オリゴマイクロアレイを用いた網羅的肺癌細胞特異
的スプライシング遺伝子群の同定
著者
近藤 丘
<はしがき>
癌が遺伝子異常に基づく疾患である事は既知のものだが､肺癌の発癌､進展を
説明しうる遺伝子異常の解明には至JE'ていない0本研究では､肺癌細胞DNA
の異常メチル化を網羅的に検討するとともに､胸部CT画像所見と血管新生､
蛋白分解､アポトーシスなどの関連蛋白群との関連性をも網羅的に検討したo 研究組織
研究代表者:近藤丘(東北大学加齢医学研究所教授)
一研究分担者:桜田晃(東北大学病院助手)
研究分担者:田畑俊治(東北大学加齢医学研究所助手) 交付決定額(配分額)(金額単位:円)
直接経費 亊I ｨﾆ N 合計 棉V纈 薮& b V F 平成15年度 湯ﾃs ﾃ 0 湯ﾃs ﾃ 平成16年度 ﾃc ﾃ 0 緜 ﾃ 平成17年度 ﾃc ﾃ 0 ﾃc ﾃ 総計 Bﾃ ﾃ 0 Bﾃ ﾃ 研究発表 (1)FukasawaM,etaJ.Microarrayanalysisofpromotermethylationin cancers.JHumanGenetics,51,2006 (2)DongB,etaLComputedtomographicimagesreflectthebiorogicbehav smalllungadenocarcinoma.JThoracCardiovascSurg,130,2005 (3)YamanakaS,etal.Chromosome12,frequentlydeletedinhumanpanc cancer,mayencodeatumor-suppressor9enethatsuppressesan9109eneSis. Lablnvest,84,2004(4)WuS,etal.hnRNPBlproteinmaybeapossJ'bleprognosticfactorin
squamousceHcarcinomaofthe山n9.LungCancer,41,2003 研究成果による工業所有権の出願.取得状況:無し研究成果
Tab一e l･ Multivariate analyses of pro9nOStic factors
VariabーeS 廼7F蒙 FVB 6 Vff 坊蹌 SE ′ f ﾇVR RelativeriSk (95%Cl)
Nodal involvement (NO.vsN1+2) 蔦" r 0.35 督 0.10(0.05- 0.20)
CTM/Lratio* (<50%Vs ≧50%) 蔦 縱2 0.34 偵 2 0.48(0.24- 0.95)
Tumbrsize (≦20mmvs >20mm) 蔦 緜B 0.39 偵 2 0.43(0.20- 0.93)
Sex(malevs female) 蔦 經R 0.35 偵 " 0.58(0.29- 1.16)
HiStolo9lC grade(wellVs moderate+ poor) 蔦 紊B 0.43 偵3 0.64(0.28- 1.49)-
Age(<60yvs ≧60y) 蔦 B 0.34 偵 0.96(0.49- 1.89) 'CTM/Lratio:tumor'sareainthemediastinalCTimage/tumor.sareainthelung CTima9e_100%. C/,ConfidenceintervaL
末梢型小型肺腺癌はCr検診の普及により発見頻度が上昇している｡それと
共に腫癌の大きさが必ずしも肺癌細胞の生物特性を反映していないことが明ら
かとなってきた｡ CT画像上のGGO含有率によって悪性度が変化する事が判明
してきた｡ Table lは､腫虜径3cm以下の小型肺腺癌143例のCr画像と予後を多変量解析によって検討した結果を示している｡ CT画像上のGGO含有率を示
すcT画像における肺野条件と縦隔条件の腫癌面積比は､リンパ節転移の有無
や腫蕩径とともに､独立した有意な予後因子であると認められた｡この事を踏
まえて､ CT画像上の特性がどのように生物特性に反映するかを明らかにする
目的で､外科的切除を行った腫癌径3cm以下の原発性肺腺癌症例131例を対
象に､胸部cr画像､免疫組織化学(p53, Bc1-2, Ki-67, CD44V6, VEGF, CD34, MMP-2, MMP-9, TIMP-2) ､及びK-ras,点突然変異を検討した.
Table 2･ Clinicopathologic characteristics and summary of immunohistochemical studies and K-fas mutations
No.or ﾆ烹 Faint 父% 5-∫ 犯 rﾗ& 豐
patients 宥 U density type+ 蒜 ﾇVR surViyal 友W7E ﾇVR
Sex .91 .40 Male 田 25 b 都b紕 Female 都 28 鼎" 都"絣 Age(y) 田"纔 ﾓ偵r 62.9± 9.6 田2 7湯繧 .54 .94 Tumorsize .03 .01 ≦ZOmm 鉄" 15 r 塔2纈 >20mm 都 38 鼎 田ゅ Nodal inVolVement .09 <.00Wl NO 涛 36 田2 N+VsN N+VsN N1 途 2 迭 N2 R 15 HistologlC grade .015 .02
Well 鼎2 13 WellVs moderate +poor WellVs moderate +poor
Moderate 田2 29 B
Poor 5 B
Ⅰ 涛b 35 田 StageⅠVs stageⅠⅠ- ⅠⅤ StageⅠVs stageⅠト ⅠⅤ ⅠⅠ 唐 2 澱 ⅠⅠⅠ b 16 Ⅳ 1 p53 .64 .16 Positive 田b 28 田r纈 Negative 田R 25 鼎 塔 Ki-67 .04 .03 High 鼎 25 2 田r縒 Low 塔2 28 鉄R 都偵" Bc1-2 .10 .051 Positive 鼎 12 塔" Negative 涛 41 鉄 都 纈 CD44V6 .02 .056 Positive 塔 26 鉄B 都偵B Negative 鉄 27 B 田b紕 VEGF .03 .18 Positive 鉄 26 B 田b縒 Negative 塔 27 鉄B 塔 紕 MVD (CD34) .0009 .23 High 鉄B 31 2 田偵 Low 都r 22 鉄R 都r繧 MMP-2 .01 .82 Positive 田" 34 都R Negative 田 19 鉄 都B MMP-9 .0001 .058 Positive 涛2 47 鼎b 田偵 Negative 6 " 塔r絣 TⅠMP-2 .01 .0005
Positive 涛 30 田 塔2
Negative 鼎 23 鉄R繧
K-rα∫ mutations .α)03 .04
Mutant 15 田"
Wildtype 都r 28 鼎 都ゅB
CT, Computed tomography; VEGF, vascular endothelialgrowth factor; MUD, microvessel density; MMPl2, matrix metalloproteinase 2; MMP-9, matrix metalloproteinase 9; TIMP-2, tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2･
- Solid type: area of the tumor in mediastinal window/area of the tumor in lung window
of 50% or greater･
f Faint density type: area of the tumor in mediastinal window/area of the tumor in lung
window of less than 50%.
Table 3･ Multivariate analyses of prognostic factors according to Table 2･ Variables 埜7F蒙 FVB 6 Vff 坊蹌 SE f ﾇVR RelatiVeRisk(95% CⅠ)
NodalinVolVement(NO VsN+) 蔦"經2 0.36 督 ｓ 0.08(0.04,0.16)
TⅠMP-2 b 0.33 偵 R 2.88(1.50,5.54) Ki-67 蔦 縱" 0.33 3 0.49(0.25,0.93)
Tumorsize(>20mmVs eOmm) 蔦
縱
0.39
C
0.46(0.21,0.99)
SE,'standard error, CJ; confidence interval
Taber 2は単変量解析の結果を､ Table 3は多変量解析の結果を示している｡ So一id-typeとfaint density-typeの間で､性別､年齢､リンパ節転移程度､分化
度の差異は認めず､ faint densJ'ty-tyPeの5年生存率は81･6%と､ solid-typeの 63･8%に比し有意に予後良好であった｡ Ki-67Jabeling index､ VEGF, CD34, MMP-2, MMP-9の発現は､ solid-typeにおいて有意に高かった｡一方､ CD44V6, TIMP-2の発現は､ ねint density-typeにおいて有意に高かったoまた､ p53,
やTIMP-2の低発現では､予後が不良であった｡さらに､ K-rasmutation
を有さない場合の5年生存率は78%とそれを有する場合の62%に比し､有意
に予後良好であった｡多変量解析では､ TIMP-2, Ki-67がリンパ節転移や腫癌
DNA異常メチル化が癌抑制遺伝子のプロモーター領域に起こると､その遺伝子の
不活化を引き起こし､発癌に至ることはよく知られている｡マイクロアレイを利用し たPromoter-associated methylated DNA amplification DNA chipを用いて288の癌関 連遺伝子のプロモーター領域の異常メチル化を肺癌細胞に対して検索した｡
′
Tab一e 3･ Proportion of hypermethylated genes in lung cancers.
Typesor CaTICer FV踐6 &6匁 ﾖ 儡mallceILcarcinoma 剩 妨& vR ３
Namesofcell lines 白ﾓビ A549 U$bﾔﾄ4ﾕ2 LK79一 ﾓ" SBC-3
Hypermethylated Genes(%) "ヲ絣R 15(6.0%) rモ R 20(8.6%) " B縒R 45(18.6%) 纈R
AVerage(%) 途繧R 4.0% 剪
Table 3に示したように､およそ11%の遺伝子にメチル化を認めた｡メチル化は腺
癌では7.8%の遺伝子に､小細胞癌では14%の遺伝子に認めた｡特に､川C1, lRF7,As°, RIPK3, RASSFIA, FABP3, PRKCDBP, PAX3遺伝子はほとんどの肺癌細胞でメチル
化を認めた(Table 4)0
Table 4･ Summary of the results for PMAD analysIS.
Symbol 6友柳 lI87 SB RERF LCM S 板 ｳr S2 $2 2 Hyp. Met. Cells 認W67& F柳
HⅠCl w 2 M 挽 M 挽 M 挽 6 枚 W&ﾖWF ﾆ FVF問 6 W&ﾂ
ⅠRF7 免ﾇ R絣 M 挽 M 挽 M 挽 6 末蹤W&fW& &VwVﾆ F '貿 7F #r
As° g "ﾗ ﾆﾂﾃ" M 挽 M 挽 M 挽 6 F 6 ﾒ 78 V FVG7 V6ｲﾒ ﾆ霧W & FV問 6 蹤 匁匁v 4 $B
likeprotein containlngaCARD
RⅠPK3 G M 挽 M ′ 挽 M 挽 6 V6W F 6r 也FW& 7Fﾆ誦6W&匁Rﾒ F V 譁觀ｶ匁 6S2
RASSF lA # M 挽 ND 挽 M 挽 5 6 76 6 F柳 & ﾄtE2 bﾓb F ﾖ 匁f ﾖ棉鳴
FABP3 棉 32ﾒ 3" M 挽 M 挽 M 比B 5 貿 GG 6芳&匁F匁r & FV悶2ﾆﾗW66ﾆR 襷 V 'B ﾖ ﾖﾖ '椿FW&庸VB w& wF 匁 友 "
PRKC DBP 免ﾇ R紕 M 挽 M 披 B M 挽 5 & FV匁ｶ匁 6T2ﾂ FVﾇF &匁F匁r & FV問
PAX3 3R M 挽 NC 挽 M 挽 5 VF& vV覺2 v &FV W&r 7匁G& ﾖVﾂ
HTRIB 堵 2 M 挽 NC 挽 N C 挽 4 迭ﾒ G& G' F ﾖ匁R W& F 譁笳&V6W F " ﾄ"
CALC A 免ﾇ R ﾒ R ND 挽 ND 挽 M 挽 4 ﾆ6友 譁鬻6 ﾆ6友 ﾖ 6Vﾆ FVB ﾇ W F芳Rﾆ ﾇ
CDH13 g #B ﾒ #B M 挽 NC 挽 N C 挽 4 F W&悶 2ﾄぴ 6 F W&門 V 'B
DLECl #"ﾒ # M 挽 M 披 2 N D 挽 4 芳VﾆWFVF匁ﾇV誚 襭 W6 vV ﾆ6 W&ﾂ
CD38 敵 R M 比2 NC 挽 M 挽 4 C3 蹤没V竍 CR
MYOD 1 免ﾇ R紕 M 比B ND 挽 N C 挽 3 儲柳vV譁6f 7F #2
WTl 免ﾇ 2 M 比B NC 挽 N D 挽 3 夫免ﾗ7GVﾖ #
RARB #B M 比2 NC 披 2 M 比2 2 WF匁 6烹 &V6W F "ﾆ(,｢
PTGS2 棉 #R ﾒ #R ND 比2 NC 挽 N C 挽 2 & 7F vﾆ 襷問ﾒ V襷 W& 芳R 7也F 6S" & 7F vﾆ 襷紋r 7也F 6V 襭 7 ﾆ vV 6R
LRP2 #Bﾒ 3 NC 比2 NC 披 2 M 挽 2 免 vFV 宥 & FV問ﾗ&Vﾆ FVB & FV悶"
SLC5A 5 2 ﾒ " M 比B ND 披 2 N D 挽 2 ﾇWFV6 '&妨" f ﾖ棉迭 F遊ﾒ 柳F芳W7儲 'FW"陳 ﾖVﾖ&W#R
CrNN Bl # NC 比2 NC 挽 M 比B 2 FV譁竊6 F W&問ﾒ 76 6 FVG & FV問陳 &WF ﾃユｴF
AⅠMl 堵 # NC 比2 M 披 2 N C 挽 2 '6V蹤匁ﾖVﾆ 踐ﾖ
ETV6 ' 2 NC 比2 M 挽 N C 比2 2 妨G5f & 蹤vV覺b DTﾆ vV覲
MSF w #R NC 比2 NC 挽 N C 挽 2 番ﾄﾇ6W F問ﾖﾆ霧R gW6柳
DLC1 島 #"ﾒ # M 比2 ND 披 2 N C 挽 2 芳VﾆWFVF匁ﾆ蒜W" 6 W#
L
CASP3 敵 3B NC 挽 M ′ 披 2 N C 比2 2 7 6S2ﾂ F 6 46Vﾆ FVB 7 FV匁W & FV 6R
Genes that were hypermethyfated in at least two of six lung cancer ceLHines are
presented･ M represents hypermethylation in cancer de伽ed as (Normalized
intensity of cancer)/(Normalized intensity of normal) more than 3.0 when normalized intensity of cancer is high enough (more than 0.2). NC represents an absence of'hypermethyJation in cancer defined as (Normalized intensity of cancer)/(Normalized intensity of normal) Jess than 3.0. Results which do not
meet the criteria of M and NC, such as Cy5 intensity less than background or
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