九州大学学術情報リポジトリ

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Kyushu University Institutional Repository

非病原性イネもみ枯細菌病菌によるトマト青枯病及 びイネもみ枯細菌病の発病抑制効果とその機作に関 する研究

古屋, 成人

https://doi.org/10.11501/3054268

出版情報：Kyushu University, 1990, 農学博士, 論文博士 バージョン：

権利関係：

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+ 北 川 郡 先

古屋成人

次

緒 言

頁1

研 究 史 6 

第 l章 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 が 示 す 抗 菌 物 質 産 生 性 1 0 

第 1節 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 が 示 す 抗 菌 活 性 1 1  第 1項 各 種 重 要 植 物 病 原 細 菌 に 対 す る イ ネ も み

枯 細 菌 病 菌 抗 菌 活 性 の 検 定 1 1 

第 2項 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の ト マ ト 青 枯 病 菌 株 に

対 す る 抗 菌 活 性 1 7 

第 2節 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 抗 菌 物 質 産 生 性 2 2  第 1項 液 体 培 地 に お け る 抗 菌 物 質 の 産 生 2 2  第 2項 抗 菌 物 質 産 生 性 に 及 ぼ す 寒 天 抽 出 液 の 効 果 2 4 

第 3項 Fe³⁺の 添 加 に よ る 阻 止 帯 形 成 能 の 変 化 2 7 

第 3節 考 察 2 9 

第 2章 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 に よ る ト マ ト 青 枯 病 の 発 病 抑 制 ! と そ の 機 構

第 1節 ト マ ト 青 枯 病 菌 の 接 種 法 と 発 病 条 件 第 l 項 接 種 用 強 病 原 性 菌 株 の 選 別

第 2項 浸 根 接 種 法 に よ る ト マ ト 青 枯 病 の 発 病 率 と 菌 濃 度 と の 関 係

第 2節 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 に よ る ト マ ト 青 枯 病 発 病 抑 制 効 果

第 1項 混 合 液 の 針 接 種 法 に よ る ト マ ト 青 枯 病 発 病 抑 制 効 果

第 2項 浸 根 処 理 に よ る 発 病 抑 制 効 果 第 3項 土 壌 の 種 類 と 発 病 抑 制 効 果

第 4項 ト マ ト 青 枯 病 発 病 抑 制 効 果 の 菌 株 間 差 異

第 3節 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 と ト マ ト 青 枯 病 の 各 種 条 件 下 に お け る 競 合

第 1項 液 体 培 地 中 、 滅 菌 水 中 及 び 滅 菌 土 壌 中 に お け る 競 合

第 2項 ト マ ト 根 組 織 上 に お け る 競 合

第 4節 発 病 抑 制 効 果 に お け る 抗 菌 物 質 の 関 与 第 1項 NTG処 理 に よ る 抗 菌 物 質 非 産 生 性 イ ネ

3 1 

3 1  3 1 

3 3 

3 5 

3 5  3 8  4 3  4 5 

4 8 

4 8  5 4 

5 6 

も み 枯 細 菌 病 菌 株 の 作 出 5 6  第 2項 抗 菌 物 質 非 産 生 株 を 用 い た ト マ ト 青 枯 病

発 病 抑 制 効 果 6 0 

第 3項 ト マ ト 根 組 織 中 に お け る 抗 菌 物 質 産 生 性

誘 導 の 可 能 性 6 2 

第 4項 死 菌 に よ る ト マ ト 青 枯 病 発 病 抑 制 効 果 6 3 

第 5節 物 理 的 閉 塞 の 影 響 6 7 

第 l項 パ ラ フ イ ン 、 メ チ ル セ ル ロ ー ス 処 理 に よ る

発 病 抑 制 効 果 6 7 

第 2項 根 切 断 が 発 病 抑 制 効 果 に 及 ぼ す 影 響 6 9 

第 6節 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 菌 体 リ ポ 多 糖 (LPS)

及 び 菌 体 外 多 糖 (EPS)に よ る 発 病 抑 制 効 果 7 1  第 l項 菌 体 リ ポ 多 糖 (LPS)に よ る 発 病 抑 制 効 果 7 1  第 2項 菌 体 外 多 糖 (EPS)に よ る 発 病 抑 制 効 果 7 3  第 3項 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 洗 浄 菌 体 及 び 培 養

ろ 液 に よ る 発 病 抑 制 効 果 7 5 

第 7節 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 以 外 の 各 種 細 菌

に よ る 発 病 抑 制 効 果 7 7 

第 1項 各 種 植 物 病 原 細 菌 及 び 腐 生 菌 に よ る 発 病

抑 制 効 果 7 7 

第 8節 考 察 8 2 

第 3章 非 病 原 性 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 に よ る イ ネ 幼 苗 腐 敗 症 及 び イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 発 病 抑 制 と

そ の 機 構

第 1節 非 病 原 性 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 選 男11

第 2節 非 病 原 性 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 に よ る イ ネ 幼 苗 腐 敗 症 の 発 病 抑 制 効 果

第 1項 発 病 抑 制 効 果 の 菌 株 間 差 異 第 2項 浸 漬 処 理 用 の 菌 濃 度 と

発 病 抑 制 効 果 と の 関 係

第 3項 非 病 原 性 N7503菌 株 の 各 種 病 原 性 菌 株 に 対 す る 発 病 抑 制 効 果

第 4項 カ ス ガ マ イ シ ン ・ キ ャ ブ タ ン 水 和 剤 と の 発 病 抑 制 効 果 の 比 較

第 5項 発 病 抑 制 効 果 の 品 種 間 差 異

第 3節 非 病 原 性 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 に よ る イ ネ 幼 苗 腐 敗 症 発 病 抑 制 機 作

第 1項 非 病 原 性 菌 株 の 病 原 性 菌 株 に 対 す る 抗 菌 活 性

第 2項 他 種 細 菌 に よ る 発 病 抑 制 効 果

第 3項 非 病 原 性 菌 株 培 養 ろ 液 に よ る 発 病 抑 制j 効 果

8 6 

8 8 

9 1  9 1 

9 7 

9 9 

1 0 0   1 0 2  

1 0 6  

1 0 6   1 0 9 

1 1 1  

一一一 」

」

第 4項 死 菌 に よ る 発 病 抑 制 効 果 1 1 2  

第 5J頁 種 子 処 理 法 及 び 接 種 法 の 違 い が 発 病

抑 制 効 果 に 及 ぼ す 影 響 1 1 4  

第 6項 イ ネ 発 芽液 中 及 び 滅 菌 土 壌 中 に お け る競 合 1 1 8 

第 7項 イ ネ も み 上 に お け る 競 合 1 2 2  

第 8項 病 原 性 菌 株 の 産 生 す る 毒 素 と 発 病

抑 制 効 果 と の 関 係 1 2 5  

第 4節 非 病 原 性 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 穏 に 対 す る

発 病 抑 制j効 果 1 2 7  

第 5節 考 察 1 2 9  

第 4章 総 合 考 察 1 3 4  

摘 要 1 3 7  

Summary  1 4 3  

引 用 文 献 1 4 6  

緒言

植 物 の 病 害 防 除 は 従 来 、 主 に 抵 抗 性 品 種 の 育 成 と 利 用 、 並 び に 農 薬 を 利 用 す る こ と に よ って 行 わ れ て き た 。 こ れ ら の 防 除 方 法 が 農 作 物 の 生 産 向上 を も た ら し 、 食 料 供 給 の 安 定 化 に 大 き な 役 割 を 果 た し てきた こ と は 周 知 の 事 実 で あ る 。 特 に 、

1950

年 代 か ら 開 発 さ れ た 多 種 類 の 新 農 薬 が 果 た し た 役 割 は 大 き い 。 し か し な が ら 、 土 壌 病 害 の 防 除 は 農 薬 の 使 用 に よ って も 困 難 で あ る 場 合 が 多 い 。 特 に 細 菌 性 の 土壌 伝 染 性 病 害 に 関 し て は 的 確 な 防 除 法 が ほ と ん ど な い の が 現 状 で ある 。 し か も 農 薬 の 過 剰 使 用 は 、 水 質 、 土 壌 及 び 大 気 等 の 環 境 を 汚 染 さ せ る 危 険 性 と 食 品 に 残 留 す る こ と に よ る 人 畜 へ の 影 響 が 懸 念 さ れ て お り 、 そ の 上 、 薬 剤 耐 性 菌 の 出 現 、 あ る い は 潜 在 的 病 害 の 顕 在 化 等 が 問 題 に な り 、 農 薬 の 開 発 と 使 用 に は 一 層 の 配 慮 が 必 要 に な り つ つ あ る。 こ の よ う な 背 景 か ら 、 耕 地 生 態 系 を 乱 す こ と の な い 、 よ り 自 然 、 に 立 脚 し た 防 除 法 と し て の 生 物 的 防 除 法 が 重 視 さ れ る よ う に な り 、 世 界 各 国 で そ の 研 究 が 盛 ん に 進 め ら れ て い る 。

生 物 的 防 除 法 3 2 ) と は 、 生 物 的 手 段 、 即 ち 、 あ る 種 の 微 生 物 、 そ の 産 物 、 あ る い は そ の 遺 伝 子 な ど を 利 用 す る こ と に よ っ て 病 害 の 発 生 を 制 御 す る 方 法 で あ り 、 こ れ に 類 す る 方 法 は 古 く か ら 行 わ れ て き た 。 既 に

17

世 紀 に 行 わ れ た リ ン ゴ 腐 ら ん 病 (Valsa cθra tos perma)に 対 す る 牛 ふ ん の 塗 布 3) に は じ ま り 、 今 日 も 行 わ れ て い る 輪 作 、 残 澄 の 焼 却 、 有 機 質 肥 料 多 用 等 の 耕 種 的 防 除 法 ゃ あ る 種 の 微 生 物 製 剤jの 利 用 な ど は す べ て 生 物 的 防 除 法 の 中 に 含 ま れ る 。 植 物 の 病 害 を 防 除 す る 上 で 今 日 考 え な け れ ば な ら な い 問 題 は 、 近 代 農 業 の 中 で 如 何 に して 効 果 的 で し か も 安 全 な 防 除 法 を 確 立 す る か で あ る 。 現 在 の と こ

‑1‑

ろ 、 い ず れ の 防 除 法 も 決 し て 万 能 で は な く 、 各 種 の 防 除 手 段 を 互 い に 矛 盾 な く 調 和 さ せ な が ら 、 合 理 的 に 併 用 す る 乙 と に よ っ て 被 害 を 経 済 的 許 容 水 準 以 下 に 低 下 さ せ る 乙 と が 必 要 で あ る 。 特 に 生 物 的 防 除 法 に お い て は 病 原 菌 を 絶 滅 さ せ る 乙 と が 目 的 で は な く 、 耕 地 生 態 系 で 機 能 し て い る 括 抗 要 因 を 最 大 限 に 利 用 し 、 そ の 働 き を 保 護 、 助 長 す る よ う に 環 境 条 件 を 積 極 的 に 変 え て い く こ と が 重 要 で あ る 。 即 ち 、 自 然 、 界 に お い て 植 物 病 原 菌 の 生 存 及 び 活 動 を 妨 害 す る も の は 全 て 生 物 的 防 除 の 目 的 で 利 用 で き る 可 能 性 が あ る 。

植 物 の 細 菌 病 及 び 菌 類 病 に 対 す る 生 物 的 防 除 に 関 す る 研 究 は 数 多 く 報 告 さ れ て お り 、 利 用 さ れ て い る 括 抗 細 菌 と し て は Actinopla‑

n θ sl]O. 156)， Agrobactθrium80. 8 1 . 8 2 . 1 1 5 . 1 6 5 )， Alcaligθnes36. 

205.  2 0")， Amorphosporangium" 0)， Arthrobactθ r9 2，1 1 2 . 1 4 9 )，  A Z 0 t 0 b a 

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C θ l l U l o m o n a s I 8 1 )， Enterobacter61.  9 " . 1 1 7 . 1 1 8 .15 0. 1 77. 1 78. 1 8 0) 

Erwinial50) ，  Flavobacterium27_・91]) ， Hafnial49. 150・151)， Micromonospora" ⁰⁾， Psθu d 0 m 0 n a s e ~: A ~; T Y 0 .2 ~  ^'1~ ^: '1  ~ ~ :

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^{，8 6}・， Pasteuria1 " . 1 3 7 . 1 3 8 . 1 5 " )， Rhizo‑ bium21. 1 7 1 . 1 7 2 )， Serratial49.  ^{15 0. 151)}， Streptomycesl3. ^{2" . 10 7 .}  

108.13 1. 1 8 1 )及 び Xanthomonas27.9")等 が 挙 げ ら れ て い る が 、 中 で も 特 に Psθudomonas属 細 菌 が 最 も 多 く 利 用 さ れ て い る 。 Pseudomonas 属 細 菌 と し て は P.fluorescens，P.putida， P.cepacia等 が 用 い ら れ 、 ジ ャ ガ イ モ 、 コ ム ギ 、 キ ュ ウ リ 、 ワ 夕 、 カ ー ネ ‑ シ ョ ン 等 多 く の 作 物 を 対 象 に 研 究 が な さ れ て い る 。

ジ ャ ガ イ モ の 種 イ モ に 蛍 光 性 の Pseudomonas属 菌 を 塗 布 す る と 生 育 が 促 進 さ れ 収 量 が 増 加 す る 乙 と が 明 ら か と な り 1 7 ¥ そ の 後 、 同

‑2‑

一 」

様 な 効 果 は サ ト ウ ダ イ コ ン 、 ハ ツ カ ダ イ コ ン 等 多 く の 作 物 で 報 告 さ れ い .1  11G)、K1 0 e p p e r 8 :1. R 11.  H，;) ら は こ の よ う な 細 菌 を 植 物 成 育 促 進 性 根 圏 細 菌 (Plant growth  promoting  rhizobacteria:  PGPR)と 呼 称

した。 PGPRは 根 に 定 着 し 、 Feキ レ ー ト 物 質 、 す な わ ち 、 各 種 の siderophore(pseudobactinな ど )1 (j  1.  I 6 2 )を 産 生 す る 。 有 害 な 根 圏 細 菌 (deleteriousrhizobacteria:  DRB)は こ れ に よ っ て 鉄 欠 乏 状 態 に

な っ て そ の 生 育 と 根 へ の 吸 着 が 阻 害 さ れ 、 DRBと 置 き 変 る こ と に よ っ て 作 物 の 成 育 が 良 好 に な る と 考 え ら れ て い る 88.89.90)。

コ ム ギ 立 枯 病 の 抑 止 土 壊 は 世 界 的 に 広 く 知 ら れ て お り 、 そ の 機 作 に つ い て は 種 々 の 仮 説 が あ る が 、 Cookら は 蛍 光 性 Pseudomonasが 関 与 し て い る と し 31 ) 、 そ の 蛍 光 性 Pseudomonasを コ ム ギ 種 子 に コ ー テ

イ ン グ 処 理 す る と 立 枯 病 の 発 病 を 抑 え 、 増 収 す る こ と を 明 ら か に し

た I9 2. I 9 3 ) 。 そ し て 、 乙 の 発 病 抑 制 機 構 は 抗 生 物 質 産 生 、 siderop‑

hore産 生 、 あ る い は そ の 両 者 の 産 生 の い ず れ か に よ る も の で あ り 、 乙 れ ら 産 生 性 に 関 与 す る 遺 伝 子 を 取 り 除 く と 発 病 抑 制 の 機 能 が な く な る と 報 告 さ れ て い る 60)。

カ リ フ ォ ル ニ ア 州 Salinas Valleyの 土 壊 は 、 Fusarium萎 ち ょ う 病

を 抑 止 す る こ と が 知 ら れ て お り 、 乙 の 抑 止 機 構 に は Pseudomonas SP. 

を 主 体 と す る 括 抗 微 生 物 が 重 要 な 役 割 を も ち 、 siderophoreが 関 与

し て い る 乙 と が 明 ら か に さ れ て い る 139.1110.1112・I:;  0 )。

また、 Howellら は ワ タ 幼 苗 の 根 圏 か ら 分 離 し た P.fluorescensを

種 子 に 施 す こ と に よ っ て Pythiumultimum及 び Rhizoctonia solanI  に よ る ワ タ 幼 苗 立 枯 病 の 発 病 が 抑 制 さ れ 、 こ の 発 病 抑 制 機 情 は こ の 細 菌 が 産 生 す る 2種 類 の 抗 生 物 質 pyrrolnitrinとpyoluteorinで 説 明 さ れ て い る 6 7.  6 8 )。

ミJ

さ ら に わ が 国 に お い て は 、 本 間 ら は P.cepaciaがpyrrolnitrinや pseudane等 の 抗 生 物 質 を 産 生 す る 乙 と を 明 ら か に し 、 ダ イ コ ン 苗 立 枯 病 や ナ ス 半 身 萎 ち ょ う 病 を 抑 制 す る 乙 と を 示 し た 。 ま た 、 ニ トロ ソ グ ア ニ ジ ン 処 理 に よ っ て 抗 生 物 質 産 生 能 を 消 失 し た 突 然 、 変 異 株 は 発 病 抑 制 能 力 を 失 う 乙 と か ら 、 こ れ ら 抗 生 物 質 産 生 と 発 病 抑 制 と の 関 係 を 示 唆 し た 6 6)。 有 江 及 び 木 鳴 ら は ユ ウ ガ オ つ る 害j病 . の 防 除 の た め に は 、 抗 生 物 質 産 生 性 の P.gladioliで 処 理 し た ネ ギ 、 ニ ラ と の 混 植 が 有 効 で あ る こ と を 報 告 し て い る 2) 。 以 上 の よ う に Psθudo‑ monasを 利 用 し た 生 物 的 防 除 は 多 方 面 か ら 研 究 が 進 め ら れ て い る が 、 実 用 化 の 段 階 に 至 っ て い る も の は 少 な く 、 解 決 し な け れ ば な ら な い 問 題 が 数 多 く 残 さ れ て い る の が 現 状 で あ る 。

植 物 細 菌 病 の 生 物 的 防 除 の 中 で 最 も 代 表 的 な 例 と し て 根 頭 が ん し

ゅ病の生物的防除がある。 Kerr⁸⁰• ⁸¹ ) 及び Ht ay 71) らはモモの擢病

部 か ら 根 頭 が ん し ゅ 病 菌 (Agrobacterium tumefaciθn s)に 対 し て 抗 菌 性 を 示 す 非 病 原 性 の 変 異 株 A.radiobacterstrain  84を 分 離 し 、

乙 れ を 10⁷‑8 cfu/mlの 濃 度 で モ モ の 幼 苗 ま た は 種 子 に 接 種 し て 汚 染 土 壌 に 栽 培 す る と 、 発 病 が 著 し く 抑 え ら れ る 乙 と を 示 し た 。 こ の 効 果 は 世 界 各 国 で 確 か め ら れ 、 世 界 的 に 広 く 普 及 し て い る 11， 5 )。こ の 発 病 抑 制 の 作 用 機 作 は 、 非 病 原 性 の A.radiobacterstrain84が 産 生 す る ア グ ロ シ ン 84の 作 用 に よ る も の で あ る と し た 81 ) 。 ア グ ロ シ ン84は バ ク テ リ オ シ ン の 一 種 で あ り 、 病 原 菌 の DNA合 成 、 細 胞 壁 合 成 の 阻 害 に よ る 殺 菌 効 果 と 、 A.t umefac i ensの 植 物 受 容 体 へ の 吸 着 を 阻 害 す る こ と に よ り 発 病 を 抑 制 す る と 考 え ら れ 、 ア グ ロ シ ン 84に 対 す る 病 原 菌 の 感 受 性 と 生 物 的 防 除 効 果 は 一 致 す る も の と さ れ て き た れ ) 。 し か し 、 strain84に よ る 効 果 が 地 域 や 作 物 の 種 類 に よ っ て

一4‑

は十 分 で な い 事 例 8 2)や ア グ ロ シ ン 84に 耐 性 あ る い は 弱 感 受 性 の 病 原 菌 に 対 し て も 高 い 防 除 効 果 を 示 す 事 例 ^{3 0}・10 '1 )も あ り 、 こ れ ら の 作 用 機 作 は 必 ず し も 単 純 で な い 乙 と が 判 明 し て い る 。

以上 述 べ た よ う に 植 物 細 菌 病 の 生 物 的 防 除 に お い て 、 括 抗 菌 処 理 が 発 病 抑 制 効 果 を 示 し 、 そ の 効 果 に 抗 生 物 質 産 生 が 関 与 し て い る 可 能性 を 暗 示 し た 事 例 は 多 く 報 告 さ れ て い る が 、 そ の 抑 制 機 構 に つ い て詳 細 に 研 究 し た 例 は 少 な く 、 今 後 生 物 的 防 除 法 を 開 発 す る た め に は 発 病 抑 制 の 機 構 を 詳 し く 研 究 す る こ と が 必 要 と 恩 わ れ る 。

著 者 ら は Psθudomonas属 細 菌 の 中 の イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 CP.glumae) が 各 種 重 要 植 物 病 原 細 菌 に 対 し て 幅 広 く 、 か っ 、 強 い 抗 菌 ス ベ ク ト ラム を 有 す る 細 菌 で あ る こ と を 発 見 し 18 4 ) 、 本 細 菌 を 利 用 す る 生 物 的 防 除 の 可 能 性 を 検 討 し た 。 す な わ ち 、 ま ず 土 壌 伝 染 性 細 菌 病 菌 の 中 、 特 に 重 要 な ト マ ト 青 枯 病 ( 病 原 菌 :P.  solanacearum)に 対 す る 利 用 の 可 能 性 を 探 る 目 的 で 、 そ の 発 病 抑 制 の 効 果 と 機 構 に つ い て 検 討 し4 2 . 4 3.44.45. 1 85)さ ら に 、 本 菌 の 非 病 原 性 変 異 株 を 利 用 し て 病 原 性 菌 株 に よ る イ ネ 幼 苗 腐 敗 症 の 生 物 的 防 除 効 果 を 検 討 し 4 6.124)、 両 者 に 対 す る 発 病 抑 制j機 構 の 解 明 を 試 み た 。

本 研 究 を 遂 行 す る に あ た っ て 、 終 始 懇 篤 な ご 指 導 と ご 鞭 援 を 賜 わ り 、 か っ 本 稿 の ご 校 関 を も 賜 わ っ た 九 州 大 学 農 学 部 教 授 脇 本 哲 博 士 に 衷 心 よ り 感 謝 の 意 を 表 す る 。 ま た 、 九 州 大 学 農 学 部 助 教 授 松 山 宣 明 博 士 に は 本 研 究 遂 行 上 多 大 の ご 指 導 と ご 援 助 を 頂 い た 。 記 し て 深 謝 の 意 を 表 す る 。 な お 、 実 験 の 遂 行 に あ た り 、 多 大 の ご 協 力 を 惜 し ま れ な か っ た 九 州 大 学 農 学 部 植 物 学 教 室 の 諸 氏 に 謝 意 を 表 す る o

只J

研 究 史

生 物 的 防 除 に 類 す る 研 究 は 古 く か ら 行 わ れ て い た よ う で あ る

Austein(1657) 3)は リ ン ゴ の か い よ う 病 の 防 除 の た め に 努 定 し た 部 位 を 牛 ふ ん で 処 理 す る 方 法 を 提 唱 し て い る 。 ま た 、 Forsyth(1791)

1 1

  1 )は リ ン ゴ の 木 の 傷 口 を 牛 ふ ん 、 石 灰 、 木 灰 、 砂 等 で 処.理 す る こ と に よ り リ ン ゴ ふ ら ん 病 の 防 除 が 可 能 な 乙 と を 示 し た 。 こ れ ら 牛 ふ ん あ る い は 土 壌 処 理 に よ る 発 病 抑 制jの 機 構 に つ い て は 、 Grosclaude (1970)55)に よ っ て 括 抗 微 生 物 が 関 与 し て い る こ と が 明 ら か に さ れ た。

Roberts(1874) 130)は 微 生 物 聞 の 括 抗 現 象 (antagonism)に つ い て 初 め て 記 述 し た 。 さ ら に 、 Waksman(1947) 186)は 抗 生 物 質 (antibio‑ tic)に つ い て 、 「 抗 生 物 質 と は 微 生 物 の 産 生 す る 化 学 物 質 で 他 の 微 生 物 の 増 殖 を 阻 害 す る も の J と 定 義 し た 。 一 方 、 SanfordとBroad‑ foot(1931) 1 35)は コ ム ギ 栽 培 圃 場 の 土 壌 、 根 及 び 茎 か ら 各 種 の 細 菌 糸 状 菌 及 び 放 線 菌 を 分 離 し 、 こ れ ら 分 離 菌 株 を 用 い て 土 壌 処 理 を 行 い Gaeumannomyces graminis var.  triticiに よ る コ ム ギ の 立 枯 病 の 抑 制 効 果 に つ い て 調 べ た 結 果 、 い く つ か の 菌 株 で 高 い 発 病 抑 制 効 果 を 認 め 、 植 物 病 理 学 の 分 野 に 初 め て 生 物 的 防 除 (biological cont‑ rol)及 び 抑 制j効 果 (suppressive effect)の 用 語 を 導 入 し た 。 そ し て 微 生 物 聞 の 括 抗 現 象 、 特 に 抗 生 物 質 産 生 性 を 利 用 し た 植 物 病 害 の 防 除 の 試 み 、 即 ち 、 生 物 的 防 除 に 関 す る 研 究 が 様 々 な 面 か ら 行 わ れ る よ う に な っ た 。

括 抗 微 生 物 を 直 接 土 壌 に 混 入 す る こ と に よ る 植 物 病 害 防 除 の 試 み は 1920"'‑'1940年 の 期 間 に 盛 ん に 行 わ れ た 。 Hartley(1921)62)は

‑6‑

pythium debaryanumに よ る マ ツ の 幼 苗 の 立 枯 病 を 防 除 す る た め に 13 種 類 の 括 抗 糸 状 菌 を 用 い て 土 壌 処 理 を 行 い 、 そ の 効 果 を 認 め て い る 。

また、 Millardと Taylor(1927)111)は Streptomyces scabiesに よ る ジ ャ ガ イ モ そ う か 病 の 発 病 が 括 抗 細 菌 S.praθcoxを 用 い る 乙 と で 抑 制 さ れ る 乙 と を 示 し た 。 さ ら に 、 Henry(1931)63)は 土 壌 か ら 8種 類 の 放 線 菌 、 糸 状 菌 及 び 細 菌 を 分 離 し 、 こ れ ら を 用 い て 土 壌 処 理 し た 場 合 に Hθlminthosporium sativumに よ る 小 麦 の 病 気 が 抑 制 さ れ る こ

と を 報 告 し て い る 。

括 抗 微 生 物 に よ る 土 壌 中 で の 抗 菌 物 質 産 生 性 と そ れ に よ る 病 原 菌 の 増 殖 と 発 病 の 抑 制 に 関 与 す る 研 究 は 抗 生 物 質 の 発 見 以 来 精 力 的 に 行 わ れ て い る 。

Weindl ing(1932， 1936) 188・18 ^9， 1 ⁹ 0 )は Trichoderma virideが 土 壌 伝 染 性 病 原 菌 の 括 抗 微 生 物 で あ る こ と を 示 し 、 そ れ が Rhizoctonia solaniに 対 し て 強 い 抗 菌 性 を 示 す 抗 生 物 質 gliotoxinを 産 生 す る こ と を 報 告 し 、 こ れ を 純 化 し た 。 ま た 、 Grossbard(1948，1952)さ ら に 、 は Penicillium patulumが グ ル コ ー ス と 小 麦 の 茎 を 添 加 し た 滅 菌 土 壌 中 で clavacin(patulin)を 産 生 す る こ と を 証 明 し た 。 そ し て 、 Wright(1956)200)は Tricoderma viridθ (Gliocladium?)が 種 子 表 面 で 抗 生 物 質 を 産 生 す る 乙 と に よ っ て PythiumSp.に よ る 立 枯 病 を 抑 制 す る 乙 と を 示 し た 。 一 方 、 Bruehl  (1969) 1 ⁵⁾ は Cephalosporium gramlneumが 小 麦 の 茎 中 で 広 い 抗 菌 ス ペ ク ト ラ ム を 持 つ 抗 菌 物 質 を 産 生 し 、 基 質 の 存 在 下 で 2'"'‑'  3年 間 生 態 的 に 優 位 な 状 態 に あ り 、 抗 菌 物 質 非 産 生 株 は 数 か 月 で 腐 生 性 の 微 生 物 に よ っ て 駆 逐 さ れ る 乙 と を 示 し た 。 さ ら に 、 KloepperとSchroth(1981)86^，87^，88)は 広 い 抗 菌 ス ペ ク ト ラ ム を 有 す PseudomonasSpp.を 作 物 の 種 子 に 接 種 し て 播 種 し

‑7‑

た 場 合 に は 作 物 の 生 育 が 良 好 と な り 、 抗 生 物 質 非 産 生 性 株 で は そ の 効 果 が 認 め ら れ な い 乙 と を 示 し た 。

生 物 的 防 除 法 の 成 功 例 と し て 特 に 注 目 さ れ て い る の は 、 Agrobac‑ tθrium  radiobacter  strain  84に よ る 根 頭 が ん し ゅ 病 の 防 除 で あ る 。 NewとKerr(1972)120)は 根 部 に A. radiobacter 84を 接 種 し た モ モ の 苗を、 A.tumefaciens汚 染 土 壌 に 移 植 し た と 乙 ろ 、 3か 月 後 に 対 照 区 の 感 染 率 79% に 対 し 、 処 理 区 で は 31 % と 発 病 が 著 し く 抑 制 さ れ た 乙 と を 報 告 し た 。 そ の 後 、 乙 の 細 菌 は 世 界 各 国 で 追 試 さ れ 、 多 数 の 植 物 で 有 効 で あ る 乙 と が 証 明 さ れ 実 用 化 さ れ て い る 。 こ れ ら の 研 究 を き っ か け に パ ク テ リ ゼ ー シ ョ ン ( 作 物 の 根 面 あ る い は 土 壌 根 圏 か ら 分 離 し た 細 菌 を 種 子 や 根 に 接 種 す る 乙 と に よ り 病 気 を 予 防 し た り 、 生 育 を 促 進 さ せ よ う と す る 方 法 ) を 利 用 し た 土 壌 病 害 防 除 の 研 究 が 行 わ れ る よ う に な り 、 近 年 、 こ の 方 法 に よ る 土 壌 病 害 の 防 除 の 研 究 例 が 数 多 く 報 告 さ れ て い る 。 バ ク テ リ ゼ ‑ シ ョ ン の 機 作 の 一 つ に 抗 生 物 質 の 関 与 が あ る 。 し か し 、 培 地 上 で の 抗 菌 性 や 抗 菌 物 質 産 生 性 を 認 め た だ け で 短 絡 的 に 生 物 的 防 除 の 機 作 に 結 び つ け て い る こ と が 多 い 。 桔 抗 微 生 物 に よ る 抗 菌 物 質 産 生 性 が 生 物 的 防 除 に 関 与 し て い る か 否 か 、 ま た そ れ を 含 め た 発 病 抑 制 の 機 作 に つ い て 詳 細 に 研 究 し た 例 は 多 く な い 。 さ ら に 、 わ が 国 で は 、 土 壌 伝 染 性 細 菌 病 は 薬 剤 防 除 が 困 難 で 、 種 々 の 作 物 で 深 刻 な 問 題 と な っ て い る に も か か わ ら ず そ の 生 物 的 防 除 に つ い て は 殆 ど 研 究 の 蓄 積 が な く 、 欧 米 諸 国 に 比 べ か な り 遅 れ て い る の が 現 状 で あ る

バ ク テ リ ゼ ‑ シ ョ ン が 農 業 技 術 と し て 利 用 さ れ る に は 今 後 解 決 さ れ な け れ ば な ら な い 多 く の 問 題 が 残 さ れ て い る 。 今 後 の 生 物 的 防 除 の 研 究 の 一 つ の 方 向 は 、 こ れ ま で に 蓄 積 さ れ て き た 多 数 の 有 望 な 措

‑8‑

抗 微 生 物 に い か に し て 園 場 レ ベ ル に お い て も 安 定 し た 効 果 を 示 さ せ る か に あ る 。 そ の た め に は 防 除 効 果 発 現 に 及 ぼ す 諸 要 因 を 括 抗 菌 、 病 原 菌 及 び 作 物 と の 関 連 に お い て 解 析 し 、 そ の 機 構 を 明 ら か に し て い く 乙 と が 重 要 で あ る 。

~-

第 1章 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 が 示 す 抗 菌 活 性 及 び 抗 菌 物 質 産 生 性

Pseudomonas属 細 菌 が 産 生 す る 抗 菌 物 質 と し て は 、 ジ ャ ガ イ モ 塊 茎 か ら 分 離 さ れ た P.fluorescθns及 び P.putidaが 産 生 す る pseudo‑ bactin 8 5， 145， 1 61~， 162)、 ワ タ の 根 圏 か ら 分 離 さ れ た P.f1 uorθscens  が産 生 す る pyrrol n i t r i n 6 7 1とpyoluteorin^68l及 び パ ー ミュータ.グラス の 葉 か ら 分 離 さ れ た Pseudomonas Sp.が 産 生 す る syringomycin^{5 6，}5 7 1 4 8 1とsyringotoxin^57lな ど が 報 告 さ れ て い る 。 乙 の よ う に Pseudo‑ monas属 細 菌 は 生 理 的 に 多 能 な 細 菌 で あ り 、 多 種 類 の 生 理 活 性 物 質 を 産 生 す る 事 が 知 ら れ て い る 。 こ れ ら 各 種 生 理 活 性 物 質 を 産 生 す る Pseudomonas属 細 菌 の 内 、 P.f 1 u 0 rθscensや P.putida等 は 生 物 的 防 除 の 素 材 と し て も そ の 利 用 価 値 が 高 く 評 価 さ れ て い る 。 脇 本 ・平 八 重 ら は 生 物 的 防 除 に 有 効 な 素 材 を 得 る た め に 広 く 自 然 界 か ら 強 い 抗 菌 活 性 を 有 す る 細 菌 の 探 索 を 試 み た 結 果 、 P.g1adio1ipv.  gladio1i 

E ‑ 1 4

を 発 見 し た 65)0 P.g1adioli pv.  gladio1iと イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 (P.glumae)は 細 菌 学 的 に 近 縁 細 菌 で あ る 乙 と か ら 、 著 者 ら は イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 各 種 重 要 植 物 病 原 細 菌 に 対 す る 抗 菌物 質 産 生 性 に つ い て 検 討 し た 。

‑10‑

第 1節 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 が 示 す 抗 菌 活 性

第 1項 各 種 重 要 植 物 細 菌 病 に 対 す る イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 抗 菌 活 性 の 検 定

1

.  目 的

イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 48菌 株 を 用 い て こ れ ら 菌 株 の 各 種 重 要 植 物 病 原 細 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性 の 有 無 を プ レ ー ト ク ロ ロ ホ ル ム 法 18 4 )に よ り 検 討 し 、 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 が 示 す 抗 菌 ス ペ ク ト ラ ム に つ い て 調 べ た 。

2.  材 料 と 方 法 1 ) 供 試 細 菌

供 試 し た イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 菌 株 及 び 指 示 菌 と し て 用 い た 各 種 重 要 植 物 病 原 細 菌 の 来 歴 は Table 1、2に 示 し た 。 こ れ ら 菌 株 は す べ て 九 州 大 学 農 学 部 植 物 病 理 学 教 室 に お い て 凍 結 乾 燥 し て 長 期 保 存 し た も の で あ る 。 乙 れ ら 菌 体 の 入 っ た ア ン プ ル か ら 常 法 に よ り 乾 燥 菌 体 を 滅 菌 蒸 留 水 に 懸 濁 し 、 こ れ を PSA¹⁸⁴⁾斜 面 培 地 上 に 30 tで 48'"'‑'  72時 間 培 養 後 、 10 mlの 滅 菌 蒸 留 水 の 入 っ た 試 験 管 に 菌 濃 度 が 10 ^7 '"'‑'  10⁸  cfu/mlに な る よ う に 懸 濁 し て 、 25tで 保 存 す る か 、 あ る い は

PSA高 層 培 地 に 2'"'‑' 3日 間 培 養 後 、 流 動 パ ラ フ ィ ン を 重 層 し 、 25

t

で 保 存 し た 。 各 試 験 に 際 し て は 、 そ の 都 度 乙 れ ら 保 存 菌 を PSA斜 面 培 地 に 移 植 し 、 30tで2'"'‑'  3日 間 培 養 し た も の を 供 試 し た 。

‑11‑

.. 

experlment  this 

ln  of Pseudomonas glumae used  Strains 

Table 1. 

Origin 

ーム つI Mq U8_生 F h u

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Variety  Unknown 

1 1  

Koshihikari 

1 1   1 1  

Hayahikari  Unknown 

1 1  

1 1  

Reihou 

1 1   1 1  

Nishihomare 

1 1 

Reiho  National  InstItute! of  Agro‑Environmental  Sciences. 

Fukuoka Agrlcultural  Research Center. 

Kyushu  National  Agricultural  Experiment  Station.  Kyushu University. 

︑ ︑ •• J

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11

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ハ U 1 i u u u u u u u u u u u u u u u u u u u

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Origin 

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Variety 

‑‑EBA ‑‑4r 

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H H H m H H O H  

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円

Isolated  from  Rice  seedl ing 

/ 1  

1 1  

Unknown 

H  H  1 1   1 1  

1 /   1 1  

H 

Rice  grain 

H  1 1  

Strai.n 

十L

tv 

Table 2.  Phytopathogenic bacteria used as  indicator for  testing productivity of  antibacterial substances 

Indicator bacteria  Agrobacterium  tumefaciens Ku7411 

Clavibacter michiganensi! subsp.michiganθnsIS 1~6601

Erwinia carotovora subsp. carotovora N7129  Pseudomonas solanacearum C319 

P.syringae pv.syringae 1 

Xanthomonas campθstris pv. citri N6113‑1  X.campestris pv.oryzae T7174SR(12)b) 

a)  KU: Laboratory of Plant Pathology， Kyushu University.  NIAES:  National  Institute of  Agro‑Environmental Sciences.  HAES:  Hokuriku Agricultural  Experiment Station. 

b)  Streptomycin resistant mutant  induced at KU. 

2  実 験 方 法

Code  A.t  C.m 

E .  

c  P.sol  P.syr  X.c  X.o 

Origin^a) 

KU  NIAES 

HAES 

各 種 重 要 植 物 病 原 細 菌 に 対 す る イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 抗 菌 活 性 の 検 定 に は 、 Fig. _{1~こ示したプレ ー} トクロロホルム法を用いて行った。

す な わ ち 、 寒 天 濃 度 1. 5 %の YPDA^{1 SJ1}) 平 板 培 地 上 に イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 各 菌 株 を 点 接 種 し 、 30 tで48時 間 培 養 し て コ ロ ニ ー を 形 成 さ せ た 後 、 ペ ト リ 皿 を 逆 さ に し 、 上 蓋 に ろ 紙 を 置 い て ク ロ ロ ホ ル ム を 約 1.0 m 1入 れ 2時 間 蒸 気 処 理 し た 。 そ の 後 、 ろ 紙 を と り 除 き 、 再 び ペ ト リ 血 を 逆 さ に し 、 そ の 上 層 に PSA斜 面 培 地 に 30tで48'"'"'72時 間 指 養 し た ト マ ト 青 枯 病 菌 の 浮 遊 液 ( 濃 度 : 約 10⁷ cfu/ml)O.l  mlと、

溶 解 し て 45'"'"'47 tに 保 っ た 5 mlの 素 寒 天 培 地 ( 寒 天 濃 度 :0.5 %)とを 混 合 し て 重 層 し た 。 乙 れ を 30tで48'"'"'72時 間 培 養 し た 後 、 コ ロ ニ ー の 周 囲 に 形 成 さ れ る 阻 止 帯 の 有 無 、 大 き さ に よ っ て 抗 菌 活 性 の 検 定 を 行 っ た 。

‑13‑

L ) .   _glumaθ~

Culture on the plate of YPDA(PSA，廿C)

日

ら

clium(1.5%̲agar)  at 30 t for 

2 4  

hr 

Kill by the treatment with chloroform 

川 1 ，

2 hr) 

Inoculate at 30 

t 

for 

2 4 ‑ 4 8  

hr  Overlay 

￨ I

 

Indicator bacteria ¹¹ 

Culture on the slant of PSA medium  (152W)it30℃ 日 hr Susoend  into sterile distilled  water(ca.  10⁷ cfu/ml) 

Fig.  1.  Plate chloroform method for testing productivity of antibacterial substances. 

3.  実 験 結 果

結 果 は Table 3に 要 約 し た 。 Table 3か ら 明 ら か な よ う に 、 供 試 し た イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌

4 8

菌 株 の う ち 、 Agrobactθrium tumefaciens 

( 根 頭 癌 腫 病 菌 ) に 対 し て は 7菌株、 Clavibacter michiganθnSlゴ

subsp.  michiganensis (ト マ ト か い よ う 病 菌 ) に は 22菌株、

Xanthomonas campθstris pv.  citri (カ ン キ ツ か い よ う 病 菌 ) に は

2 8

菌株、

x .

c.  pv.  oryzae (イ ネ 白 葉 枯 病 菌 ) に 対 し て は

2 7

菌 株 、 Erwinia carotovora subsp.  carotovora (そ 菜 類 軟 腐 病 菌 ) に 対 し て は

1 9

菌株、 Pseudomonassolanacearum (ト マ ト 青 枯 病 菌 ) に 対 し

‑14‑

Table 3.  Production of antibacterial  substances  bv Ps^θudomonas glumae 

Indicator  Isolate 

A. t 

.   c

m E.c  P.  sol  P.syr  X.c  X.o  N7401  ++ 

N7501  +++  +++  ^十 +++  +++  N7502  +  ++ 

N7503  ⁺  ++  +  (+)  (+)  N7504  + 

N7505  +  ++  ^十 YN7805  ++ 

YN7810  ++  YN7825  ^十

742  +++  +++  +  +++  +++  N750  ^{+++  +++}  +++  ((++))   +++  十++

752  ++  +++  +++  +++ +++  805  +++  +++  +++  ^十 +++  +++  806  +  +  +  ++  ++  Pl‑22‑1  十++ +++  +++  +  +十+ +++  Pl‑22‑2  _((++) )  (+)  Pl‑22‑3  +  ((++))  +++   +++  +++  Pl‑22‑4  (+)  +  +  So 1  +++  +++  +  +十+ 十++

8001  ^{+++  +++}  +++  +  +++  +++  8012  ^{+  (+)}  8015  ^{+  +  +}  8017  ^{++  +  ++  +++  +  +++  +++}  8020  ++  +  ++  +++  +  +++  +++  8028  ⁺  + 

++  +  +++  +  +++  +十 ++  ++  +++  +  +++  ++ +‑ 2  ⁽⁺⁾  ++  +++  +  +++  +++  Ku8101  + 

Ku8102  ^{+  +}  Ku8103  ++ 

Ku8104  +  +++  ++  ++  ^十十 Ku8105  ⁺  ++  ++  ++  Ku8111  + 

.' Ku8112  ++  +++  +  +++  (+)  Ku8113  +++  +++  ((++))   +++  +‑++  Ku8114  ++  +  Ku8115  ++  +++  ^十 +++  ++  Ku8116  ++  + 

Ku8117  +  +  +  十++

Ku8119  +  +++  ++  +++  +++  Ku8120  ⁺  +++  ++  +++  +++ 

Ku8121  ⁺⁺⁺  +++  +++  ++  +  +++  Ku8122  +  ++  +  +  +++  Ku8123  ^{++  ++}  +  ++  Ku8124  ^{++  ++}  ++  +  ++ 

Activity: ‑not detected， (+) doubtful， + below 5rrun，  ++ 5‑10mm，+++ above 10mm of the width of  inhibition zone. 

‑15‑

て は 26菌 株 が 、 さ ら に

P .

s.  pv.  syringae~こ対してはイネもみ枯細 菌 病 菌 の 全 て の 菌 株 が 抗 菌 活 性 を 示 し た 。 乙 の 結 果 、 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 は 全 て の 菌 株 が 供 試 し た い ず れ か の 指 示 菌 ( 各 種 重 要 植 物 病 原 細 菌 ) に 対 し て 抗 菌 活 性 を 示 す こ と が 明 ら か と な っ た 。 乙 の 際 、 産 生 菌 ( イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 ) と 指 示 菌 ( 各 種 重 要 植 物 病 原 細 菌 )

と の 組 み 合 わ せ に よ っ て 形 成 さ れ る 阻 止 帯 の 形 状 は 異 な り 、 明 瞭 か っ 大 き な 阻 止 帯 を 形 成 す る 場 合 、 輪 郭 の 不 鮮 明 な 阻 止 帯 を 形 成 す る 場 合 、 あ る い は 全 く 阻 止 帯 を 形 成 し な い 場 合 な ど が 認 め ら れ た 。 指 示 菌 と し て ト マ ト 青 枯 病 菌 を 用 い た 場 合 に 特 に 大 形 の 阻 止 帯 が 形 成 さ れ た 。 乙 れ ら の 結 果 は イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 が 質 的 あ る い は 量 的 に 異 な る 多 種 類 の 抗 菌 物 質 を 培 地 上 に 産 生 す る 乙 と を 示 唆 す る も の で

ある。

‑16‑

ト 青 枯 病 菌 株 に 対 す る 抗 菌 活 性 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の ト マ

第 2項

目 的

ト 青 枯 病 菌 に 対 し て 特 に 強 い 抗 ネ も み 枯 細 菌 病 菌 が ト マ

前 項 で イ

そ こ で 乙 の 抗 菌 活 性 の 程 度 が と が 明 ら か と な っ た 。

菌 活 性 を 示 す 乙

ト 青 枯 病 菌 の 菌 株 に よ っ て 異 な る か 否 か に つ い て 検 討.を 行 っ た 。 トマ

そ の 機 構 を 明 ら か に す る た め に ま た 生 物 的 防 除 に 本 菌 を 供 試 し て 、

本 菌 の 栄 養 条 件 と 抗 菌 活 性 と の 関 係 を 明 確 に し て お く 必 要 が あ は、

ト 三 種 の 異 な る 平 板 培 地 上 に お け る 本 菌 の ト 青 枯 病 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性 の 程 度 を 検 討 し た 。

乙 の 目 的 の た め に 、 る。

マ

材 料 と 方 法 2 

ト 青 枯 病 菌 株 に 対 す る 抗 菌 活 性 の 検 定 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の ト マ

ト 青 枯 病 菌 の 6菌 株 を

マ

4に 示 し た ト 指 示 菌 と し て Table

の た め に 、

ト 青 枯 病 菌 6菌 株 に 対 す る 抗 菌 活 性 を YPDA平 板 乙 れ ら ト マ

用 い た 。

1 ) に よ り 検 討 し た 。 産

ロ ロ ホ ル ム 法

(Fi g.  培 地 を 用 い て プ レ ー トク

YN7805、YN7825、N750、805、N7504、752の 6 生 菌 は イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌

菌 株 を 用 い た 。

Strains of Pseudomonas solanacearum used in  this experiment  Table 4. 

Origin  N6211 

N6275  C319  Ku7501‑1  Ku7502‑1  Ku7601‑1 

a︑J

Q υ b   n ι n b )   A H E

C

M M  

T i m l

ムn u

U日

VA wn

Pathogenicity 

++++++ 

Locality  Kochi  Hokkaido  Kagoshima  Fukuoka  Fukuoka 

I Miyazaki  Host  plant 

green pepper  potato  tobacco  egg plant  tomato  egg plant  Strain 

National  Institute of  _~gro-EnvironI1l8nLal Sciences.  Kagoshima Tobacco Experimental  Station. 

Kyushu University. 

︑1ノ

¥ j︿1/

9U

司hupu

‑17‑

ま た 、 各 種 培 地 上 に お け る イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の ト マ ト 青 枯 病 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性 の 検 定 は 以 下 の 方 法 で 行 っ た 。 培 地 は ジ ャ ガ イ モ 半 合 成 培 地 (PSA)、 YPDA培 地 、 及 び Kelmanに よ っ て ナ ス 科 植 物 青 枯 病 菌 の 病 原 性 識 別 の た め に 開 発 さ れ た テ ト ラ ゾ リ ウ ム 培 地 (TTC)の 3 種 類 を 用 い た (Table 5)。 こ れ ら 培 地 を ペ ト リ 皿 に 15 mlず つ 分 注 し て 固 化 し た 後 、 培 地 の 中 央 部 に PSA斜 面 培 地 に 30 'cで 48‑‑‑‑‑‑72時 間 培 養 し た イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 各 菌 株 を 移 植 し 、 フ レ ー ト ク ロ ロ ホ ル ム 法 (Fig. 1)に よ っ て 、 抗 菌 活 性 の 程 度 を 検 討 し た 。 指 示 菌 と し て

ト マ ト 青 枯 病 菌 C319を 供 試 し た 。

Table 5.  Media used in  this  experiment 

PSA medium 

Potato 300g decoction  1，000 ml  Nad(iP04) ・12H20 2 g  Ca(N03)2・4H₂0 0.5  Peptone  5  Sucrose  15  Agar  15  pH  7.0  YPDA medium 

Peptone  0.6 g  Dextrose  3 11 

Yeast extract  3 11 

Agar  15 11 

Water  1，000  ml  pH  7.2  3)  TTC medium 

Peptone  10  g  Dextrose  5 11 

Casein hydrolysate 

Triphenyltetrazolium Chloride  5 ml  Water  1，000 11 

Agar  17 g 

‑18‑

3  実 験 結 果

実 験 の 結 果 は Table 6及 び 7に 示 し た 。 Table 6か ら 明 ら か な よ う にYN7805、N750、805の3菌 株 は い ず れ の ト マ ト 青 枯 病 菌 の 菌 株 に 対 し で も 同 様 に 強 い 抗 菌 活 性 を 示 し た の に 対 し て 、 YN7825及 び 752は 一 部 の ト マ ト 青 枯 病 菌 菌 株 に 対 し て の み 弱 い 抗 菌 活 性 を 示 し 、 さ ら に N7504は 供 試 し た 全 て の ト マ ト 青 枯 病 菌 の 菌 株 に 対 し て 抗 菌 活 性 を 示 さ な か っ た 。 こ の よ う に イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の ト マ ト 青 枯 病 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性 は 菌 株 に よ っ て 著 し く 異 な る が 、 ト マ ト 青 枯 病 菌 の 感 受 性 に は 菌 株 間 差 異 が 殆 ど 認 め ら れ な い こ と が 明 ら か と な っ た 。

Tab 1e  6.  Antibiotic spectra of Pseudomonas glumae shown by the p1ate‑ch10roform method  Producer  Indicator  (~solanacearum)

(P. glumae)  C319  N6275  7601‑1  N6211  7502‑1  7501‑1  YN7805  ^+++ a)  +++  ++  ++  ++  ++ 

YN7825  +  十 +  + 

N7504 

N750  十++ +++  +++  +++  +++  +++ 

752  +  +  + 

805  +++  +++  +++  +++  +++  +++ 

a) Width of  inhibition zone，一 notdetected. +: below 5 mm.  ++: 5‑10川+++:above 10  mm  b)  Bacteria were cultured on YPDA plates at 30 t for 48  hr and  treated恥ith  chloroform. 

イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の ト マ ト 青 枯 病 菌 に 対 す る 各 種 培 地 上 に お け る 抗 菌 ス ペ ク ト ラ ム は 、 Table 7に 示 し た よ う に 供 試 し た 培 地 の 種 類 に よ っ て 著 し く 変 化 し た 。 こ の こ と は 栄 養 条 件 の 違 い に よ り 産 生

さ れ る 抗 菌 物 質 が 量 的 あ る い は 質 的 に 変 化 し う る も の で あ る こ と を

‑19‑

Table  7.  E ffec t of  the  med i a on  the  fo rIIlat i on of  growth  inh i b i t i on  z one  by Pseudomonas glumaθstrains on  the  lawn  of P.  solanacearum  P.glumae  YPDA  PSA  TTC  P.glumae  YPDA  PSA  TTC 

N7401  ^̲ a)  +  8028  +++  + 

N7501  ++  +  1  +++  ++  + 

N7502  +  +++  111  ++  ++  +++ 

N7503  +  ++  2  +++  +  ++ 

N7504  ₊₊  Ku8101  +  +  ++ 

N7505  ++  ++  +++  Ku8102  +  +  + 

YN7805  +++  ++  Ku8103  ^+十 ₊₊ 

YN7810  ^{十 +} ++  Ku8104  +  + 

YN7825  ^十 ₊₊  Ku8105  十 + ++  ++  742  +++  +++  Ku8106  +++  +  ++  N750  +++  +++  Ku8111  +  +  +++ 

!¥..) 

752  +  ++  +++  Ku8112  ++  +++  + 

Cコ

805  ++ +  +十4 +十十 Ku8113  +++  +  + 十 +

806  +  十 + ++  Ku8114  +++  ++  ++  Pl‑22‑1  +++  +++  Ku8115  +  + 

Pl‑22‑2  +  ++  Ku8116  +  ++  + 

Pl‑22‑3  +  +  Ku8117  +  + 

Pl‑22‑4  +  +  Ku8119  ^十十 + 

So‑l  +++  ++  Ku8120  ^++十 十+十

8001  +  +  Ku8121  +++  +++  +++ 

8012  +  +  +  Ku8122  ^{十 十 +} ++  ++ 

8015  ₊₊  Ku8123  ++  +  十 +

8017  +++  +  Ku8124  +++  +  ++  8020  +  ++ 

a)  Width  of  inhibition  zone  ‑not detected， + below  5 mm， ++ 5‑10  mm，  +++ above  10  mm. 

示 す も の で あ る 。 特 に

T T C

培 地 上 で は 強 弱 の 違 い が あ る も の の 全 て の イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 菌 株 が 抗 菌 活 性 を 示 し た (Fig. 2)の に 対 し 、 逆 に PSA培 地 上 で は 抗 菌 活 性 が 認 め ら れ な く な る 菌 株 が 多 く な り 、 YPDA培 地 上 で は 両 培 地 の 中 間 的 な 産 生 性 を 示 し た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 供 試 し た イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 全 て の 菌 株 が ト マ ト 青 枯 病 菌 に 対 し て 抗 菌 活 性 能 を 有 す る 細 菌 で あ る 乙 と が 明 ら か と な っ た 。

Fig.  2.  Inhibi tion zone formed  on  the  lawn  of Pseudomonas  solanacearum by  P. glumae. 

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第 2節 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 抗 菌 物 質 産 生 性

第 1J頁 液 体 培 地 に お け る 抗 菌 物 質 の 産 生

1.  EI的

前 項 に 記 載 し た よ う に 供 試 し た 全 て の イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 は 寒 天 平 板 培 地 上 に お い て ト マ ト 青 枯 病 菌 に 対 し て 抗 菌 活 性 を 示 す 事 が 明 ら か と な っ た 。 そ こ で こ の 抗 菌 物 質 が 液 体 培 地 中 に お い て も 同 様 に 産 生 さ れ る か 否 か に つ い て 検 討 を 行 っ た 。

2.  材 料 と 方 法

PSA斜 面 培 地 上 で 30t、 48時 間 培 養 し た イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 N750 及 び 805をYPD、PS、TTC(組 成 は Table 5に 示 し た も の か ら 寒 天 の み を 除 い た も の ) 各 液 体 培 地 が 50 mlず つ 入 っ た 三 角 フ ラ ス コ に 菌 濃 度 約 10(; cfu/mlに な る よ う に 接 種 し 、 30 tで 静 置 培 養 を 行 い 、 24時 間 お き に 120時 間 ま で 経 時 的 に 培 養 菌 液 を 分 取 し た 。 分 取 し た 培 養 菌 液 は10，000 X g、で 10分 間 の 遠 心 を 行 っ た の ち 、 そ の 上 清 を 孔 径 0.2 1fm  の メ ン ブ ラ ン フ ィ ル タ ー を 通 す こ と に よ っ て 完 全 に 除 菌 し 、 供 試 試 料 と し た 。 試 料 の 抗 菌 活 性 は ペ ー パ ‑ デ ィ ス ク 法 に よ っ て 検 定 し た 。 す な わ ち 、 予 め 15 mlの YPDA(寒 天 濃 度 1. 5 % ) 培 地 を 流 し て 固 化 さ せ た ペ トリ 皿 ( 直 径 9cm)に 指 示 菌 約 10⁶ cfu/mlを 含 む YPDA(寒 天 濃 度 : O. 5 %)培地 5m 1を 重 層 し た の ち 、 各 試 料 を 約 O.7 m 1し み 込 ま せ た ペ ーパ ー デ ィ ス ク ( 直 径 8 mm)を 置 き 、 30 t で 24~ 48時 間 培 養 後 、 各 デ ィ ス ク の 周 囲 に 形 成 さ れ る 阻 止 帯 の 有 無 及 び 大 き さ に よ っ て 抗 菌 物 質 の 産 生 性 を 検 討 し た 。

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さ ら に 、 寒 天 濃 度 を O、 O.1、 O.5及 び 1.5 %と 4段 階 に 変 え た TTC液 体 培 地 を 作 成 し 、 こ れ に PSA斜 面 培 地 に 30 'cで 48時 間 培 養 し た イ ネ

も み 枯 細 菌 病 菌 株 N750、 805、 Ku8121を そ れ ぞ れ 濃 度 約 10^H cfu/ml  に な る よ う に 接 種 し 、 30 tで 5日 間 培 養 し た 後 、 こ れ ら の 各 培 地 中 に お け る 抗 菌 物 質 の 産 生 性 を ペ ー パ ‑ デ ィ ス ク 法 を 用 い て 調 べ た 。

3  実 験 結 果

供 試 し た 全 て の 液 体 培 地 で 抗 菌 物 質 の 産 生 は 認 め ら れ な か っ た 。

また、 Table 8か ら 明 ら か な よ う に 、 イ ネ も み 枯 細 菌 病 菌 の 抗 菌 物 質 産 生 性 は 寒 天 濃 度 の 影 響 を 受 け る こ と が 明 ら か と な っ た 。 す な わ ち、 TTC培 地 に お い て は 寒 天 濃 度 が

O .

5 % 以 上 の 場 合 に 抗 菌 物 質 の 産 生 性 が 認 め ら れ た 。

Table 8.  Effect of  agar concentration of TTC  medium on production of anti‑Psθudomonas  solanacearum substances by ~glumaθ

Agar concentration (%)  Strain 

。

0.1  0.5  1.5  N750 

805  Ku8121 

+++  +++ 

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