα わf茄5.0己 〃7「εηfηeηds加M晒orob'o乙ln-press. _, (8)ItohY.,andK.Kimura.2003.Biosynthesis,degradation,physiologicalroles ofcapsularpoly-gamma-glutamicacidinBacillussubtilis.RecentResearch Dev.Bacteriol.1:301-309.

(9)KimuraK.,T.Oka,andA.Nakano.1995.Purificationandassayofyeast

Sarlp.MethodsinEnzymology257:41-49.

(10)木 村 啓 太 郎 、伊 藤 義 文.2002.ポ リグ ル タ ミ ン酸 を介 した納 豆 菌 と フ ァ ー ジ の 攻 防 .バ イ オ サ イ エ ン ス と イ ン ダ ス ト リー60=107-108. (11)伊 藤 義 文 、木 村 啓 太 郎.2002.納 豆 の 糸 引 き成 分 の合 成 開 始 物 質 の 発 見 と今 後 の 展 望.ブ レイ ンテ ク ノニ ュー ス90=18-21. 一93一

(12)木 村啓 太 郎 、 伊 藤 畿 文.2002.γ 一ポ リグ ル タ ミ ン酸 分 解 酵 素 欠 損 変 異 株 、 そ の 取 得 法及 び 該 変 異 株 を 用 いた γ 一ポ リグル タ ミ ン酸 の製 造 法.

工 業 所 有 権P2003-230384A

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図9実

験室 株 と納豆 菌のCO伽 遺伝 子領域の 交換

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産 の相補 試 験

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野生 型

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國12γPGA生

産 へ 至 る細 胞 密 度 情 報 の 流 れ(概 念 図)

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論 文 審 査 結 果 要 旨

DL† ポ リ グ ル タ ミ ン 酸(γPGA)は,グ ル タ ミ ン 酸 が γペ プ チ ド結 合 で つ な が っ た 高 分 子 で, 80ご'〃粥 属 細 菌 の 黄 膜 を 構 成 し て い る 。 納 豆 菌(Bacillusstubtilisvar.natto)が 作 る γPGAは 分 子 量 が 2MDaを 超 え,吸 水 性,保 湿 性,粘 性,金 属 イ オ ン 結 合 性 な ど の 性 質 を 持 つ こ と か ら,食:品,化 粧 品 な ど に 応 用 さ れ て い る 。 ま た,放 射 線 照 尉 に よ っ て ゲ ル 化 す る の で,生 分 解 性 高 分 子 材 料 と し て も 注 目 され て い る 。 一 方,γPGAは 炭 ソ菌(β αcf〃耶 βπ伽 αoj∫)の 感 染 因 子 で あ り,基 礎 微 生 物 学 的 に も 重 要 な 機 能 を も っ て い る と考 え られ て い る 。 納 豆 菌 の γPGA生 産 は,培 養 条 件 に 大 き く影 響 さ れ,且 つ, 再 現 性 や 生 産 量 の 安 定 性 が 低 い 。 納 豆 菌 に よ る γPGA生 産 の 微 生 物 学 的 背 景,と りわ け,γPGA合 成 酵 素 の 発 現 制 御 と 生 産 菌 自 身 に よ る γPGA分 解 系 に は 不 明 な 点 が 多 い 。 本 研 究 者 の 所 属 す る研 究 室 で は,納 豆 菌 の γPGA合 成 が 細 胞 密 度 に よ る制 御(ク オ ー ラ ム セ ン シ ン グ) を 受 け る こ と を 明 ら か に し,遺 伝 学 的 手 法 に よ る γPGA研 究 を 可 能 に し て き た 。 こ の よ うな 背 景 か ら 本 研 究 者 は,γP(込 の 合 成 お よ び 分 解 の 仕 組 み とそ の 制 御 機 構 の 全 容 を解 明 し,そ の 微 生 物 学 的 意 義 を 明 ら ふ に し た 。 本 審 査 論 文 に お い て 本 研 究 者 は,以 下 の 事 実 を 明 ら か に した 。 す な わ ち,(1)γPGA合 成 酵 素 遺 伝 子c4P8cAの 発 現 制 御 系 が ・Comx-ComP-ComA-DegQ-DegS-Degu-cap3CAか ら な る 情 報 伝 達 系 を 構 成 し,γPGA合 成 が 細 胞 密 度 と栄 養 条 件 に よ っ て 精 緻 に コ ン ト ロー ル され て い る こ と,(2)4889遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー 変 異 が,実 験 室 株(Bacillussubtilis168)の γPGA非 生 産 性 の 理 由 の ひ とつ で あ る こ と,(3)機 能 不 明 で あ っ たDegQが,Degsの リ ン 酸 化 能 の 制 御 に 関 わ る こ と,(4)γPGA生 産 量 の 不 安 定 性 の 原 因 が,YwrD,GGT,RacElYrpCが 関 与 す る 定 常 期 後;期 に 起 こ る γPGAの 分 解 ・再 資 化 の 作 用 で あ る こ と,(5)GGTが γPGAのN末 端 か ら鏡 像 体 の 区 別 な く グ ル タ ミ ン 酸 を 遊 離 す る 活 性 を 持 ち,ComP-ComA二 成 分 制 御 系 に よ る 細 胞 密 度 に よ る 発 現 制 御 を 受 け る こ と,(6)YwrDがGGT の 基 質 と な る 分 子 量0.iMDaの γPGA分 解 中 間 体 の 生 成 に 必 要 な こ と,(7)グ ル タ ミ ン 酸 ラ セ マ ー ゼ

(RacEお よ びYrpC)がD一 グ ル タ ミ ン酸 の 資 化 に 必 要 な こ と,(8)γPGAが バ ク テ リオ フ ァ ー ジ に 対

す る 防 御 機 能 と 栄 養 貯 蔵 物 質 と して の 機 能 を 持 つ こ と,(9)γPGA生 産 菌 に 感 染 し増 殖 で き る バ ク テ リオ フ ァ ー ジ が γPGA分 解 酵 素(PghP)を 生 産 す る こ と,お よ び(10)バ ク テ リ オ フ ァ ー ジNIT1の p8んP遺 伝 子 の 塩 基 配 列 の 決 定,で あ る 。 以 上 の よ う に 本 研 究 は,細 胞 密 度 に よ る γPGA合 成 制 御 系,定 常 期 後 期 に お け る 分 解 系,お よ び γPGAの 微 生 物 学 的 機 能 を解 明 した も の で あ り,審 査 員 一 同 は,本 研 究 者 に 博 士(農 学)の 学 位 を 授 与 す る に 値 す る も の と認 定 した 。 一102一