(Bacillus subtilis)
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(2) プ ロ ビ ッ ト理 論 と 標 的 論 を 利 用 した 枯 草 菌(Bα6ゴ 〃z4ssz4∂が1広s)Rec‑assay液. ロ ニ ー数 をMutation‑gram(Muトgram)と. 体法 の評価 方 法. 173. して提案. 5)Background濁. 度 を 測 定 す る。. し て い る。 一方 ,枯 草 菌(Bo16ゴ11Z4SSZ4ろガ1客3)を利 用 す る致 死 感. 6)37℃,71rpmで. 振 盤 培 養 す る。. 受 性 試 験 で あ るRec‑assay液 DNA損. 体 法 で は,検. 7)一. 8)検. 傷 性 強度 を論 じる指標 は未 だ確 立 され て いな. い 。従 来 ま で は,検 定 試 料 のDNA損 とRec一 の50%致. よって 議 論 して き. た 。 しか し,こ の 指 標 が,Rec・assay液 分 に 合 致 し,検 定 試 料 のDNA損. DNA損. り適 切 な. 傷性 指標 の 導 入を試 み る。. ン トロ ー ル の 濁 度 に 対 す る検 定 試 料 各M濃度 の Monodtubeの. 傷 性 強 度 を 適切 に表. 体 法 の 原 理 を再 吟 味 し,プ. Rec‑assay液. 水 に難 溶 性 の 検 定 試 料 はDMSO(dimethylsulfoxL de):水(1:9)溶. 成 をT&b盈e1に. 体 法 は,検 定 試 料 と枯 草 菌 を 液 体 系 で. 原 物 質 をDNA損. の増 殖 阻 害 の 差 に よ っ て,変 異. 傷 性 物 質 と し て 検 出 す る 方 法 で あ る。. 本 研 究 室 で 実 施 し て い るRec‑assay液 (S‑9)Rec‑assayPreincubation法 assayStationary法. の2種. 体 法 に は,液 体. が あ る3)。. 製)中. は,検 定 殖(複 製)を は,. 影響 を及 ぼす検 定. トン59,粉. 20min)し. 体(S‑9)Rec‑ass&y蹴at亘o鷺a野. こ の た め,Preincubation中. 法 で は,枯. 製)中. の 菌(DNA)に. 定 試 料 のDNA損. (DNA)と. 粉 末 酵 母 エ キ ス39,ポ. リペ プ. 水1,000mlに. 傷 性 を検 出 す る に は有 利 な 方 法 で あ 増 殖(非. た も の〕 を 用 い て 振 盤 培 養. (MonodWaterBathTypeDG40C;富. 〔71rpm. 複 製)中. 必 要 が あ る。 そ こ で,前. 複 製 を抑 制 す る. 培 養 菌 液 をTris。HCI緩. 〔tris(hydroxymethyl)aminomethane23.49を 溶 解 し,1NHC1に. よ りpH7.0に. 衝液. 水1,000 調 整 〕で 希 釈 す. 考 案 した 。 と 同 様 で あ る。. 2.3検. 定試料. DNA損. 傷 陰 性 対 照 物 質 と し てkanamycin(KM;. Table. の菌. 傷 性 を検 討 す. の 増 殖 お よ びDNAの. 武 田 工 業 株 式 会 社)を. 調 整 後 高 圧 蒸 気 滅 菌(120℃,. は,. 対 し て 作 用 を及 ぼす 検. 反 応 す る検 定 試 料 のDNA損. る た め に は,菌. 草. 使 用 し て い る。. に 菌 の 増 殖 お よ びDNA. 以 下 の操 作 はPreincubation法. 末 酵 母 エ キ ス59を. 溶 解 し,pH7.0に. 2.2液. る方 法(Stationary法)を. 腿bat量O醜法. 実験 手順 を 以下 に示 す。 1)Nutrientbroth〔. た。. mlに. 試 料 に 対 し て検 出感 度 の 高 い 方 法 で あ る 。 体(S・9)Ree‑assayPrdn￠. 同 時 誘 導4九5)によ り調 整 し. る と考 え ら れ る。 し か し,非. し て い な い 状 態 に あ る。し た が っ て,Stationary法. 2。1液. 一naphtoflavone)の. に複 製 が 生 じて い る。した が っ てPreincubation法. 試 料 に 暴 露 され る 枯 草 菌(DNA)は,増. の 菌(DNA)に. とNF(β. 後)を 利 用 し,PB(phenobarbita1). 増 殖(複. 傷)を 及 ぼ す 検 定 試 料 を 低 濃 度 で. 複 製)中. 雄. ラ ッ ト(体 重1009前. 反 応 させ る 方. 検 出 す る こ とが で き る。 一方 ,液 体(S‑9)Rec‑assayStationary法. 非 増 殖(非. 組. 画 は,Fischer系. の菌(DNA). の 枯 草 菌(DNA)と. に増 殖 阻 害(DNA損. 傷 性 検 出 の た め に 必 要 なS.9mixの 示 す 。 な お,S‑9分. 菌 前 培 養 液 の 希 釈 にNutrientbrothを は,検 定 試. 法 で あ る。 こ の 方 法 は,増 殖(複. 液 に溶 解 し て 使 用 す る。. 液 体(S‑9)Rec‑assayPreincubation法. と液 体(S.9)Rec‑. 液 体(S‑9)Rec‑assayPreincubation法 料 を 増 殖(複 製)中. して算 出す る。. 用 す る。. 体 法. 反 応 さ せ,Rec+とRec一. 濁 度 の 比 を 生 存 率. (surviva1;%)と. 間 接DNA損 2。DRee‑assay液. 間 毎). 定 試 料 を 含 ま な い コ ン トロ ー ル の 濁 度 が100. 9)コ. 現 す る も の で あ る か 否 に つ い て は 議 論 の 余 地 が あ る。 本 論 文 で は,Rec‑assay液. で1時. 濁 度 を測 定 す る。. 体 法 の 原 理 に充. ロ ビ ッ ト理 論 お よ び 標 的 論 を 応 用 し て ,よ. 毎,Rec一. に 達 し た ら,振 湯 を終 了 し,全Monodtubeの. 傷 性 の有 無 をRec+. 死:濃 度 比R50に. 定 時 間 毎(Rec+で30分 に 濁 度 を 測 定 す る。. 定試料の. 採 用 した 。 Composition. of S-9mix. 士 製作. 所)〕 した 対 数 増 殖 状 態 の 枯 草 菌 前 培 養 液 〔濁 度 40〜60(ク. レ ッ トエ マ ソ ン濁 度 計 単 位,赤 色 フ ィ. ル タ ー使 用)〕 をNutrientbrothで. 濁 度0 .2に な. る よ うに 希 釈 す る。 2)Monodtubeに. 検 定 試 料0.6ml,100mMNa一. ン酸 衝 液(あ 0.3m1を 3)振. る い はS‑9mix)0. .1ml,希. 釈菌 液. 順 次 注 入 す る。. 盤 せ ず にPreincubation(37℃,1hr)す. 4)Nutrientbroth5m1を. Vol.8No.3(1985). リ. る。. 注 入 す る。. 33.
(3) 論. 174. ま た,陽 (MMC;協. 文. 性 対 象 物 質 と し て は,mitomycin‑C. る と考 え られ る。 した が っ て,R50の. 和 醗 酵 工 業 株 式 会 社),N‑methy1‑N仁nitro‑. 試 料 相 互 のDNA損. N‑nitrosoguanidine(MNNG;和. 光純薬工業株 式会. 社),Benzo(a)pyrene(B(a)P;半. 井化 学薬品株式 会. 社),acethylaminofluorene(AAF;半. 式 会 社)の5種. で き ない。 3.2プ. ロ ビ ッ ト理 論(PrObit餓eory)に. 井化 学薬 品株 式. 会 社),dimethylnitrosamine(DMN;和. 光 純薬 工業 株. 3.2。1プ. ロ ビ ッ ト理 論6あ7)とそ の 適 用. 死D濃度 比(R50)に. の通 りで あ る が,こ 3。 評 価 方 法 3.150%致. よ るプ ロ. ビ ッ ト間 面 積(S‑prObit)とRec‑gram. 50%致. を採 用 し た 。. よる評価 方法 の欠 点 は前述. れ ら の うち,第2番. 目 の 欠 点 を補. う こ と を 目的 に プ ロ ビ ッ ト理 論 を 導 入 す る。 プ ロ ビ ッ ト理 論 は次 の2つ. 死 濃 度 比:R5O. 枯 草 菌 の 野 生 株Rec+と. 組み換 え修復能 力欠損 株. Rec一 は,検 定 試 料 にDNA損. 傷 性 が あ る場 合,同. 1)あ. に 対 す る抵 抗 性(も. 一濃. の 仮 定 に 基 づ い て い る。. る生 物 の 集 団 に お い て外 部 よ りの 有 害 な 刺 激 し くは 感 受 性)は. 度 の 検 定 試 料 に 暴 露 さ れ た と き に は,当 然 致 死 感 受 性. 関 数 に つ い てLD50(50%LethalDose;50%致. が 異 な っ て く る。 した が っ て,縦. 死 濃 度)を. 対 す る 生 存 率 を,横. 軸 に コ ン トロ ー ル に. 軸 に 検 定 試 料 濃 度 の対 数 を 取 っ て. 2)仮. 増 殖 阻 害 曲 線 を 描 く とDF量91の よ うに な る 。 こ こで,検 定 試 料 のDNA損 Rec+とRec一. の そ れ ぞ れ の50%生. 存 率 に対応 す る致 死. の50%致. (1)式 で 示 さ れ るR50(50%致 DNA損. 死 濃 度) 一 死D濃 度). (1). 死 濃 度 比)に. よって. な お,こ. の 考 え方 は,生 物 に 見 られ る形 態 的 な変 異. で あ ろ う とい う経 験 的 類 推 に よ る も の で あ る。 以 上 の 仮 定 の も とに,Rec‑assay液. の 方 法 に は 以 下 に掲 げ る 問 題 点 が 存 在 す. 殖 阻 害 曲 線 が 十 分 に 描 け な い 場 合 は適 用 す る. し,こ. 体 法 の実験 結 果. を プ ロ ビ ッ ト理 論 に 適 用 す る こ とを 考 え る と,数 学 的. P(x)=. 1-S(x) =~(a+/3. logx). た だ し,. こ とが で ぎ な い 。 2)R50は. ば し ば刺 激 量 の 対 数 の形 を. と る。. る。 1)増. 中心 として正規 分布 を してい る。 正 規 曲線 の横軸 を決 定す る関係 は幾. に は次 式 の よ うに 表 現 さ れ る。. 傷性 を評 価す るわ けであ る。. し か し,こ. 刺激量の. が 正 規 分 布 を す る とい う こ とか ら,生 理 的 性 質 も 同 様. C50Rec+(Rec+の50%致 C50Rec一(Rec一. 定1)の. 何 関 数 で あ っ て,し. 傷 性 を評 価 す る た め に,. 濃 度 が 比 較 さ れ る, R50 =. みで検 定. 傷性 強度 を比較 す る こ とは. κ:検. 定試 料濃 度. 増 殖 阻 害 曲 線 図 か ら読 み 取 られ る 。 しか. P(κ):κ に 対 応 す る 死 亡 率. の 増 殖 阻 害 曲線 図 は 人 為 的 に 描 か れ る た. S(x):κ. に対応 す る生存 率. め 誤 差 の 入 る可 能 性 が 大 きい 。 3)検. 定 試 料 のDNA損. 傷 性 を評 価 す る た め の パ ラ. メ ー タ と し て は,R50で. 代 表 さ れ るRec+と. Y. R㏄ 一の 致 死 感 受 性 差 の他 に,増 殖 阻 害 濃度 レベ ル が 存 在 す る。つ ま り,R50が. = a +/3 logx. α,β:正. プ ロ ビ ッ ト値. 規 分 布 の母 数 を 示 す パ ラ メ ー タ. 同 じ値 で あ って も,. した が っ て 実 験 デ ー タ か ら最 尤 法 に よ っ て モ デ ル の. 検 定 試 料 に よ っ て 増 殖 阻 害M濃度 レ ベ ル が 相 異 す. 母 数 α,β を 推 定 す れ ば よい 。 そ の た め の コ ン ピ ュ ー タ ・プ ログ ラ ム は 既 に 開 発 され て い る。 な お,本 で は,金. 論文. 沢 大 学 計 算 機 セ ン タ ーSAS(Statistical. AnalysisSystem,ProbitProcedure)を 利 用 した 。 コ ソ ピ ュ ー タ ・プ ロ グ ラ ム を 利 用 し て 計 算 す る場 合 , 50%致. 死M濃度 は 自動 的 に 算 出 され る。 し た が っ て,こ. の 値 を 利 用 し てR50を. 求 め れ ば,グ ラ フ か ら 目測 す る. こ と に よ って 生 じ る 個 人 誤 差 は 取 り除 く こ と が で ぎ る。 3。2。2プ. ロ ビ ッ ト間 面 積(S‑prOb髭)とRec‑gra㎜. プ ロ ビ ッ ト理 論 を 適 用 し,デ Fig.. 34. 1. Rec-assay of DNA damaging subtilis in the liquid-cultivation. agent by Bacillus method.. る こ とで,R50算. ータ を統計 的 に処理 す. 出に伴 な って個人 誤差 が発 生 す る と. い う欠 点 は 改 善 され る。し か し,Rec+とRec}の. 致死 感. 水質汚濁研究.
(4) プ ロ ビ ッ ト理 論 と標 的 論 を 利 用 した 枯 草 菌(13010ガ〃z4ssz4ろガ1ゑs)Rec‑assay液. 受 性 差 をR50に 互 のDNA損. よ っ て 比 較 す る だ け で は,検 定 試 料 相. 傷 性 強 度 を論 じ る こ と は で き な い 。 つ ま. り,増 殖 阻 害 濃 度 レ ベ ル の相 異 を 考 慮 す る必 要 が あ る わ け で あ る。 ま た,検 同 じ で も,50%致. 定 試 料 に よ っ て は,R50の. Rec‑gramは. 次 の 様 に 算 出 され る。. プ ロ ビ ッ ト値 が. 値 は. 差 が 生 じ る も の も存 在 す る。. 175. (DF量g。2参 照)。. Rec+ : Y = a'1+Ql logx. 死M濃度 の 前 後 に お い て,生 存 率(増. 殖 阻 害 曲線 の形 状)に. 体 法 の 評価 方 法. Rec- : Y=«2+. f2logx. の と き,S‑probitは. こ れ ら の 問 題 を解 決 す る た め に は, DNA損. 傷 性 強 度=f(Rec+とRec一. の 致 死 感 受 性 差,増. 殖 阻 害 濃 度 レ ベ ル)(3). (4). と な る よ う な指 標 を 考 案 し な け れ ば な ら な い 。 本 論 文 で は,プ. ロ ビ ッ ト理 論 を 応 用 し て,(3)式 の よ う な指 標. た だ し,. の導 入 を 試 み る 。 増 殖 阻 害 曲 線 図 に お い て,Rec+とRec一 よ っ て 囲 ま れ る部 分 の 面 積 は,DNA損. の曲線 に 傷 性 物質 の暴. 4:84.1%死. 亡 率 に 対 応 す る プ ロ ビ ッ ト値. 6:15.9%死. 亡 率 に 対 応 す る プ ロ ビ ッ ト値. と な り,Rec‑gramは. 露 に よ る致 死 感 受 性 差 を 示 す も の で あ る と考 え れ ば, R50の. み に よ っ て は 検 討 が 不 十 分 で あ っ たDNA損. 性 の 強 度(た. だ し,こ. の 場 合 は増 殖 阻 害 濃 度 レベ ル に. つ い て は考 慮 して い な い)を る。 この 面 積 をDNA損 感 受 性 差 面 積Sと. DNA損. 評 価 す る こ とが 可 能 で あ. 3.3標. 的 論(Target麟d脳t軌eOry)に. プ ロ ビ ッ ト値Yを. る。. 対応す るプロビヅト. 求 め る。 な お,実. 際 にS‑probitを. 量tRepair翻s蟹viva且;. 的 論8)と そ の 適 用. か ら検 定 試 料 のDNA損. 利 用 し てSに. 単位. 放 射 線 生 物 学 の 分 野 で 用 い られ て い る標 的 論 の 立 場. 図 よ り算 出 す る こ と は現 実 に は 容 易 で は な い 。そ こ で,. 間 面 積(S‑probit)を. よ る修 復. UDRS) 3.3.1標. 増殖 阻 害 曲線. (5). 修 復 可 能 生 存 率(U醜. して. 傷 性 強 度 を 一 律 に表 現 す る 。. しか し な が ら,致 死 感 受 性 差 面 積Sを. S-probit C50Rec-. .可能 生 存 率(Rep諭eds蟹v量va丑;RS)と. の50%. で 除 し,こ れ をRec‑gramと. =. と な る。. 傷 性物 質暴 露 に起因 す る致 死. す る。さ ら に,こ のSをRec一. 致 死=濃度(C50Recう. Rec-gram. 傷. 標 的 論 に よれ ぽ,細. 傷 性 を検 討 す る こ とを 試 み. 胞 内 に は 標 的(target)と. 呼 ばれ. 求 め る場 合,死 亡 率0%や100%な. ど の 不 正 確 な情 報 を. る細 胞 の 機 能 に と っ て きわ め て 重 要 な 箇 所 が あ る 。 放. 除 外 す る意 味 で,死. 亡 率15.9%か. ら84.1%の. 射 線 や 化 学 物 質 な ど に よ り酵 素 や 核 酸 の 失 活,細. 規 分 布 に お け る1σ. の 値)で 計 算 を 行 な う こ と とす る. Fig.. Vo1.8No.3(1985). 2. 範 囲(正. 胞の. 死 な ど が 生 ず る の は,こ の標 的 に ヒ ッ ト(hit)が 生 じ た. Relation between S(area of lethal sensitivity differences between Rec+ and Rec-) and S-probit(area of probit differences between Rec+ and Rec-). 35.
(5) 176. 論. 文. 場 合 に 限 ら れ る。細 胞 に 作 用 源 を 作 用 さ せ た と き,細 胞. 標 的 に 平 均1個. の 標 的 内 に平 均 λ個 の ミ ク ロ な 決 定 的 事 象(hit)が 生 ず. に な る 。 よ っ て,37%生. る とす る 。ヒ ッ トはallornoneの. 料 濃 度 を 平 均 致 死 濃 度(meanlethaldose),ま. 型 で 中 間 の型 は存 在 せ. ず,し か も互 い に 独 立 に 生 成 され λ の 値 は 小 さ い も の と す る。 こ の 仮 定 が 成 立 す れ ば,あ. る特 定 の 標 的 に実. 際i個 の ヒ ッ トが 生 ず る確 率P(i)は,次. 式 の ボア ソン. 分 布 に従 う。. 37%生. の 致 死 ヒ ッ トが 生 じ て い る と い う こ と. 存 率 濃 度C37と. 存 率 に対 応 す る と き の 検 定 試. ま た,(8)式 に お い て はn=2の ヒ ッ トモ デ ル の 場 合 は,標. 細 胞 の 生 存 率Sが. ヒ ッ ト数 λ の ど うい う関 数 に な. 同 様 に して,nヒ 平 均 致 死 濃 度Csnを. る こ と を 考 慮 に入 れ る と,λ(ヒ. Rec‑assay液. 濃 度)と. ッ トモ デ ル. つ ま り,検 定 試 料 に よ っ て,1ヒ ッ トで機i能を 阻 害 さ れ る と仮. 定 す る と,生 存 率Sは. 次式 で表 わ され る。. S=exp(-A,). (7). 標 的(DNA)の. 以 上 の ヒ ッ トで は 次式のよ. うに な る。. ッ トに対 応 す る濃 度. た が っ て,こ. こに,次. k(k>0)を. 導 入 す る。. 式 で 表 わ され る ヒ ッ トi換算 係 数. 大 き いkの DNAに. 値 を 有 す る 検 定 試 料 は,低. い=濃 度 で. 多 く の ヒ ッ トを 及 ぼ す こ と が で き る と解 釈 さ. れ る。. (g) ッ トモ デ ル お よ び 多 重 ヒ ッ トモ デ ル の. 理論 曲線 を示 す。. こ のkの. 値 を 用 い て,(7)式,(8)式. を 書 き換 え る と,. そ れ ぞ れ 次 の よ うに な る 。 i)1ヒ. ッ トモ デ ル の場 合. S=exp(-kx). (7)式で 表 わ され る の は,1ヒ. 0.3678…. 定試 料. い う代 入 の 仕 方 は 妥 当 で あ る とは 言 い 難 い 。. A =kx. 不 活 性 化 はn個. じめ て起 こ る と仮 定 す る と,生 存 率Sは. DF且9。3に1ヒ. の作用 機序 が 異 な ッ ト数)=κ(検. が 相 異 し て い る と解 釈 した 方 が よい と考 え ら れ る。 し. ii)多 重 ヒ ッ トモ デ ル. と(す. 体 法 の 実 験 結 果 に こ の標 的 論 を 適 用 す. 定 試 料 に よ っ てDNAへ. と し て モ デ ル の 展 開 を 行 な う。. 標 的(DNA)は1ヒ. 場 合 に も,. 求 め る こ とが 可 能 で あ る 。. 1本 鎖DNAで. あ る。した が っ て,以 下 に お い て は 標 的. 存 濃 度C41. ッ トモ デ ル(n≧3)の. る場 合,検. る 。 い ま,仮. な わ ち,2 の致 死 ヒ ッ ト. を 用 い る。. る か は,細 胞 内 の 標 的 の 数 と標 的 の 性 質 を 仮 定 す る と 一 義的 に決 まる 。 我 々 が 問 題 とす る標 的 は,枯 草 菌 の. i)1ヒ. 場 合,す. 的 に 平 均2個. を 生 ぜ し め る 平 均 致 死D濃度 と して41%生. (6). の数 は1個. たは. 呼ぶ 。. に 平 均1個. ッ トモ デ ル の場 合 で あ. ii)nヒ. (10). ッ トモ デ ル の 場 合. の致 死 ヒ ッ トが 標 的 に 生 じ る. な わ ち λ=1),生. (11). 存 率 はS=exp(一1)=. とな る 。 した が っ て,生 存 率 が37%の. と き,. 以 上 の考 え方 に基 づ い て,Rec‑assay液. 体 法 の実 験. 結 果 に 標 的 論 を 適 用 す る た め の フ ロ ーチ ャ ー トを DFig。4に 示 す 。 (10)式,(ll)式に お け るkの. 値 を 算 出 す る 際 に は,最 小. 自乗 法 を 適 用 す る。 した が っ て,こ. の場 合 も,個 人 誤. 差 の 影 響 は除 外 で き る 。 この よ うに し て,標 的 論 に お け る 増 殖 阻 害 曲 線(DFig 。 3参 照)の. 横 軸 を ヒ ッ ト数 で 表 現 し て 無 次 元 化 す る こ. と に よ っ て,DNA損. 傷 性 強度 評価 の際 の各 検 定試 料. 相 互 の 増 殖 阻 害 濃 度 レ ベ ル の 相 異 の 問 題 は,一. 応M解決. 可 能 となる。 3.3.2修. 復 可 能 生 存 率(Repaireds駆viva亙;DRS) と単 位 修 復 可 能 生 存 率(U繍Repaired su脚 量va盈;URS). Rec‑assay液. 体 法 の 実 験 結 果 に標 的 論 を 適 用 し,そ. の 解 析 結 果 を利 用 し て,検 '. g.3. Theoretical theory.. 36. curbs. for. the. Target. and. Hit. 定 試 料 のDNA損. 傷 性 強度. を 一 律 に表 現 す る指 標 の 導 入 を試 み る。 ま ず,Rec+とRec一. の致 死感 受 性差 の算 出方 法 につ. 水質汚濁研 究.
(6) プ ロ ビ ッ ト理 論 と標 的 論 を 利 用 し た 枯 草 菌(Bo16ガ11Z4SSZ4∂ガ1盛S)Rec.assa液. Fig.. 5. Repaired. 体法 の評 価 方法. survival,. 177. RS and mean lethal. hits of. Recに は,R50やS‑probitで. 採 用 し た 濃 度 比 較 よ り も,こ. の 生 存 率 比 較 の 方 が,Rec‑assay液. 体法 の原理 に よ り. 適 した も の で あ る と言 え る。 また,前 際 に,増. 述 の よ うに,実. 験結 果 に標的 論 を適用 す る. 殖 阻 害 曲 線 図 に お け る 横 軸 は,ヒ. ッ ト数 に 書. き直 され 無 次 元 化 され て い る。 した が っ て,増. 殖 阻害. 濃 度 レ ベ ル に つ い て の 考 察 は 不 要 で あ る。 以 上 の考 察 に 基 づ き,標 的 論 に よ っ てDNA損. 傷性. 強 度 を 表 わ す 指 標 を 求 め る手 順 を 次 に 述 べ る。 Fig.. 4. Flow chart of the Target and Hit theory for analysis of Bacillus subtilis rec-assay liquidcultivation. 1)Rec+,Rec一. の 実 験 結 果 に,DF童9。4で 示 し た フ. ロ ー チ ャ ー トに 従 っ て標 的 論 を適 用 し,そ れ ぞ. method.. れ に対 応 す るモ デ ル お よ び正 規 曲線 式 を求 め い て 考 え る 。R50お のDNA損. よ びS‑probitの. 傷 性 の 強 度(こ. 場 合 は,検 定 試 料. の 場 合 はM濃度 レ ベ ル を 考 慮. る。 2)1)で. 求 め た 正 規 曲 線 式 を 利 用 して,標. 的論 の. し て い な い)を 表 現 す る た め に,同 一 生 存 率 を 生 ぜ し. 増 殖 阻 害 曲 線 図 を 描 く。 こ の 際,横. め るRec+とRec一. る た め の 単 位 ヒ ッ ト数 当 り の 検 定 試 料 濃 度. の 濃 度 の 差 塗 比 較 した 。つ ま り,増 殖. 軸 を決定 す. 阻 害 曲 線 図(DF量9。且参 照)に お け るM横軸 方 向 の 差 に よ っ. (塩)と し て は,Rec一. てDNA損 傷 性 の 強 度 を 論 じた わ け で あ る。 一方 ,増 殖 阻 害 曲 線 図 に お け る縦 軸 方 向 の 差,っ. に して グ ラ フを 描 く と,検 定 試 料 に変 異 原 性 が. り,同 一 検 定 試 料 濃 度 に お け るRec+とRec一 の 差 を 考 え る 。 こ の差 は,も. に よ っ てDNAが 率 の う ち,野. な い 場 合 は,Rec+とRec一. ま. の生 存率. な る 。 ま た,DNA損. し野 生 株 が 組 み 換 え 修 復. 機 能 を 有 し な け れ ば,検 定 試 料 の有 す るDNA損. 従 っ て,DNAの. の増殖 阻 害 曲線 は重. 傷 性 強 度 が 大 き くな る に 組 み 換 え修 復 の 結 果 と し て 生. じ る両 者 の 生 存 率 差 は次 第 に広 が っ て い く こ と. 傷性. 傷 害 を 受 け 細 胞 死 に 至 る はず の 死 亡 生 株 が 保 持 す る組 みi換え修 復 機 能 に よ っ. の 値 を 採 用 す る。 この よ う. に な る。 3)Rec一. に 平 均 致 死 ヒ ッ トを 生 ぜ し め る 検 定 試 料. て 修 復 さ れ る こ と に よ り生 存 可 能 と な る 菌 の 生 存 率 で. 濃 度 に お け るRec+とRec一. あ る。 した が っ て,枯 草 菌DNAが. で 求 め た 正 規 曲 線 式 よ り算 出 す る。 そ して,こ. 受 け る傷 害 の うち,. の 生 存 率 の 差 を1). 組 み 換 え 修 復 を 受 け る割 合 が 一 定 で あ る と 仮 定 す る. の 値 を 修 復 可 能 生 存 率(Repairedsurviva1;. と,こ の 縦 軸 方 向 の 差 は,検 定 試 料 の 有 す るDNA損. RS)と. 傷. 性 強 度 を 直 接 的 に 表 わ し て い る と考 え る こ と が で き る。 この よ うに 考 え る と,DNA損. Vol.8No.3(1985). 傷 性 強 度 を表 現 す る. 定 義 し,検 定 試 料 のDNA損. 表 わ す 指 標 とす る(DFig。5参 4)さ. ら に,3)で. 傷 性 強度 を. 照)。. 求 め たRSを,Rec一. の平 均 致 死. 37.
(7) 論. 178. 濃 度 で 除 す る こ と に よ っ て,検 定 試 料 の 単 位M濃 度 当 りのDNA損 を,単. 呼 ぶ 。 な お,こ. Amestestに. のURSの. がで きない。 DNA損. 傷 性 強 度(こ の 場 合 は,増 殖 阻 害 濃 度 レ ベ ル. を 考 慮 し て い な い)をS‑probitで. 位 修 復 可 能 生 存 率(UnitRepairedsurvi‑. val;URS)と. gramに. 傷 性 強 度 を算 出 す る。 こ の 値. 文. 値 は,. て,個. が 加 味 され,Rec+とRec一. お け る 変 異 原 性 強 度 指 標Mut.. の致死感 受 性 差 を全 体 的 に. と ら え て い る意 味 でR50の. 相 当 す る も の で あ る。. 示 した こ とに よ っ. 々 の 検 定 試 料 に よ る増 殖 阻 害 曲 線 の形 状 の 違 い. 値 よ り も,よ り真 実 に 近 い. も の に な る と考 え られ る 。 した が っ て,R50と 4。 解 析 結 果 お よ び 考 察 Rec‑assay液. 体 法 の 実 験 結 果 に プ ロ ビ ッ ト理 論,標. 的 論 を 適 用 し,統. 計手 法 を利 用 して解 析 す る こ とに. す る こ と に よ って,検. 定 試 料 のDNA損. 性 強 度(増. 差 が 解 消 さ れ 数 値 的 な 信 頼 性 が 高 ま っ た 。 ま た,増. 応 比 較 検 討 す る こ とが で き る 。. 殖. 阻 害 曲線 が ま っ た く描 け な い場 合 は 適 用 で き な い が, プ ロ ビ ッ ト理 論 を 適 用 し てR50を. 求 め る 場 合 は,50%. な お,Preincubation法,Stationary法. そ れ ぞ れ1.64,1.45で 0.430,0.323で. そ れ ぞ れ 液 体,(S‑9)Rec‑assay. 次 に,液. 傷. の実験 結果 に. プ ロ ビ ッ ト理 論 を 適 用 し た 場 合 のKMのR50の. と思 わ れ る。. 体(S‑9)Rec‑assayStationary法. 傷性 の有 無 が. 殖 阻 害 濃 度 レベ ル の 考 慮 な し)の 大 小 も一. 近 い 致 死 効 果 が 得 られ れ ば 外 挿 す る こ と も可 能 で あ る Tab盈e2,Tab旦e3に. 比較. 判 定 で き る。ま た,こ の 値 の 大 小 に よ っ て,DNA損. よ っ て,従 来 の 評 価 方 法 に お い て も存 在 し た 人 為 的 誤. Peincubation法,液. 同 様 に,. S‑probitの 値 を 陰 性 対 照 物 質KM(kanamycin)と. あ り,S‑probitの. 値 は. 値 はそれ ぞれ. あ る。. 体(S‑9)Rec‑assayPreincubation法,液. 体(S‑9)Rec‑assayStationary法. を 適 用 した 代 表 的 変. を 適 用 し た 代 表 的 な変 異 原 物 質 の プ ロ ビ ッ ト理 論 に よ. 異 原 物 質 の 標 的 論 に よ る 解 析 結 果 を そ れ ぞ れTab且e. る解 析 結 果 を 示 す 。 な お,以. 4,Tab皿e5に. す べ てmg/1の. 下 の解 析 にお ける濃度 は. 単 位 で 表 示 し て あ る。これ は,本 論 文 で. 示す 。. Tab丑e4,Tab亙e5の. ヒ ッ ト数 を 見 る と,同 一 試 料 で. 論 じ た 評 価 方 法 を,最 終 目標 とす る 水 環 境 試 料 のReじ. あ る に も か か わ らず,Preincubation法. assay液. 法 とで は,そ. 体 法 の 実 験 結 果 に 適 用 す る 際 に は,M濃 度 は. TOC(mg/1)等. の 水 質 指 標 に よ っ て置 き換 え る こ とが. とStationary. の 数 に 相 異 が 生 じ て い る の か が わ か る。. これ は,Preincubation,Stationaryそ. れ ぞれ の状 態 で. 必 要 で あ る と考 え られ る か ら で あ る。 モ ル 濃 度 表 示 で. の 菌 の 状 態 の違 い(増 殖 中 あ る い は 非 増 殖 中)に. は,種. す る も の と考 え られ る 。. 々 な物 質 が 混 在 す る 水 環 境 試 料 のDNA損. 強 度 を,代 Table. 2. 表 的DNA損 Analysis. by the Probit. liquidpreincubation. Table. 38. 3. 傷性. 傷 物 質 の そ れ と比 較 す る こ と theory. DNA損. 傷 性 強 度 は,修 復 可 能 生 存 率RS(%)に. 起因. より. of rec-assay. on typical. DNA-damaging. agents. by Bacillus. subtilis. in the. of rec-assay. on typical. DNA-damaging. agents. by. subtilis. in the. method. Analysis by the Probit liquidstationary method. theory. Bacillus. 水質汚濁研究.
(8) プ ロ ビ ッ ト理 論 と標 的 論 を 利 用 した 枯 草 菌(Bo:6ガ11z4∫sz4ろ ガ1ゑ ∫)Rec‑assay液. 179. 体 法 の評価 方 法. Table. 4. Analysis by the Target and Hit theory on rec-assay of typical agents by Bacillus subtilis in the liquid-preincubation method. DNA-damaging. Table. 5. Analysis. DNA-damaging. agents. by the. Target. by Bacillus. and Hit. subtilis. theory. on rec-assay. in the liquid-stationary. of typical. method. 一 律 に比 較 検 討 す る こ とが 可 能 で あ る と考 え ら れ る。. を検 出 す る方 法 で あ る 。一 方,Rec‑assay液. し か し,RSに. は,DNAに. よ っ て 比 較 さ れ るDNA損. 差 は,せ い ぜ い63%(Rec一. が1ヒ. 傷 性 強度 の. とい う こ と を 利 用 し て い る の で,DNAの. どの. 部 位 に変 化 が 起 きて も検 定 試 料 のDNA損. 傷性. ッ トモ デ ル に 合 致 し,. か つRec一 に平 均 致 死 を 及 ぼ す 検 定 試 料 濃 度 に お け る Rec+の 生 存 率 が100%の. を検 出 す る こ と が で き る 。MMCはMNNGに. と き)で あ る 。 と こ ろ で,現 在. わ か っ て い る変 異 原 性 に つ い て は,106倍 も そ の 強 度 に. 比 較 し て,DNA特. 開 き が あ る。 した が っ て,変 異 原 性 強 度 を,DNA損. 起 強 度 は 小 さ い が,DNA分. 性 強 度 と して 検 討 す る た め の 指 標 と し てRSは. 傷. 値 は,陰 性 対. 照 物 質KMと. 傷 性 の有 無 を. の 比 較 に よ って,DNA損. 定 部 位 に 対 す る突 然 変 異 誘 子 全 体 で み る と損. 傷 作 用 が 大 き い と考 え られ る。. 充分で. あ る と は考 え られ な い 。以 後,こ のRSの. 体法. 起 き た 傷 害 を 修 復 す る機 構 が 働 く. 2)Mut‑gramを. 算 出す る際 の濃 度 が純 粋 な変異 原. 性 に寄 与 す る濃 度 で あ る の に 対 し,Rec‑gram. 判 定 す る指 標 と し て 用 い る こ と とす る。 つ ま り,標 的. やURSを. 論 に よ るRSは,プ. 毒 性 を 加 え た 濃 度 を 使 用 し て い る と考 え ら れ. probitに. ロ ビ ッ ト理 論 に よ るR50やS‑. れ ぞ れ14.9,18.0で. に よ るKMのRSの. 場 合 に は,ヒ ッ ト数 の 違 い に. 純 粋 に 検 定 試 料 の 変 異 原 性 の み を 問 題 とす る場 合 に は,Rec‑gramやURSは,ま. だ ま だMuむgramに. 劣 っ. て い る と考 え ら れ る。 し か し,環 境 に 与 え る 影 響 の大. よ っ て 加 味 さ れ て い る と考 え ら れ る。. き さ を 考 え る と,Rec‑assy液. :F量9・6にAmestestのMut・gramとR←c‑gram・. 体 法 はDNAの. 分 子特異. 性 に 左 右 さ れ ず,ま たRec‑gramやURSは,急. 比較 を示 す。. Fig。6よ. 算出 そ れ に比 較 して. 急 性 毒 性 の要 素 が か な り大 き い とM解釈 で き る。. 場 合 に考 慮 さ れ た 増 殖 阻 害 曲. 線 の 形 状 の 相 異 は,RSの. URSの. に 使 用 し た 濃 度 は,MNNGの. 値 は,そ. あ る。. と こ ろ で,S‑probitの. 傷 性 に急性. る 。つ ま り,MMCのRec‑gramやURSの. 相 当 す る も の と し て取 り扱 う。な お,Preincu‑. bation法,Stationary法. 算 出 す る 場 合 は,DNA損. り,Mutgramと. の 強 度 が 逆 転 し て い る こ とが わ か る。 ま た,他. の変 異. 評 価 方 法 で あ る と 言 え よ う。 こ の よ うに 考 え る と,. 原 物 質 で は あ る程 度 一 致 し て い る と言 え る。 こ の. MMCの. MMCとMNNGの. の そ れ よ り も大 きい と解 釈 で き る。. 逆 転 に つ い て は 次 の2つ. 性毒性. を も考 慮 に 入 れ た 指 標 で あ る とい う点 で 優 れ た 検 出,. 比 較 し てMMCとMNNG. の理 由 が. 毒 性(急. 性 毒 性+DNA損. 傷 性)は,MNNG. 考 え られ る。 1)Amestestは DNAの. Vo1.8No.3(1985). 復 帰 突 然 変 異 試 験 で あ る た め, 特 定 の 分 子 構 造 の と こ ろ に 起 こ る変 化. 5。 結 Rec‑assay液. 言 体 法 の 実 験 結 果 に プ ロ ビ ッ ト理 論 を 適. 39.
(9) 180. 論一. 文. 用 し て,実 験 デ ー タ を 統 計 的 に 解 析 し,R50,S‑probit,. 上 金 沢 大 学 医 学 部 癌 研 究 所)。 さ ら に,実 験 デ ー タ の 蓄. Rec‑gram等. 積 お よび解 析 に多 大 な る労 力 を提 供 して い た だ い た. の 指 標 を 用 い て 検 定 試 料 のDNA損. 傷性. 強 度 を 論 じ る手 法 を 考 案 し た 。 ま た,標. 佐 々木 淳 氏(日 本 車 輔K.K.),高. 的 論 に 注 目 し て,検 定 試 料 に よ っ て 菌 に対. す る作 用 メ カ ニ ズ ム に相 異 が あ る こ とを 想 定 し,こ 方 法 に 改 良 を 加 え た 。そ して さ ら に,Rec‑assay液 の実 験 原 理 を 再 吟 味 し,新. た なDNA損. の. 大 学 大 学 院),橋 ま す 。(原. 稿受理. よび. 引 1)賀. 田 恒 夫,井. 用. 上. 文. 献. 正(1980)ヒ. トお よ び動 植 物 体. 単 位 修 複 可 能 生 存 率(UnitRepairedSurvival;. 内 の 抗 突 然 変 異 因 子 の 検 出 と意 義,日. URS)を. 学 会,第9回. 定義 した。. プ ロ ビ ッ ト理 論 に よ るRec‑gramや URSは,従. 標 的論 による. 来 か ら存 在 して い た 各 検 定 試 料 間 の 増 殖 阻. 害 濃 度 レベ ル の 相 異 の 問 題 を考 慮 したDNA損. 傷性 強. 度 指 標 で あ る 。 した が っ て,こ れ ら の 値 に よ り,DNA 損 傷 性 強 度 を1つ. の指 標 で 示 した こ と に よ っ て 検 定 試. 料 相 互 のDNA損. 傷 性 強 度 の 比 較 が 可 能 で あ る と考 え. られ る。 しか し,標 的 論 に よ る ヒ ッ ト数 が 何 を 意 味 し て い るか とい う問 題 も含 め て,こ の 検 証 に は,他. れ ら の定 義 の 妥 当 性. の 多 くの 試 料 のRec‑assay解. 析 デー タ. と,他 の 変 異 原 性 試 験 の 結 果 と の 比 較 が 必 要 で あ る と 思 わ れ る。 ま た,標 的 論 や プ ロ ビ ッ ト理 論 を 利 用 し て, 増 殖 阻 害 曲 線 が 描 け な い 場 合 の外 挿 方 法 の 研 究 も必 要 で あ る と思 わ れ る。 最 後 に,枯. ら び に 助 言 を い た だ い た 吉 川 寛 教 授,村 上 清 史 助 数 授, 調整に. 尽 力 して 下 さ っ た 飯 田克 平 助 教 授 に 感 謝 致 し ます(以. 40. 2). Nagao,. M., Sugimura,. T. and Matsushima. , T. and Carcinogens.. (1978) Environmental Mutagens Ann. Rev. Gent., 12. 3)松. 井 三 郎,徳. (Bacillus. 川 正 弘,小. subtilis) Rec-assay. 異 原 の 検 出 法,水 4)吉. 本環 境 変異原. 研 究 発 表 会 講 演 要 旨集,31pp.. 川 邦 衛,能. 誘 導 のS‑9に. 出 芳 久(1985)枯. 草菌. 液体 法 に よる水 環境 変. 質 汚 濁 研 究,8,3.. 美 健 彦(1980)PCB誘. 導 とPB+NF. お け る前 変 異 原 物 質 の 代 謝 活 性 化,変. 異 原 と毒 性,第12集,8‑12pp. 5)賀. 田恒 夫 編(1978)遺. 46‑50pp.,日 6)松. 伝 毒 性 ・突 然 変 異 実 験 法,. 本 衛 生 技 術 研 究 会,東. 江 吉 行(1961)公. 7)佐. 久 間 昭(1964)生. 大 学 出 版 会,東 8)近. 生 社 厚 生 閣 版,東. 物 検 定 法,251‑264pp. 京.. .,東 京. 京.. 藤 宗 平(1972)分. 京 大 学 出 版 会,東. 京.. 共 用 水域保 全 のため の水質 汚. 濁 調 査 指 針,261‑290PP.,恒. 草 菌 に よ る 実 験 お よ び評 価 方 法 に 指 導 な. 小 笠 原 直 毅 助 手 に感 謝 し ます 。ま た,S‑9mixの. も感 謝 し. 昭 和59年11月12日). 体法. 傷性 指標 と し. て修 復 可 能 生 存 率(RepairedSurviva1;RS)お. 島 正 信 君(ド レ ク セ ル. 本 徹 君(金 沢 大 学 大 学 院)に. 子 放 射 線 生 物 学,63‑72pp.,東. 京.. 水質汚濁研 究.
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