脳梗塞に対するヒト神経幹細胞移植後の内在性修復メカニズム―幹細胞は興奮性シナプスを増加させる―

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(1)● シンポジウム 11 神経再生と脳保護療法. 脳梗塞に対するヒト神経幹細胞移植後の内在性修復メカニズム ―幹細胞は興奮性シナプスを増加させる― 日宇健1, 3＊，堀江信貴2，Tonya Bliss3，西山康裕3，山口将2 福田雄高1，堤圭介1，松尾孝之2，永田泉4，Gary Steinberg3. 要旨移植されたヒト神経幹細胞がホストの内在性修復機構を促進するという仮説を基に機能回復の内在性修復メカニズムを検証した．ヌードラットに中大脳動脈脳皮質梗塞モデルを作成し，1 週間後にヒト神経幹細胞を同側皮質に定位移植した．機能回復は移植 4 週間後でみられ，脳梗塞後の angiogenesis，axonal sprouting， dendritic branching については，移植細胞により修飾亢進された．高解像度イメージングを駆使した array tomography を用いてシナプスの定量化を行い，移植 4 週間後に細胞移植群で皮質第 5 層に興奮性シナプスが増加した．神経幹細胞移植に伴うシナプスの変化を in vivo で捉え，synaptogenesis が機能回復に一致して起こることが明らかとなった．（脳循環代謝 26：151∼154，2015）. キーワード : 脳梗塞，神経幹細胞，シナプス. ける内在性修復メカニズム，とくにシナプスの関与に. 1．はじめに. ついて概説する．. 2．神経幹細胞移植による内在性修復メカニズム. 脳梗塞研究においてこれまで発症急性期における tissue-type plasminogen activator（tPA）の血栓溶解療法や脳保護療法に重点が置かれてきた．しかしながら急性期脳梗塞治療にて恩恵を受ける患者はあくまで一部で. 細胞移植による機能回復のメカニズムを解明するに. あり，慢性期患者への治療のアプローチが必要とされ. は，移植後のホスト内の環境変化や内在性修復機構の. る．近年の再生医学の発展により機能再建を目標とし. 変化を捉えることが必要である．. た治療戦略が現実的課題となってきた．脳卒中とくに. ヌードラットを用いて distal MCA occlusion モデルを. 脳梗塞も再生医療が期待されている疾患の一つであ. 作成し，梗塞 1 週間後にヒト神経幹細胞を患側大脳皮. る．動物モデルにおいて脳梗塞後に様々な細胞を移植. 質に定位移植（1×105 cells/site，3–4 sites）し，cylinder. することで脳虚血による認知機能，行動の改善が得ら. test, whisker-paw test, modiﬁed neurological severity score. れたと報告され，脳梗塞に対する治療法の新たな側面. test にて 1 週毎に機能評価を行った．定位移植 3∼4 週. としての期待は大きい．本稿では神経幹細胞移植にお. 間後に細胞移植群で機能回復を来した（図 1）．梗塞周辺部において著明に血管新生が亢進し移植後 2 週目に. 1. ピークがあった．ヒト VEGF 中和抗体 Avastin を移植. 2. 同日から隔日で投与を行うと細胞移植群にて Avastin. 国立病院機構長崎医療センター脳神経外科長崎大学医学部脳神経外科 3 スタンフォード大学脳神経外科 4 小倉記念病院＊〒 856-8562 長崎県大村市久原 2-1001-1 TEL: 0957-52-3121 FAX: 0957-54-0292 E-mail: thiu.nagasaki@gmail.com. 投与群では血管新生が抑制された．また Avastin 投与により機能回復がブロックされ，機能回復には VEGF による血管新生が寄与していることを示した1）．同側においては移植後 2 週，4 週で皮質第 5 層の錐体細胞 ─ 151 ─.

(2) 脳循環代謝第 26 巻第 2 号. Tx. **. Tx. * * Tx; transplantation. 図1. Tx. * * 図 1．Whisker-paw test，modified neurological severity score（mNSS）test，postual test にて 1 週毎に機能評価を行い定位移植 3∼4 週間後に細胞移植群で機能回復を来した．＊ p<0.05，＊＊ p<0.01.. の dendrite branching の亢進を認めた．一方，対側では. ナプスと抑制性シナプスである GABA シナプスに分. 2 週後に亢進はみられたものの 4 週後には正常化し. けられる．脳梗塞発症直後から数日の間，梗塞周辺部. た2）．axonal sprouting については，脳梗塞後には axon. ではニューロンは生存するものの樹状突起の棘突起は. の伸長が亢進し，皮質脊髄路の再構築がなされるとの. 失われシナプス活性は障害される．1∼4 週間の間で. 報告されている3）．移植 4 週間後に anterograde tracer. growth-promoting process が上昇し樹状突起の棘突起の. である biotin dextran amine（BDA）を対側皮質に注入し. ターンオーバーが起こり 4∼8 週にシナプスの結合が. たのち，2 週後に評価した．幹細胞移植は障害側の皮. 増強する．このように脳梗塞後には梗塞周辺部でシナ. 質への axonal sprouting を増強させた．また対側にも. プスの劇的な変化を認めることが報告されている4）．. axonal sprouting が起こった2）．移植した幹細胞は 4 週. シナプスはコネクトソームの機能的なユニットである. 間後においても生存しており，一部は脳梗塞の周辺部. ため，脳梗塞後の機能回復にはシナプスの可塑性の変. 位まで遊走した．生着した幹細胞は，成熟した神経細. 化が大きく影響している．. 胞であるのは一部で，多くがアストロサイトあるいは. その中でも脳梗塞におけるグルタミン酸シナプスの. 未熟な神経細胞であり，このことは幹細胞からの栄養. 役割には時期により 2 面性がある5）．脳梗塞発症直後. 因子により内在性修復機構が増幅される機序を示唆. の hyperexcitability は神経細胞死を誘導し有害である. する．. ものの，一方で機能回復である慢性期には hyperexcitability は Brain-derived neurotrophic factor（BDNF）シグ. 3．脳梗塞発症後のシナプスの変化. ナルを増強させ機能回復に有効に作用する6）．. 4．神経幹細胞移植によるシナプスの変化. シナプスは前シナプスである軸索と後シナプスである樹状突起の接続部位であり，シグナル伝達などの極めて重要な神経活動に関わり，脳の高次機能と密接に. 神経幹細胞移植後の機能回復のメカニズムを知る上. 関連している．興奮性シナプスであるグルタミン酸シ. でシナプスの可塑性の変化を捉えることは極めて重要. ─ 152 ─.

(3) 脳梗塞に対するヒト神経幹細胞移植後の内在性修復メカニズム. B. A. C. 10μm. 10μm. Synaptic density (per 1μm3). Total glutamate synapses. 図2.. *. 図 2．共焦点顕微鏡（A）と array tomography（B, C）とシナプスの解像度の違い．赤は前シナプスマーカーである synapsin，緑は後シナプスマーカーである PSD95．移植後 4 週間後に梗塞周辺部のシナプスの定量化を行い，グルタミン酸シナプスの増加を認めた．＊ p<0.05.. である．peri-infarct area において幹細胞移植によりシ. 5．今後の課題. ナプトフィジン免疫反応性が増強することが示されており7~9），移植 4 週間後に移植細胞がホスト細胞からシナプス後電流を受け取ることが報告されている10）．し. 今後の課題として臨床応用においてはタイミング，. かしながら微細なシナプスを定量化することは技術的. 投与方法，細胞ソースなど治療方法の標準化が重要で. に困難であり幹細胞移植後のシナプスの数の変化を捉. ある．移植細胞のホスト側への生着を時間的，空間的. えた報告はない．. に把握することは治療効果を判断するうえで必須であ. そこで我々は独自に開発した高解像度イメージング. り，in vivo tracking を行うための gadolinium，SPIO の. である array tomography を用いて. ，シナプスの定. ほかにも新たな造影剤の可能性が報告されている．移. 量化をおこなった．Z stack を著明に改善させることで. 植後の脳の可塑性の評価に tractography や functional. 空間分解能に極めて優れており，個々のシナプスを三. MRI が挙げられる．特定の遺伝子を操作することで. 次元的に構築することでシナプスの定量化を可能とし. trophic activity を高めたり，hypoxia や CO，薬剤など. た．前シナプスマーカーと後シナプスマーカーの. により preconditioning を行うことで細胞療法の効率を. colocalization のあるものをシナプスと定義しグルタミ. 高めうる可能性がある．光遺伝学 optogenetics を駆使. ン酸シナプスと GABA シナプスの定量化を行った．. し，ホスト側の特定の波長の光を照射することによ. synapsin と PSD の colocalization のあるものをグルタミ. り，標的とするニューロンを興奮または抑制させるこ. ン酸シナプスと定義した．移植後 4 週間後に梗塞周辺. とができ，これはメカニズムを理解するうえで期待さ. 部のシナプスの定量化を行い，グルタミン酸シナプス. れるところである．. 11, 12）. の増加を認めた（図 2）．一方で GABA シナプスは増加していなかった．この変化は移植 1 週間後には認めなかった．機能回復が得られる移植 4 週間後にグルタミン酸シナプスの増加を認め，グルタミン酸シナプスが機能回復に寄与していることが示唆された．. 文献 1） Horie N, Pereira MP, Niizuma K, Sun G, Keren-Gill H, Encarnacion A, Shamloo M, Hamilton SA, Jiang K, Huhn S, Palmer TD, Bliss TM, Steinberg GK: Transplanted stem cell-secreted vascular endothelial growth factor effects poststroke recovery, inflammation, and vascular repair.. ─ 153 ─.

(4) 脳循環代謝第 26 巻第 2 号. Stem Cells 29: 274–285, 2011. repair markers in experimental ischemic stroke. Stem Cell. 2） Andres RH, Horie N, Slikker W, Keren-Gill H, Zhan K,. Res Ther 4: 11, 2013. Sun G, Manley NC, Pereira MP, Sheikh LA, McMillan. 8） Zhang L, Li Y, Zhang C, Chopp M, Gosiewska A, Hong K:. EL, Schaar BT, Svendsen CN, Bliss TM, Steinberg GK:. Delayed administration of human umbilical tissue-derived. Human neural stem cells enhance structural plasticity and. cells improved neurological functional recovery in a. axonal transport in the ischaemic brain. Brain 134: 1777–. rodent model of focal ischemia. Stroke 42: 1437–1444,. 1789, 2011. 2011. 3） Carmichael ST, Chesselet MF: Synchronous neuronal. 9） Ding X, Li Y, Liu Z, Zhang J, Cui Y, Chen X, Chopp M:. activity is a signal for axonal sprouting after cortical. The sonic hedgehog pathway mediates brain plasticity and. lesions in the adult. J Neurosci 22: 6062–6070, 2002. subsequent functional recovery after bone marrow stromal. 4） Murphy TH, Corbett D: Plasticity during stroke recovery:. cell treatment of stroke in mice. J Cereb Blood Flow. from synapse to behaviour. Nat Rev Neurosci 10: 861– 872, 2009. Metab 33: 1015–1024, 2013 10） Daadi MM, Lee SH, Arac A, Grueter BA, Bhatnagar R,. 5） Carmichael ST: Brain excitability in stroke: the yin and. Maag AL, Schaar B, Malenka RC, Palmer TD, Steinberg. yang of stroke progression. Arch Neurol 69: 161–167,. GK: Functional engraftment of the medial ganglionic emi-. 2012. nence cells in experimental stroke model. Cell Transplant. 6） Clarkson AN, Overman JJ, Zhong S, Mueller R, Lynch G,. 18: 815–826, 2009. Carmichael ST: AMPA receptor-induced local brain-. 11） Micheva KD, Busse B, Weiler NC, O'Rourke N, Smith SJ:. derived neurotrophic factor signaling mediates motor. Single-synapse analysis of a diverse synapse population:. recovery after stroke. J Neurosci 31: 3766–3775, 2011. proteomic imaging methods and markers. Neuron 68:. 7） Gutiérrez-Fernández M, Rodríguez-Frutos B, Ramos-. 639–653, 2010. Cejudo J, Teresa Vallejo-Cremades M, Fuentes B, Cerdán. 12） Micheva KD, Smith SJ: Array tomography: a new tool for. S, Díez-Tejedor E: Effects of intravenous administration. imaging the molecular architecture and ultrastructure of. of allogenic bone marrow- and adipose tissue-derived. neural circuits. Neuron 55: 25–36, 2007. mesenchymal stem cells on functional recovery and brain. Abstract Endogenous repair mechanisms after human stem cell transplantation following stroke Takeshi Hiu1, 3, Nobutaka Horie2, Tonya Bliss3, Yasuhiro Nishiyama3, Susumu Yamaguchi2, Yuhtaka Fukuda1, Keisuke Tsutsumi1, Takayuki Matsuo2, Izumi Nagata4, and Gary Steinberg3 1Department of Neurosurgery, National Nagasaki Medical Center, Nagasaki, Japan 2Department of Neurosurgery, Nagasaki University, Nagasaki, Japan 3Department of Neurosurgery, Stanford University, California, U.S.A. 4Kokura Memorial Hospital, Fukuoka, Japan Stem cell transplantation has emerged as a promising new experimental treatment for stroke; understanding its mechanism of action will facilitate the translation of stem cell therapy to the clinic. The ultimate change in brain plasticity is manifested at the synaptic level, however, the synaptic remodeling after stem cell therapy remains unknown. Vehicle or human neural progenitor cells (hNPCs) derived from fetal cortex were transplanted into the ischemic cortex of Nude rats at 7 days after distal middle cerebral artery occlusion. Transplantation of hNPCs significantly improved behavioral recovery after stroke compared to vehicle-treated rats at 3–4 weeks post-transplantation. We found that transplanted stem cells enhanced endogenous brain repair processes including structural brain plasticity. hNPC-treated rats had a higher density of glutamatergic synapses in layer 5 at 4 weeks posttransplantation, compared to vehicle-treated rats. These results provide novel new information about the organization of synaptic circuitry and its plasticity after stem cell therapy. These data suggest that stem cells alter the synaptic remodeling of glutamatergic synapses after stroke and this is coincident with stem cell-induced functional recovery. Key words: stem cells, stroke, synapse, plasticity ─ 154 ─.

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