ラット膵臓腺房細胞における刺激一放出連関 に 及ぼす 細胞外

博 士 （ 獣 医 学 ） 浅 田 尚 登

学 位 論 文 題 名

ラット膵臓腺房細胞における刺激一放出連関 に 及ぼす 細胞外 pH 変化の影響

学位論文内容の要旨

  膵 腺房 細胞 に おけ る刺 激 ―放 出連 関 にお ける エ ネル ギ一 供給，細胞内Ca2゛イオン 動態にっい て の 理解 を深 めるた め，酵素分泌過程 および，細胞質内Caz゛濃度 （[Ca2゛］。）動態 ，ミトコン ド リ ア呼 吸に た いす る細 胞 外pH（pHオ ）変 化の 影 響を 調ベ ， 総合 的に 解 析す ること を目的に，

ラ ッ ト摘 出潅 流 膵標 本を 用 いて ，ミ トコンドリ ア内チトク口ム酵 素酸化還元位，酸素 消費量，及 び， 水および酵素放出 を，また，コラゲ ナーゼ処理によって 得たラット膵分離 腺房標本を用いて，

酵 素 放 出 ， 細 胞 内pH（pHよ ） ， 細 胞 質 内[Ca2゛ ］ 動 態 ， 細胞 内へ のCaz゛ 流入 を測 定 した 。   ラ ット 摘出 潅 流膵 標本 で ，血 管潅 流液のpHを7．3から6．8に下 降させるとミ卜コン ドリア内チ ト ク 口 ムa（a3） ，b，c十clの 酸 化 還 元 位 が す べ て 酸 化 方向 に 変化 した 。pHオ を6．Oにま で 下 降 させ ると チ トク 口ム 酵 素群 の酸 化変化はよ り大きくなった。pH，を8．Oへ上昇さ せるとチト ク 口 ム 酵 素 群 の 還 元 変 化 が 引 き 起 こ さ れ た 。BCECF（2，7−bis（2‑ carboxyethyl)−5 (6)―carboxyfluorescein)を 負 荷 し た 分 離 腺 房 標 本 を 用 い て 調 べ たpH,は ， 標 準状 態(pHオ 7．4）においては7． 41土O．03（n二二8）であった。pHオ6．2〜8．Oの範囲では，pH，はpHオ上昇に 従 っ て ほ ぼ 直 線 的 に 上 昇 し ， そ の 傾き は 約0．3で あ った 。以 上 の結 果か らpHオ 変化 に 伴っ て pH， が変 化し ， その 結果 と して ミト コ ンド リア 内 膜で のH゛濃度 勾配が変化すること で，ミトコ ンド リア内での電子伝 達量が変化してい ることが示唆された 。

  摘 出 潅 流 膵 標 本 を 使 っ て 膵 液 ， 酵素 放 出反 応を 調 べた とこ ろ ，刺 激開 始 前の 静止 時 放出 は pHオ6．8および6．0に おいてpHオ7．3で の放出に比べ有意に 低下した。最大放 出反応を引き起こす lOOpM CCK―8持 続刺 激に 応 じた 放出 反 応は ，pH，6．Oまた は8．Oにお い てpHオ7．3での放出反 応に 比べて有意に低下 した。一方，分離 腺房標本の表面潅流 実験では，pH。6．0への下降により，

lOOpM CCK ‑8刺 激 に 応 じ た ア ミ ラ ー ゼ 放 出 経 過 の 後 半 の プ ラ ト 一 部 分 で の み 抑制 が 認め ら れ ， 静止 時放 出 に変 化は 認 めら れな かった。pHオ8．Oへの上昇に よっては，アミラー ゼ放出反応 がpH，7．4で の 放出 反応 よ りも わず か に増 大す る 傾向 が認 め られ た。 こ れら のpHオ 変化の放出

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反 応 にた いす る 効果 の違 い は，おそらく 実験に用いた標本系 および実験プ口ト コルの違いによる もの と思われる。

  摘 出 潅 流 膵 標 本 で は ，20pM CCK ‑8刺 激 に 応 じた 持 続性 の放 出 反応 の大 部 分は 潅流 液 から Caz+を 除 く こ と で 抑 制 さ れ た 。 し か し ， 細 胞 外 液にCa2゛(2. 5mM)を 戻す と 刺激 終了 後 でも 放 出 反応 が再 び 引き 起こ さ れた(Ca2゛ 再導 入反 応 ）。 分離 腺 房標 本を 用 いた 実験 で は，lOOpM CCK−8刺 激終 了 後に ，pH，6．Oから 標 準pHオ（7，4） へ戻 す こと でア ミラー ゼ放出反応が再び 引 き 起こ され た 。こ の反 応 は細 胞外Caz゛ に 依存 して お り， 摘出 潅 流膵 標本で見られたCa2゛再 導入 による放出反応と 類似していた。一 方，pHオ8，Oにおい て分泌刺激終了後 も持続するアミラー ゼ 放 出は ，細 胞 外Caz゛を 除く こ とで 消失 し た。 これ ら の結 果は ， 低pHオ条 件 下で は刺 激 に応 じ た 腺 房 細 胞 へ のCa2゛ 流 入が 抑制 さ れる こと ， かっ ，高pHオ条 件下 で はCa2゛流 入が 促 進さ れて いることを示唆し た。

  Ca2+螢 光 指 示 薬 で あ るfura ‑2を 負 荷し た分 離 腺房 標本 を 用い て，[Ca2+］ 画像 解析 装 置お よび ，［Caz゛］顕微測定により 腺房細胞の［Ca2゛］オ動態 を調べたところ，分離膵腺房標本を100 pM CCK−8で持 続刺 激 した とき ，ECa2゛］ オ は最 初に急速に 最大値に達し（初 期相），続いて緩 や か に下 降し な がら 静止 時 の2〜3倍の値 を刺激中維持（二次 相）した。pHオを7．4から6．0へ下 降さ せると，ECa2゛］ オ変化の初期相に 続く緩やかな下降が 加速され，刺激持 続中にもかかわらず

［Ca2゛］オは静止時レベルにまで低下した。しかし，pHオを6．0から7．4へ戻すことで，［Ca2゛］オ は 再 び上 昇し て 静止 時の2倍程 度 の値 に達 し た。 反対にpHオ を8．Oへ上昇させ ると，初期相に続 く[Caz゛］。の緩やか な下降が減速され ，[Ca2゛］。は刺激 持続中，高い値を 維持した。その後，

pH， を7．4に戻すこと で［Ca2゛ ］。は速やかに下 降した。これらの ［Ca2゛］ オ反応の時間経過は lOOpM CCK−8刺 激 に 応 じ た分 離 腺房 標本 か らの アミ ラ ―ゼ 放出 の 時間 経過 と 相似 して い た。

CCKの生 理 的濃 度で あ るlOpMのCCK・8持続 刺 激に 応じ た ［Caz゛］ 。振 動 性変 動（ ［Ca2゛ ］。

振 動 ）におい ては，pHオの6．0へ の下降により［Ca2゛］オス パイクの頻度が有 意に滅少し，また ス パ イク の高 さ が次 第に 減 衰した。pHオ の8．Oへの上昇によ りいくっかの例で[Ca2゛］オスパイ ク 頻 度 が 増 大 し た がpH，7．4で の 反 応 に 比 べ 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た 。   分 泌刺激に 応じた[Ca2゛］。の 二次相上昇および ，ECaz゛］。振動 が細胞外からのCa2゛の流入 に よ り維 持さ れ るこ とか ら ，細 胞外 か らのCa2゛ 流入 に たい するpHオ変 化の 影 響を ，細 胞 外に 添 加 し たMn2゛ に よ る340nm光 で 励 起 し たfura―2の 螢 光 の 消 光 （Mn2゛ 消 光 法(Mn2十 ・ quenching)） を 目 安 に 調 べ た 。pHオ を6．Oへ 下 降 さ せ る と ，lOOpM CCK―8持 続 刺 激 中 の Mn2゛ 流 入 に よ る 消 光 はpHオ7．4で の 消 光 進 行 に 比 べ 抑 制 さ れ た 。 反 対 に ，pHオ8．0で は

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Mn2゛ に よ る 消 光1ま 促 進され た。 これら の結果 はpHオ の下降 ，上昇 により 分泌 刺激に 応じた 腺 房 細 胞 内 へ のCa2゛ 流 入が 抑 制 ， ま たは 促 進 さ れ るこ と を 示 し てい る 。lOpM CCK―8刺 激 時 のRIr12゛ 流 入 に よ るfura―2螢 光 の 消 光 に っ い て も ， 同 様 の 結 果 が 得 ら れ た 。   以 上の結 果に基 づいて 以下 のよう に推論 した。1）pHオを 変化さ せるこ とで細 胞膜で ，Na゛ ． H゛交換 の変化 を介 して細 胞内H゛濃 度の変 化がも たらさ れる 。細胞 内H゛濃度 変化は ミトコ ンド リア 内膜 に作用 を及ぼ し，ミ トコン ドリ アでの 電子伝 達（チ トク 口ム酵 素酸化還元状態），酸素 消 費 量 の変 化 が 引 き 起こ さ れ る 。2） 分 泌 刺 激 に 応じ た 細 胞 内 へのCa2゛流入 は低pHオ条件 下 で は 抑 制さ れ る 。 反 対に ， 高pHオ条 件 下 で はCa2゛ 流 入 は促 進 さ れ る。3) pH，を 下降さ せた 時 の 膵 腺房 細 胞 か ら の酵 素 ， 電 解 質 放出 反 応 の 抑 制は ，Ca2゛ 流 入 が 抑 制 され た こ と に よる ECa2+］。 上昇の 抑制に よる。

学位論文審査の要旨 主 査    教 授    菅 野 富 夫 副 査    教 授    中 里 幸 和 副 査    教 授    斉 藤 昌 之 副査    助教授    原田悦守

  膵 腺房細 胞にお ける刺 激― 放出連 関にお けるエ ネルギ ―供 給，細 胞内Ca2゛イ オン動 態に っい ての 理解 を深めるために，酵素分泌過程および，細胞質内Ca2゛濃度（ECa2゛］。）動態，ミト‐コ ンド リア 呼吸に たいす る細胞 外pH (pHオ ）変 化の影 響を調 べた。

  ラ ット摘 出潅流 膵標本 で， 血管潅 流液のpHを7．3から6．8に下 降させ るとミトコンドリア内チ ト ク 口 ムa（a3） ，b，c十clの 酸 化 還 元位 が す べ て 酸化 方 向 に 変 化 した 。pHオを6．Oに まで 下降 させ るとチ トク口 ム酵素 群の酸化変化はより大きくなった。 pHオを8．Oへ上昇させるとチト ク ロ ム 酵素 群 の 還 元 変化が 引き起 こさ れた。 分離腺 房標本 を用い て細 胞内pH（pH，） を測定 す ると ，標 準状態(pHオ7．4）に おいては7．41土O．03（n二二8)であった。pHオ6．2〜8．0の範囲で は ，pH， はpHオ上 昇 に 従って ほぼ直 線的に 上昇し ，そ の傾き は約O．3であ った。 以上の 結果か らpHオ変 化 に 伴 っ てpH， が 変 化し ， そ の 結 果とし てミト コンド リア 内膜で のH゛濃度 勾配が 変 化 す る こ と で ， ミ ト コ ン ド リ ア 内 で の 電 子 伝 達 量 が 変 化 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。

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  摘 出 潅 流 膵 標 本 を 使 っ て膵 液 ，酵 素放 出 反応 を調 べ たと ころ ，CCK−8に よ る刺 激開 始 前の 静止時 放出は，pHオ6．8お よびG．0においてpHオ7．3での放出 に比べ有意に低下し た。最大放出反 応 を 引 き 起 こ す100pMCCK―8持 続 刺 激 に 応 じ た 放 出 反 応 は ，pHオ6．Oま た は8．Oに お い て pHオ7．3での放出反応に比 べて有意に低下した。一方，分離腺房標本の表面潅流実験では，pHオ6．O へ の下 降 によ り，100pIx4 CCK―8刺 激に 応 じた アミ ラ ーゼ 放出 経 過の 後半の プラトー部分での み 抑制 が 認め られ ， 静止 時放 出に変化は 認められなかった 。pHオ8．0への上昇 によっては，アミ ラ ー ゼ 放 出 反 応 がpHオ7．4で の 放 出 反 応 よ り も わ ず か に 増 大 す る 傾 向 が 認 め ら れ た 。   Ca2+螢 光指 示 薬で あるfura・2を負 荷し た 分離 腺房 標 本を 用い て ，ECaz゛ ］ 画像 解析 装 置お よび，[Caz+］顕 微測定により腺房 細胞の［C,a2゛］。 動態を調べたとこ ろ，分離腺膵房標本を100 pM CCK・8で 持 続刺 激し た とき ，［Ca2゛ ］。は最初に急速 に最大値に達し（初 期相），続いて緩 や かに 下 降し なが ら 静止 時の2〜3倍 の値 を 刺激 中維 持 （二 次栢 ） した 。pHオ を7．4から6．Oヘ 下 降さ せると ，［Ca2゛ ］オ変化の初期相 に続く緩やかな下 降が加速され刺激持 続中にもかかわら ず ［Caz゛ ］オ は静 止 時レ ペル に まで 低下 し た。 しか し ，pHオを6．Oか ら7．4へ戻 すこ と で，

[Ca2゛ ］。は 再び上昇して静止 時の2倍程 度の値に達した。 反対にpHオを8．Oヘ ．ヒ肄させると，

初期相に続く［Ca2゛］。の緩やかな下降が減速され，［Ca2゛］。は刺激持続中，高い値を維持した。

その後 ，pHオを7．4に戻す ことで［Caz゛］オは速やかに下降した。これらの［Ca2゛］″反応の時間 経 過 はlOOpM CCK・8刺 激 に応 じ た分 離腺 房 標本 から の アミ ラー ゼ 放出 の時 間 経過 と相 似 して い た 。CCKの 生 理 的 濃 度 で あ るlOpMのCCK―8持 続 刺 激 に 応 じ た ［Ca2゛］ 。 振動 性変 動 につ い ては ，pHオ の6．Oへの下降に より［Ca2゛］。スパイクの 頻度が有意に減少し ，またスパイクの 高 さが 次第に 減衰した。pHオの8．Oへの上昇により いくっかの例で［Caz゛］。 スパイク頻度が増 大した がpHオ7．4での反応 に比べ有意な差は 認められなかった 。

  以 上の 結果 に 基づ いて ， 申請 者は 次 のよ うに 推 論し てい る 。1）pHオ を変 化 させ るこ と で，

細 胞膜 でNa゛ ―H゛ 交換 の 変化 を介 し て細 胞内H゛濃 度の変化がもた らされる。細胞内H゛濃度変 化 はミ ト コン ドリ ア 内膜 に作 用を及ぼし ミトコンドリアで の電子伝達（チトク 口ム酵素酸化還元 状 態 ）， 酸素 消 費量 の変 化 が引 き起 こ され る。2)分泌 刺激 に 応じ た細 胞 内へ のCa2゛流 入 は低 pHオ 条 件 下 で は 抑 制 さ れ る。 反 対に ，高pHオ条 件下 で はCa2゛流 入は 促 進さ れる 。3）pHオを 下 降さ せ た時 の膵 腺 房細 胞か ら の酵 素， 電 解質 放出 反応の抑制は，Caz゛流入 が抑制されたこと に よる[Caz+］ オ上 昇の 抑 制に よる 。 これ らは ， 膵臓腺房 細胞の刺激―放出連 関にっいての新し い 見解 を 含む もの で あり ，審 査員一同は 浅田尚登氏が博士 （獣医学）の学位を 受けるに十分な資 格を有 するものと認めた。

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