330 蛋 白質 核 酸 酵 素Vol.50No.4(2005)
Review
選択的スプライシングの巧妙さとその破綻
神経難病発症に関連する異常スプライシング
今泉和則
ひとつの遺伝子 か ら多種類の蛋白質を生 じる ことによ り,ヒ トではすべての遺伝子の数 よ りも
はるかに多 い20万 種類以上の蛋白質がつ くり出され ている.こ の多様性を生み出す駆動力 は,
mRNAの
選択的スプライシングである.と ころが,本 来 は精密であ るべ き選択 的スプライシン
グに異常が生 じた場合,機 能を欠いた蛋 白質 あるいは細胞傷害 性の異常蛋白質が産生 され,と
きと して疾患発症 に結 びつ く.本 稿 では,巧 妙 に制御 されたス プライシングの分子機構 と,そ
れ が破綻 したときに生 じる神経疾患の発症機序 について紹介する.
ス プライ シングSR蛋
白質
神経疾患RNA
は じめ に
詳 細 な ゲ ノ ム 解 析 に よ り,ヒ
ト遺 伝 子 の 総 数 は 約
22.000個 で あ る こ とが 判 明 し た.こ
れ は 当初 の 予 想 よ
りもか な り少 な く,シ
ョウ ジ ョ ウバ エ と同 じ ぐ らい の 遺
伝 子 数 に と どま る.こ
こか ら翻 訳 に よ りつ く り出 され る
蛋 白質 は20万 種 あ ま り と考 え ら れ,ひ
とつ の 遺 伝 子 か
ら多 種 類 の 蛋 白 質 を生 じ る こ とで,全 遺 伝 子 数 よ りも は
る か に 多 い,多 種 多 様 の 蛋 白 質 が つ く り出 さ れ て い る.
こ の 多 様 性 を 生 み 出 す 駆 動 力 が,mRNAの
選 択 的 ス プ
ラ イ シ ング にあ る こ とは い う ま で も ない.正
しい 蛋 白 質
発 現 の た め の 成 熟mRNAの
合 成 に は,遺 伝 子 に 散 在 す
る エ キ ソ ンが 正 確 に 選 択 され,そ
れ を分 断す る,は る か
に 長 い イ ン トロ ン を取 り除 くス プ ラ イ シ ング機 構 が精 密
に稼 動 しな け れ ば な らな い.ま
た,ス
プ ラ イ シ ング に 加
え て,mRNAの
安 定 化,細
胞 内 輸 送,さ
ら に は 蛋 白 質
へ の 翻 訳 過 程 が 連 動 し,そ
れ ぞ れ の ス テ ップ が 相 互 に
ネ ッ トワー ク を形 成 して 機 能 的RNAお
よ び蛋 白 質 合 成
が 行 な わ れ て い る こ と も最 近 で は わ か っ て きて い る.
こ れ らRNA自
身,あ
る い はRNA情
報 発 現 系 の 時 間
的 ・空 間 的 な ネ ッ トワ ー クの 解 析 は,ポ
ス トゲ ノ ム時 代
の研 究 と して 脚 光 を 浴 び,現 在,爆 発 的 に拡 大 して きて
い る.RNAワ
ー ル ドの 新 しい 展 開 は 分 子 ・細 胞 レベ ル
に と ど ま らず,高
次 生 命 現 象 に も拡 大 して い る.ス プ ラ
イ シ ン グ を 含 め た転 写 後 調 節 に破 綻 が 生 じた場 合,機
能
を 欠 い た 蛋 白 質 や 細 胞 傷 害 を も た ら す 蛋 白 質 が 産 生 さ
れ,種
々 の 疾 患 発 症 に 結 び つ くこ とが あ る こ と も,遺 伝
学 の 発 展 が 後 押 し とな って 徐 々 に理 解 され る よ う に な っ
て き た.RNA情
報 発 現 系 の 異 常 に 伴 う疾 患 の 分 子 機 構
が 解 明 で きれ ば,さ
ま ざ ま な難 病 の 治療 法 開発 に つ な が
る と と も に,RNA機
能 が 高 次 生 命現 象 に 果 た す 役 割 の
解 明 も可 能 に な る.
本 稿 で は,転
写 後 調 節 の う ち,成 熟mRNA発
現 の 多
様 性 を決 定 す る ス プ ラ イ シ ン グ を ク ロ ー ズ ア ップ し,そ
の 制 御 機 構 の 詳 細 と,そ れ が 破 綻 した と き に生 じ る神 経
難 病 の 発 症 機 構 につ い て 紹 介 す る.
Ⅰ,スプ ライ シ ング制 御 の巧妙 さ
遺 伝 子 か ら前 駆 体mRNAが
転 写 さ れ た の ち,イ
ン ト
ロ ンを 取 り除 き,前 後 の エ キ ソ ン ど う し を結 合 す る反 応
をmRNAス
プ ラ イ シ ン グ と い う.1種
類 の 遺 伝 子 か ら
一 定 の ス プ ラ イ シ ン グ に よ り1種 類 のmRNAが
産 生 さ
れ る場 合 を恒 常 的 ス プ ラ イ シ ン グ,エ キ ソ ンが 選 択 さ れ
て 複 数 の タ イ プ のmRNAが
産 生 され る場 合 を 選 択 的 ス
プ ラ イ シ ン グ と よ ん で い る.イ
ン トロ ン の 平 均 鎖 長 が
3,365塩 基 で あ る の に 対 し,エ キ ソ ン は平 均145塩
基 と
Kazunori Imaizumi,宮 崎 大 学 医 学 部 解 剖 学 講 座 分 子 細 胞 生 物 学 分 野E-mail:imaizumi@med.miyazaki-u.ac.jp Molecular mechanisms of aberrant splicing in neurological disorders
331 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.50No.4(2005) き わ め て 短 い.細 胞 は,こ の 長 い イ ン ト ロ ン 領 域 を い か に 認 識 し,エ キ ソ ン だ け を 結 び つ け て い る の だ ろ う か?
1.恒 常 的 スプ ライ シン グ
遺 伝 子 配 列 に お け る ス プ ラ イ シ ン グの 規 則 性 と して,
イ ン トロ ン と エ キ ソ ン の 境 目(ス プ ラ イ ス 部 位)の 配 列
は,5'側 は 必 ずGTで
始 ま り,3'側 はAGで
終 わ る こ と
が わ か っ て い る1).こ のGT-AG則
は,酵
母 や 植 物 か ら
脊 椎 動 物 に い た る まで,真 核 生 物 の細 胞 種 を こえ て保 存
され てお り,ス プ ラ イ シ ン グが 普 遍 的 な メ カ ニ ズ ム で 制
御 され て い る こ とが わ か る.こ れ に 加 え て,イ
ン トロ ン
の 両 端 付 近 と イ ン トロ ン 内 部 の3'ス プ ラ イ ス 部 位 近 傍
に存 在 す る ブ ラ ンチ 部 位 周 辺 は比 較 的 保 存 性 の高 い領 域
で あ り,そ れ ら が ス プ ラ イ ス 部 位 認 識 シ グ ナ ル と し て 機 能 し て い る こ と も わ か っ て い る.デ ー タ ベ ー ス を 用 い た 統 計 学 的 解 析 に よ り明 らか と な っ た,ヒ ト遺 伝 子 の ス プ ラ イ ス 部 位 お よ び ブ ラ ンチ 部 位 周 辺 に お け る 塩 基 配 列 の 保 存 性 を,図1aに 示 し た2).出 芽 酵 母 で は,ス プ ラ イ ス 部 位 お よ び ブ ラ ン チ 部 位 の 共 通 配 列 が 厳 密 に 保 存 さ れ て い る が,脊 椎 動 物 の 場 合,GT-AG則 以 外 の 保 存 性 は 比 較 的 低 く,と く に ブ ラ ン チ 部 位 の 保 存 性 は 低 くな っ て い る. ス プ ラ イ シ ン グ 反 応 は,図1bに 示 す よ う に,ATP とMg2+を 必 要 と す る2段 階 の 反 応 に よ っ て 行 な わ れ る3).反 応 の 第1段 階 で は,5'ス プ ラ イ ス 部 位 で の 切 断 が 起 こ る と 同 時 に,切 断 さ れ た イ ン ト ロ ン の5'末 端 の グ ァ ノ シ ン 残 基(G)が,ブ ラ ン チ 部 位 の ア デ ノ シ ン 残 基 (A)の2'OHと の あ い だ で2'-5'リ ン酸 ジ エ ス テ ル 結 合 を 形 成 す る.こ の と き,切 り 出 さ れ た5'側 エ キ ソ ン,お よ び,イ ン ト ロ ン と3'側 エ キ ソ ン か ら な る 投 げ 縄 構 造 を も っ た 反 応 中 間 体 が 形 成 さ れ る.第2段 階 で は,投 げ 縄 構 造 を と っ て い る イ ン トロ ン が 切 り 出 さ れ,そ れ と 同 時 に,前 後 の エ キ ソ ン の 再 結 合 反 応 が 行 な わ れ る. ス プ ラ イ シ ン グ は,細 胞 核 内 に お い て ス プ ラ イ ソ ソ ー ム と よ ば れ る 複 合 体 の 中 で 進 行 す る4∼6).ス プ ラ イ ソ ソ ー ム を 構 成 す る の は,核 内 低 分 子RNA(smallnuclearRNA;snRNA)を 含 む 蛋 白 質 一RNA複 合 体snRNP(small nuclear ribonucleoprotein particle,U1,U2,U5,U4/U
6-snRNPな ど が あ る)と,RNA成 分 を 含 ま な い50種 類 以 上 の 蛋 白 質 因 子 群 で あ る.snRNAの う ち,U4-snRNA
とU6-snRNAは 塩 基 対 合 を 形 成 し 単 一 のsnRNPに 含 ま れ る.snRNPと 蛋 白 質 因 子 は,snRNPど う し や 前 駆 体 mRNAと のRNA-RNA結 合(snRNAと 前 駆 体mRNA
の ス プ ラ イ ス 部 位 あ る い は ブ ラ ン チ 部 位 に お け る 結 合),RNA-蛋 白 質 結 合,蛋 白 質 問 結 合 な ど,複 雑 な 相 互 作 用 を 介 し てmRNA前 駆 体 の 構 造 を 変 化 さ せ な が ら,適 切 に ス プ ラ イ ス 部 位 を 切 断 し エ キ ソ ン 部 分 の 再 結 合 を 行 な っ て い く(図2)7).な お,各snRNPの 役 割 に つ い て は,他 書 を 参 考 に さ れ た い8).
2-選 択 的 スプ ライ シング
Alス プライス部位 選択の制御機構
選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ と は,複 数 の イ ン トロ ンを もつ
前 駆 体mRNAが
異 な る 様 式 の ス プ ラ イ シ ン グ を 受 け る
こ と に よ っ て,1個
の 遺 伝 子 か ら複 数種 のmRNAが
産
図1ス プ ラ イ シ ン グ 信 号 配 列 の 保 存 性 とmRNAス プ ラ イ シ ン グ 反 応 (a)エ キ ソ ン-イ ン トロ ン結 合 部 と プ ラ ン チ 部 位 に お け る塩 基 配 列 の 保 存性 を示 す.青:保 存 性 の 高 い 配 列 、オ レン ジ:ブ ラ ン チ 部 位,Yは ポ リ ピ リ ミ ジ ン トラ ク ト(Cあ る い はUの く り 返 し 配 列)．1,683種 の ヒ トゲ ノム イ ン トロ ン 配 列 の 調 査 か ら,そ れ ぞ れ の部 位 で の 出 現 頻度 を 文 字 の 大 き さ に 対 応 さ せ て 描 い てあ る,縦 線 はエ キ ソ ン-イ ン トロ ン の境 界 部 を示 す ． ア文 献2よ り改 変,許 可 を得 て 転 載] (b)mRNAス プ ラ イ シ ン グ 反 応 はATPとMg2+を 必 要 と す る. 第1段 階 で イ ン トロ ン の 投 げ 縄 構 造 が 形 成 さ れ た の ち,第2段 階 でイ ン トロ ンが 切 り出 され る.332 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.50No.4(2005)
生 さ れ る こ と を い う.上 述 した よ う に,脊 椎 動 物 に お け
る ス プ ラ イス 部 位 や ブ ラ ンチ部 位 の保 存 性 は 高 くな い.
そ の た め,ス
プ ラ イ シ ング の信 号 配 列 の 選 択 に 自由 度 が
生 ま れ,選 択 的 ス プ ラ イ シ ング が可 能 に な る.選 択 的 ス
プ ラ イ シ ン グ に よ る エ キ ソ ン選 択 は,ど
の5'ス プ ラ イ
ス 部 位 と ど の3'ス プ ラ イ ス 部 位 を 選 択 す る か と い う組
合 せ に よ っ て 決 定 され る.両 ス プ ラ イ ス 部 位 の 選 択 は,
Ul-snRNPの5'ス
プ ラ イ ス 部 位 へ の 結 合 とU2-snRNP
の ブ ラ ンチ 部 位 へ の結 合 に よ っ て形 成 され る,初 期 ス プ
ラ イ シ ング 複 合 体 に よっ て 決 ま る.ス プ ラ イ ス部 位 の 配
列 の 違 い に よ っ てUTsnRNPの
結 合 効 率 が 変 化 し,結 果
的 に,ス
プ ラ イ ス 部 位 認 識 の “強 さ ”に 違 い が 生 じ る.
そ の 結 果,あ
る ス プ ラ イ ス 部 位 は選 択 され ず,別
の ス プ
ラ イ ス 部 位 だ け が 選 択 され,選 択 的 ス プ ラ イ シ ング が 起
こ る の で あ る.
しか し実 際 は,ス
プ ラ イ ス 部 位 の 配 列 が コ ン セ ンサ ス
配 列 と はか な り異 な る 配 列 を有 す る もの がU-snRNPに
認 識 さ れ,ス プ ラ イ シ ン グ を 受 け る こ と が 多 い.こ れ は, ス プ ラ イ ス 部 位 に 近 接 し た エ キ ソ ン 内 あ る い は イ ン トロ ン 内 に,ス プ ラ イ シ ン グ を 促 進 す る ス プ ラ イ シ ン グ エ ン ハ ン サ ー と よ ば れ る 特 殊 な 信 号 配 列 が 存 在 し て い る た め で あ る.エ キ ソ ン 内 に あ る ス プ ラ イ シ ン グ エ ン ハ ン サ ー(exonic splicing enhancer;ESE)の 多 く は プ リ ン 残 基 に 富 ん だ 配 列 を も っ て お り,そ こ にSR蛋 白 質 と よ ば れ る 一 群 のRNA結 合 蛋 白 質 が 結 合 す る.こ れ がU1-snRNPあ る い はU2-snRNPの ス プ ラ イ ス 部 位 へ の 弱 い 結 合 を 助 け,ス プ ラ イ シ ン グ を 促 進 す る こ とが 知 ら れ て い る2,9,10)(図3a).ま た 逆 に,ス プ ラ イ シ ン グ を 抑 制 す る よ う な 信 号 配 列 ス プ ラ イ シ ン グ サ イ レ ン サ ー も エ キ ソ ン 内 に は 見 い だ さ れ て お り,こ れ をexonicsplicingsi-lencer(ESS)と よ ぶ2).さ ら に,イ ン ト ロ ン 内 に も 同 様 に ス プ ラ イ シ ン グ サ イ レ ン サ ー(intronicsplicingsi-lencer;ISS)が あ り,ESEの 働 き に 影 響 を 与 え て エ キ ソ ン 選 択 を 制 御 し て い る. 図2ス プ ラ イ ソ ソ-ム 中 に お け る ス プ ラ イ シ ン グ の 進 行 前 駆 体mRNA上 にsnRNPsお よ び SR蛋 白 質 な どの ス プ ラ イ シ ン グ 必須 因 子 が直 接 ある い は 間接 に結 合 し,順 次, 複 合 体 成 分を 変 化 さ せ な が らス プラ イ シ ン グ反 応 が進 む. [文献7よ り改 変 して 転 載]333 蛋 白 質 核 酸 酵素Vol.50No.4(2005)
B．SR蛋
白 質 の 構 造 と機 能
ESEに 結 合 し て ス プ ラ イ シ ン グ を 促 進 す るSR蛋 白 質 の 構 造 を,図3bに 示 し た9・11).こ れ ま で に10種 類 のSR 蛋 白 質 が 報 告 さ れ て い る.構 造 上 の 特 徴 と し て,N末 端 側 に1個 な い し2個 のRNA認 識 モ チ ー フ(RRM),C末 端 側 に ア ル ギ ニ ン 残 基 と セ リ ン 残 基 を 豊 富 に 含 むRSド メ イ ン を も つ.RRMモ チ ー フ はRNAと の 結 合 に,RS ドメ イ ン は 蛋 白 質 相 互 作 用 に 関 与 し て い る.ま た,こ の SR蛋 白 質 に よ く似 た 構 造 を も つ 蛋 白 質 と し て,SR関 連 蛋 白 質 が あ る.こ れ ら は,U1-snRNPの5'ス プ ラ イ ス 部 位 へ の 結 合 お よ びU2-snRNPの ブ ラ ン チ 部 位 へ の 結 合 を 促 進 す る こ と に よ り,初 期 ス プ ラ イ ソ ソ ー ム を 形 成させ ス プ ラ イ シ ング を活 性 化 させ る,さ
らに 後 期 過 程 に
お い て は,U4/U6-snRNPお
よ びU5-snRNPの
ス プ ラ イ
ソ ソー ム へ の リク ルー トを促 進 す る機 能 も知 られ て い る.
また,ESEに
結 合 したSR蛋
白 質 と ス プ ラ イ ソ ソー ム の
構 成 成 分 との 橋 渡 しを 行 な う こ と で,ス
プ ラ イ シ ング の
活 性 化 因 子 と して 働 くSR関
連 蛋 白 質(SRm160/300)も
知 られ て い る.SR蛋
白 質 お よ びSR関
連 蛋 白 質 と も に,
RSド
メ イ ンが 蛋 白質 問 結 合 に作 用 す る に は,特 定 の リ
ン酸 化 酵 素 に よ っ て リ ン酸 化 さ れ る 必 要 が あ る.SR蛋
白 質 は 恒 常 的 ス プ ラ イ シ ン グ に 必 要 で あ り(一 部 のSR
蛋 白 質 は 必 須),選
択 的 ス プ ラ イ シ ン グ に お い て は ス プ
ラ イ シ ング 部 位 の 選 択 の調 節 を して い る.後 述 す る が,
図3ESE依 存 性 ス プ ラ イ シ ン グ の モ デ ル とSR蛋 白 質 の 構 造(a)SR蛋 白質 はRRMを 介 してESE配 列 に結 合 し,そ れ と 同時 にRSド メ イ ン を 介 して ス プ ラ イ シ ン グ因 子 で あ るU2AF35お よ び/あ る い はUl-70Kと ス プ ラ イ ス部 位 近 傍 で 結 合 す る(青 矢 印).U2AFはU2AF35とU2AF65の2つ の サ ブ ユ ニ ッ トか らな り,そ の うち の ラ ー ジ サ ブユ ニ ッ トで あ るU2AF65が3'ス プ ライ ス部 位 近 傍の ポ リ ピ リミ ジ ン トラ ク ト(YRYYRY:ピ-リ ミ ジ ンの く り 返 し配 列)に 直 接 結 合 して U2-snRNPの プ ラ ン チ部 位 へ の結 合 を 促 進 する,ポ リ ピ リミジ ン トラ ク ト中 に は プ リン塩 基 が混 在 し,3'ス プ ラ イ ス 部 位 が 弱 い 場 合 で も U2AF65は こ の 部 位 に 結 合 で き る の で,弱 い3'ス プラ イ ス 部 位 を も つ遺 伝 子 の ス プ ラ イ シ ン グ に はU2AF65が 必 須 で あ る.U1-snRNPは 5'スプ ラ イ ス部 位 にU1-snRNAの 塩 基 対 形 成 に よ り結 合 す る,U1-70KはU1-snRNPの コ ン ポIネ ン トで あ る 、ス プ ラ イ シ ン グの 活 性 化 因子 の ひ とつ で あ るSRml60がUl-snRNPやU2-snRNPと 相 互 作 用(黒 矢 印)し,ス プ ライ シ ン グ を活 性化 す る こと も あ る. [文献2よ り改 変 して 転載] (b)SR蛋 白 質(左)お よびSR関 連蛋 白質 の ドメイ ン構 造(右),SR蛋 白 質 は1個 な い し2個 のRNA認 識 モ チ ー フ[RRMお よび ΨRRM(変 形RNA認 識 モ チ-フ)]がN末 端 側 に 存在 し,ア ル ギ ニ ン/セ リンの く り返 し配 列(RSド メ イ ン)がC末 端 側 に あ る.Zn:ジ ン クナ ッ ク ル,RSド メイ ン を も つ が構 造 的 にも機 能 的 に も異 な る も の がSR関 連 蛋 白 質 で あ る1SRm160は,機 能 がわ か って い な いPWIモ チ ー フ と セ リン リ ッチ モ チ ー フ(Ser),そ して,セ リン,ア ルギ ニ ン お よび プ ロ リン リ ッチ モ チー フ(SRP)を 有 す る. [文献9お よび11よ り改 変 して 転 載]
334 蛋 白質 核 酸 酵素Vol.50No.4(2005)
ESE配
列 に点 突 然 変 異 が 起 こ る とSR蛋
白 質 がESE配
列 に結 合 で き な くな り,ス プ ラ イ シ ン グ障 害 で 疾 患 が 発
症 す る ケ ー ス も少 な くな い.
C.ス
プ ラ イ シ ン グ サ イ レ ンサ ー
サ イ レ ン サ ー に つ い て は,エ ン ハ ン サ ー(ESE)に 比 べ る と あ ま り く わ し く解 析 さ れ て い な い.し か し注 目 す べ き は,3つ の エ キ ソ ン が 連 結 し た 真 ん 中 の エ キ ソ ン に ヒ トDNA断 片 を ラ ン ダ ム に 挿 入 さ せ た ミ ニ ジ ー ン を つ く る と,約1/3のDNA断 片 は ス プ ラ イ シ ン グ に 対 し て 阻 害 的 に 働 く と い う こ と で あ る.つ ま り こ れ は,遺 伝 子 配 列 中 に ス プ ラ イ シ ン グ を 抑 制 さ せ る サ イ レ ン サ ー が 多 数 組 み 込 ま れ て い る こ と を 示 唆 す る.サ イ レ ン シ ン グ の 機 序 に つ い て 比 較 的 よ く調 べ ら れ て い る の は,イ ン ト ロ ン 上 の サ イ レ ンサ ー ⅡSSで,ご く一 部 で は あ る が エ キ ソ ン 上 の サ イ レ ン サ ーESSの 存 在 も わ か っ て き て い る.サ イ レ ン サ ー 配 列 に はhnRNP(heterogenous nuclear ribo-nucleoprotein)蛋 白 質 群 な ど が 結 合 す る こ と で ス プ ラ イ シ ン グ を 負 に 制 御 し て い る.hnRNP蛋 白 質 は1個 な い し 複 数 のRNA結 合 ド メ イ ン を も ち,RNAと 直 接 結 合 す る.現 在,ス プ ラ イ シ ン グ の 抑 制 機 構 と し て 考 え ら れ て い る モ デ ル と し て,(1)ESEとESSが 近 接 し て い る エ キ ソ ン で ス プ ラ イ シ ン グ 促 進 因 子 と抑 制 因 子 が 競 合 す る(直 接 競 合),(2)ISSに 結 合 し た 抑 制 因 子 ど う し の 相 互 作 用 に よ り,エ キ ソ ン を ル ー プ ア ウ トす る(エ キ ソ ン ル ー プ),(3)抑 制 因 子 が 多 数 結 合 す る こ と に よ るESE 配 列 の マ ス キ ン グ(核 化 と協 調 的 結 合),の3つ が 提 唱 さ れ て い る(図4)2).Ⅱ.ス プ ライ シ ング の破 綻 と疾患
1.ス プライシング異常と遺伝性疾患
ヒ ト遺 伝 性 疾 患 に お け る 点 突 然 変 異 の う ち,約15%
が ス プ ライ シ ン グ異 常 に よ る もの と見 積 も られ て い る12),
こ の よ う な ス プ ラ イ シ ン グ異 常 を もた らす 変 異 は ス プ ラ
イ ス 部 位 の コ ンセ ンサ ス 配 列 に集 中 して お り,変 異 配 列
の 近傍 の エ キ ソ ン を ス キ ッ プ させ る.ま
た,ま れ な ケ ー
ス で あ るが,変 異 に よ っ て新 た に異 所 性 の ス プ ラ イ ス 部
位(cryptic splice site,隠 れ た ス プ ラ イ ス 部 位)が 形成 さ
れ,そ の 部 分 で ス プ ラ イ シ ン グ を受 け て 本 来 の構 造 とは
異 な っ たmRNAが
産 生 さ れ て し ま う ご と もあ る.現 在
の と こ ろ,点 変 異 が も た らすmRNAあ
る い は コ ー ドさ
れ る蛋 白質 へ の 影 響 は,通 常,遺 伝 子 配 列 に基 づ い て 予
想 され,翻
訳 され る蛋 白 質 の 変 異 が 問 題 視 さ れ て い る
が,そ
の 変 異 がmRNAの
発 現 レベ ル や ス プ ラ イ シ ン グ
パ ター ンに ど う影 響 を与 え て い るか に つ い て は,実 験 的
に は ほ とん ど調 べ られ て い な い.し
た が っ て,ス プ ラ イ
ス 部 位 の 変 異 は ス プ ラ イ シ ン グ に影 響 を与 え て い る こ と
図4ス プ ラ イ シ ン グ の 抑 制 機 構 モ デ ル(a)直 接競 合:ESEとESSが オIバ ー ラ ッ プ して 前 駆 体mRNA上 に存 在 する 場 合,促 進 因 子(SR蛋 白 質な ど)と抑 制 因 子(hnRNPな ど)が 競合 して,そ れ ぞ れ の 機 能 に 影 響 を 与 え る 、促 進 因 子 の ESEへ の 結 合 が 強 い か あ る い は濃 度 が 高 い 場 合 は,そ の エ キ ソ ンが 含 まれ るス プラ イ シ ン グが 起 こ り,逆 に,抑 制 因子 の 効 果 が勝 る場 合,エ キ ソン はス キ ップ さ れ る. (b)エ キ ソン ルー プ:エ キ ソ ン の両 側 の イ ン トロ ン に 存 在 す る1$SにhnRNP な ど の ス プ ラ イ シ ン グ 抑 制 因 子 が 結 合 し,さ らに抑 制 因 子 ど う しが相 互 作用 を す る こ と で エ キ ソ ン を ル ー プ ア ウ トす る. (c)核 化 と 協 調 的 結 合:ESSに 結 合 し た 抑 制 因子 が 前駆 体mRNA上 で 多 数 結 合 す る こ と に よ っ て,ESEを マ ス キ ン グ す る. [文献2よ り改 変 して転 載]
335 蛋 白 質 核酸 酵 素Vol.50No.4(2005)
は 容 易 に予 想 さ れ て も,コ ー デ ィ ン グ領 域 にお け る変 異
に 関 し て は,ミ
ス セ ンス 変 異,ナ
ンセ ン ス変 異 と して コ
ー ドす る蛋 白 質 の構 造 変 化 を起 こ し
,病 気 に至 る もの と
考 え られ が ち で あ る.ま
た,サ
イ レ ン ト変 異 は,遺 伝 子
多 型 と して分 類 さ れ て し ま うの が 一 般 的 で あ る.
しか し実 際 は,エ
キ ソ ン 部 分 に 起 こ る 点 突 然 変 異 で
は,ス プ ラ イ シ ン グ の 調 節 に 必 要 な シ ス 配列 が破 壊 され
る こ とに よ り正 常 な ス プ ラ イ シ ン グが 起 こ らず,そ の 結
果,異 常 蛋 白 質 が 翻 訳 され る こ と も多 い.た とえ ば,ESE
に変 異 が 起 こ る こ と で エ キ ソ ンが ス キ ップ し,変 異 蛋 白
質 が 産生 され る ケ ー スが そ れ に あ た る.最 近,I型
神 経
線 維 腫 症 と毛 細 血 管 拡 張 性 運 動 失 調 症 の そ れぞ れ の 原 因
遺 伝 子(NF1,ATM)のDNAお
よ びRNAレ
ベ ル で の 解
析 が 行 な わ れ,こ
れ ら疾 患 の 約50%程
度(そ れ ぞ れ52
例 中26例,62例
中30例)に
エ キ ソ ン ス キ ップやcryptic
splicesiteの 形 成 に よ る 異 常 ス プ ラ イ シ ン グが 起 こっ て
い る こ と が 明 らか に さ れ た13,14).そ の う ち の い くつ か
は,ゲ
ノ ム 配 列 に基 づ き フ レー ム シ フ トや ミスセ ンス 変
異 あ るい は ナ ンセ ンス 変 異 と して 間違 っ て 分 類 され て い
た の で あ る.こ の 報 告 は,ゲ
ノ ム情 報 の み に基 づ い た 遺
伝 性 疾 患 の解 析 評 価 の 問 題 点 を指 摘 す る と と もに,遺 伝
子 変 異 が 与 え る ス プ ラ イ シ ン グへ の影 響 が 想像 以 上 に 大
きい こ と を示 す 報 告 と して 注 目 さ れ る.
2.神 経変性疾患における異常スプライシング
神 経 疾 患 に は ス プ ラ イ シ ング 異 常 に よ り発症 す る もの
が 多 い.お そ ら く,神 経 系 に特 異 的 な機 能 を有 した遺 伝
子 が 多 数 存 在 す る こ と,あ る い は,異 常 ス プ ラ イ シ ング
か ら産 生 され る 変 異 蛋 白 質 の 蓄 積 に神 経 細 胞が 脆 弱 で あ
る こ とな どが 原 因 と して 考 え られ る.こ こ で は い くつ か
の 神 経 変 性 疾 患 に 焦 点 を あ て,そ
れ ぞ れ の疾 患 で み られ
る異 常 ス プ ラ イ シ ン グ の メ カ ニ ズ ム を解 説 す る,
A.前
頭 側 頭 型 痴 呆 症
前 頭 側 頭 型 痴 呆 症 は,前 頭 葉 と 側 頭 葉 の 萎 縮 を 示 し, 性 格 変 化,健 忘,自 発 運 動 の 低 下,さ ら に は パ ー キ ン ソ ン 病 様 の 症 状 を し ば し ば 呈 す る 一 群 の 進 行 性 痴 呆 で あ る15∼17).1998年,そ の 原 因 遺 伝 子 が17番 染 色 体17q21-22に 存 在 す るtau遺 伝 子 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た.tau蛋 白 質 は 微 小 管 結 合 蛋 白 質 の 一 種 で あ り,お も に チ ュ ー ブ リ ン と 結 合 し,微 小 管 重 合 を 促 進 ・安 定 化 す る.ま た,神 経 細 胞 で 強 く 発 現 し,神 経 細 胞 の 形 態 形 成, 軸 索 極 性,軸 索 輸 送 に か か わ っ て い る.tau遺 伝 子 は 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ に よ る3つ の エ キ ソ ン(エ キ ソ ン 2,エ キ ソ ン3,エ キ ソ ン10)の 挿 入 の 有 無 に よ っ て,6 種 の ア イ ソ フ ォ ー ム が 発 現 す る.tau蛋 白 質 はC末 端 側 の く り 返 し 配 列 領 域 に よ っ て 微 小 管 と 結 合 す る.微 小 管 と 結 合 す る く り 返 し 配 列 に は,3つ の も の(3リ ピ ー ト tau)と4つ の も の(4リ ピ ー トtau)が あ り,こ の 違 い は エ キ ソ ン10の 挿 入 の 有 無 に よ る(図5a).通 常,成 人 に お い て4リ ピ ー トtauは す べ て のtauの う ち3割 程 度 で, 3リ ピ ー トtauよ り微 小 管 重 合 能 が2.5∼3倍 程 度 高 い. 前 頭 側 頭 型 痴 呆 症 の 遺 伝 子 変 異 は こ れ ま で に10種 類 以 上 が 報 告 さ れ て い る.そ れ ら に は 大 き く分 け て,遺 伝 子 配 列 上 ア ミ ノ 酸 配 列 が 変 化 す る ミ ス セ ン ス 変 異 と,エ キ ソ ン10近 傍 の イ ン ト ロ ン に お け る 変 異 の2種 類 が あ る16,17).G272V,P301L,V337M,R406Wな ど の ミ ス セ ン ス 変 異 は,微 小 管 結 合 領 域 あ る い は そ の 近 傍 に 存 在 し,tau蛋 白 質 の 微 小 管 重 合 促 進 能 を 低 下 さ せ る こ と が 確 認 さ れ て い る18).一 方,エ キ ソ ン10近 傍 の イ ン ト ロ ン に お け る 変 異 は,tauエ キ ソ ン10の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ に 影 響 を 与 え る.図5bに 示 す よ う に,tauエ キ ソ ン10の3'末 端 か ら イ ン ト ロ ン10の5'末 端 は ス テ ム ル ー プ を 形 成 し,U1-snRNPが5'ス プ ラ イ ス 部 位 ヘ ア ク セ ス す る こ と を 制 限 す る 構 造 と な っ て い る.こ の 部 位 に お け る 変 異 は ス テ ム ル ー プ 構 造 を 不 安 定 化 し,U1-snRNPの ア ク セ ス を 容 易 に さ せ,エ キ ソ ン10の ス プ ラ イ シ ン グ を 活 性 化 す る.そ の 結 果,4リ ピ ー トtauの 発 現 の 割 合 が 増 加 し,本 来,一 定 の 割 合 で 発 現 す る3リ ピ ー トtauと4リ ピ ー トtauの 量 的 バ ラ ン ス が 崩 れ て 細 胞 傷 害 の 原 因 に な る.実 験 的 に も,ま た,実 際 の 患 者 のtau mRNAお よ び 蛋 白 質 の 解 析 で も,エ キ ソ ン10の 割 合 の 増 加 が 明 ら か に さ れ て い る16,17). エ キ ソ ン10で の 変 異 の う ち,N279K,L284L,N296N 変 異 は4リ ピ ー トtauの 増 加 を 促 し,一 方,3塩 基 が 欠 損 す るK280欠 損 変 異 で は3リ ピ ー トtauの み が 発 現 す る2・19).つ ま り,エ キ ソ ン に お け る こ れ ら 変 異 は,エ キ ソ ン10の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ に 影 響 を 与 え て い る の で あ る 。tauエ キ ソ ン10の5'側 に は プ リ ン 残 基 に 富 む ESEが あ り,そ の3'側 にESS配 列 と 想 定 さ れ る 領 域 が 近 接 し て い る(図5c).N279Kお よ びL284L変 異 はESE の 高 次 構 造 を 変 化 さ せ,ESEの 機 能 を さ ら に 活 性 化 さ せ る こ と に よ っ て エ キ ソ ン10の ス プ ラ イ シ ン グ を 促 進 さ せ る.一 方,K280欠 損 変 異 は,プ リ ン 残 基 で あ る AAG配 列 が 欠 損 す る こ と に よ っ てESE機 能 が 完 全 に 失336 蛋 白質 核 酸 酵 素Vol.50No.4(2005)
わ れ,エ キ ソ ン10を す べ て ス キ ッ プ す る ス プ ラ イ シ ン グ が 起 こ る.N296N変 異 の 場 合 は,ESS機 能 が 阻 害 さ れ る こ と に よ っ て エ キ ソ ン10の ス プ ラ イ シ ン グ を 促 進 さ せ る.tauエ キ ソ ン10のESEお よ びESSに 結 合 し, ス プ ラ イ シ ン グ 活 性 を 調 節 す る 因 子 は い ま の と こ ろ 明 ら か に さ れ て い な い.N279K変 異 に よ っ てGAAの く り
返 しが 新 た に挿 入 さ れ,こ
れ に よ りESE機
能 が 活 性 化
され る こ とか ら,ESEに
結 合 す る 因子 と してSR関
連 蛋
白 質 の ひ とつ で あ るtra2β が そ の 候 補 と して あ げ られ
て い る20,21).
以 上 の よ う に,特 定 エ キ ソ ンの ス プ ラ イ シ ング が微 妙
に変 化 す る こ とで 重 篤 な疾 患 を ひ き起 こ して し ま う典 型
図5tau遺 伝 子 の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ と そ の 異 常 (a)tau遺 伝 子 の 構 造 と ミ ス セ ン ス 変 異部 位.赤 で示 した 部 分 は微 小 管 結合 ド メ イ ン,紫 お よび 青 で 示 した 部 分 は選 択 的ス プ ラ イ シ ング を 起 こ すエ キ ソ ン を示 す.エ キ ソ ン10に は 微 小 管 結 合 ドメ イ ンが ひ と つ存 在 し,こ のエ キ ソン を含 む ス プ ラ イ シ ン グ が 起 こ る と4リ ピ ー ト tauが,ス キ ップ す るス プ ラ イ シ ン グが 起 こ る と3リ ピ ー トtauが 産 生 さ れ る.ミ ス セ ンス 変 異 は微 小 管 結 合領 域 と そ の 近傍 に集 中 す る. (b)イ ン トロ ン に お け る変 異.大 文 字 が エ キ ソ ン10の 部 分,小 文 字 が イ ン トロ ン部 分.こ れ ま で 発見 され て い る エキ ソ ンーイ ン トロ ン結 合 部 分 の 変 異 は,こ の 部 分 に形 成 さ れ る ス テ ムル ー プ 構造 を 不 安 定 化 し,U1-snRNPの 結 合 活 性 を 亢 進 さ せ る.そ の 結 果,エ キ ソ ン10を 含 む ス プ ライ シ ン グ を誘 導 す る. [文献19よ り改変 して 転 載] (c)tau遺 伝 子 工 キ ソ ン10の 遺 伝 子 変 異 に よる ス プ ラ イ シ ン グ異 常.tauエ キ ソ ン10に はESE(緑)とESS(赤)が 存 在 し選 択 的 ス プラ イシ ン グ を受 ける(中 央).N279Kお よ びL284L変 異 はESE 活 性 を上 昇 させ ス プラ イ シ ン グ を促 進 し て,4リ ピ ー トtauの 産 生 を 増 加 さ せ る.N296N変 異 はESS活 性 を 抑 制 す る こ と で エキ ソ ン10の ス プ ラ イ シ ン グ を 促進 す る.S305Nお よ びS305S変 異 は(b)で 示 した メ カ ニ ズ ム に よ りス プ ラ イ シ ン グ を促 進 す る(上 段).3塩 基 欠 損 を 起 こ すK280欠 損 変 異(下 段)はESE 活 性 を消 失 さ せ,エ キ ソ ン10が 完 全 に スキ ップ す るス プ ラ イ シ ン グ が起 こる. [文献2よ り改 変 して 転 載]337 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.50No.4(2005)
的 な 疾 患 が この 前 頭 側 頭 型 痴 呆 症 で あ る.3リ ピー トtau
と4リ ピ ー トtauが 適 度 な割 合 で 発 現 す る よ う に ス プ ラ
イ シ ン グ を厳 密 に 制 御 す る こ とが,神
経 系 の正 常 な 発 生
お よ び 高 次 機 能 の 維 持 に重 要 なの で あ る.
B.脊
髄 性 筋 萎 縮 症
脊 髄 性 筋 萎 縮 症 は,脊 髄 の 運 動 神 経 細 胞(脊 髄 前 角 細
胞)の 変 性 に よ っ て起 こ る 神 経 原性 の 筋 萎 縮 症 で,常
染
色 体 劣性 遺 伝 病 で あ る22).症 状 と して は,体 幹 や 四 肢 の
筋 肉 の 脱 力,筋 萎 縮 が み られ る.5番
染 色 体 に 存 在 す る
SMN (Survival motor neuron)
遺 伝 子 が 原 因 遺 伝 子 と して
同 定 さ れ て い る23).ヒ ト で はSMN遺 伝 子 は2つ 存 在 し,隣 接 して 逆 向 き に 並 ん で い る.テ ロ メ ア 側 の も の を SMN1,セ ン トロ メ ア 側 の も の をSMN2と よ ん で い る. こ れ ら の2つ の 遺 伝 子 は,い ず れ も8個 の エ キ ソ ン か ら な り,遺 伝 子 配 列 上 は ま っ た く 同 じ蛋 白 質 を コ ー ドす る こ と に な っ て い る.し か し,SMN1は エ キ ソ ン1か ら8 ま で の す べ て の エ キ ソ ン が 転 写 さ れ る が,5MN2は 大 部 分 が エ キ ソ ン7を 含 ま な い 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ を 受 け て い る.そ の た め,実 際 に はSMN2か ら はSMN1と は 異 な っ た 蛋 白 質 が 翻 訳 さ れ る.こ の 原 因 は,SMN2の エ キ ソ ン7の5'末 端 か ら6番 目 の 塩 基 が シ トシ ン(C)か ら チ ミ ン(T)に 変 異 し て い る た め で あ る.こ の1塩 基 の 違 い に よ っ て,SMN2遺 伝 子 か ら は80%以 上 が エ キ ソ ン 7を 欠 失 し たmRNAが 産 生 さ れ て い る(図6a).エ キ ソ ン7を 欠 い たSMN蛋 白 質 は 不 安 定 で あ り,発 現 し た と し て も本 来 の 機 能*1を も た な い と 考 え ら れ て い る24,25). 脊 髄 性 筋 萎 縮 症 患 者 の ほ と ん ど は,SMN1遺 伝 子 に 欠 失 ま た は 変 異 が み ら れ る の に 対 し て,SMN2遺 伝 子 に は 異 常 は み ら れ な い 場 合 が 多 い.よ っ て,SMN2遺 伝 子 か ら エ キ ソ ン7を 含 む 全 長 型 蛋 白 質 が ど れ だ け 発 現 さ れ る か が 患 者 の 重 症 度 に 影 響 を 与 え る.つ ま り,SMN2遺 伝 子 か ら 全 長SMN蛋 白 質 が 多 く 発 現 す れ ば 比 較 的 軽 症 と な り,発 現 さ れ な け れ ば 重 症 度 が 増 す. SMN1遺 伝 子 とSMN2遺 伝 子 は エ キ ソ ン7の1塩 基 の 違 い だ け で ス プ ラ イ シ ン グ パ タ ー ン が 変 化 す る こ と か ら,SMN2遺 伝 子 の 場 合 もm遺 伝 子 と 同 様 に,塩 基 置 換 に よ りESE機 能 が 破 壊 さ れ,エ キ ソ ン7が ス キ ッ プ し て い る と 考 え ら れ る.Hofmannら はSMN1の エ キ ソ ン7の 遺 伝 子 配 列 を 調 べ,エ キ ソ ン7の 中 央 部 に プ リ ン 塩 基 が く り返 す 部 位 を 見 い だ す と と も に,そ の 配 列 にSR 関 連 蛋 白 質 で あ るtra2β が 特 異 的 に 結 合 し てESE活 性 を 充 進 し て い る こ と を 明 らか に し て い る26).し か し,こ の 時 点 で は,エ キ ソ ン7の5'末 端 か ら6番 目 の1塩 基 置 換(C→T)に よ りSMN1とSMN2と の ス プ ラ イ シ ン グ の あ い だ に 大 き な 違 い を ひ き起 こ さ れ る 理 由 は わ か ら な か っ た.そ の 後,Krainerら の グ ル ー プ に よ っ て,tra2β 依 存 的 なESEと は 別 に,塩 基 置 換 が 起 こ っ て い る 領 域 に 新 た なESEが あ る こ と が 見 い だ さ れ た27).彼 ら は, ESEフ ァ イ ン ダ ー*2と い う コ ン ピ ュ ー タ ソ フ ト ウ ェ ア を 使 い,エ キ ソ ン7の5'末 端 にSR蛋 白 質 のSF2/ASF が 結 合 す るESE配 列 に な り う る 候 補 配 列 が あ る こ と を 探 し 出 し た,実 験 的 に も,そ のESE配 列 にSF2/ASFが 直 接 結 合 し,SMN1エ キ ソ ン7の ス プ ラ イ シ ン グ を 活 性 化 し て い る こ と,さ ら に は,SMN2タ イ プ の 配 列(エ キ ソ ン7の5'末 端 か ら6番 目 のCがTに 変 異)に 対 し て は SF2/ASFの 結 合 活 性 が 低 下 し,ESE機 能 を 明 ら か に 低 下 さ せ る こ と を 証 明 し た.以 上 の2つ の 研 究 成 果 か ら, SMNエ キ ソ ン7の ス プ ラ イ シ ン グ 機 構 は 図6aの よ う に 想 定 さ れ て い る.ま た 最 近 で は,エ キ ソ ン7の 前 後 イ ン ト ロ ン 内 にSMNエ キ ソ ン7の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ を 制 御 す る シ ス 配 列 が 存 在 す る こ と も 明 ら か に さ れ て い る28,29). 脊 髄 性 筋 萎 縮 症 患 者 に はSMN2遺 伝 子 は 残 存 し て い る の で,SMN2遺 伝 子 か ら 人 工 的 に エ キ ソ ン7を 含 む ス プ ラ イ シ ン グ を 活 性 化 で き れ ば,そ の 治 療 に 応 用 で き る.最 近,ス プ ラ イ シ ン グ させ た い エ キ ソ ン に ハ イ ブ リ ダ イ ズ で き る 核 酸 に,SR蛋 白 質 のRSド メ イ ン の 機 能 を 付 与 し た ペ プ チ ド を 化 学 的 に 架 橋 さ せ た キ メ ラ 分 子 を 用 い て,標 的 遺 伝 子 の ス プ ラ イ シ ン グ を 活 性 化 さ せ る 新 し い 手 法 が 開 発 さ れ た(forexon-specific splicing en-hancement by small chimeric effectors;ESSENCE)30). キ メ ラ 分 子 は,標 的 配 列 に 対 し て 相 補 的 な12塩 基 か ら な る 標 的 ド メ イ ン と,ス プ ラ イ シ ン グ マ シ ー ナ リ ー と の 相 互 作 用 を 仲 介 す るRSド メ イ ン と し て ア ル ギ ニ ン/ *1 SMN蛋 白 質 の 機 能:SMN蛋 白 質 は 細 胞 質 内 お よ び 核 内 に 存 在 す る 。 核 内 で はgemsと よ ば れ る 構 造 体 に 存 在 し て,そ れ 自 身 で 会 合 し て オ リ ゴ マ ー を 形 成 す る と と も に,ほ か の 多 くの 蛋 白 質 と 相 互 作 用 し複 合 体 と し て 存 在 し て い る.SMN複 合 体 と 会 合 す る 分 子 の 多 くはRNA-蛋 白 質 複 合 体(RNP)に 存 在 す る た め,U-snRNP群 の 会 合 や ス プ ラ イ ソ ソ ー ム 形 成 に 働 く 因 子 で あ る と考 え ら れ て い る. ESEフ ァ イ ン ダ-:調 べ た い 塩 基 配 列 に4種 類 のSR蛋 白 質(SF2/ASF,SC35,SRp40,SRp55)が 結 合 で き る モ チ ー フ が 存 在 す る か ど う か を 定 量 的 に 検 索 で き る ソ フ トウ エ ア.こ の ソ フ トウ エ ア は,コ ー ル ド ス プ リ ン グ ハ ー バ ー 研 究 所 の ホ ー ム ペ ー ジ で 公 開 さ れ て い る(http://rulai.cshl.edu/tools/ESE/).
338 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.50No.4(2005)
セ リ ン を10回
く り返 した リ ク ル ー ト ドメ イ ンか ら な る
シ ン プ ル な 構 造 で あ る.こ の キ メ ラ 分 子 を細 胞 に 導 入 し
てSMN2遺
伝 子 の ス プ ラ イ シ ン グ に与 え る影 響 を調 べ
た と こ ろ,全 体 の60%が
全 長 型SMN蛋
白 質 を発 現 し
た.キ
メ ラ 分 子 の 作 用 機 構 とSMN2エ
キ ソ ン7に 対 す
る ター ゲ ッ テ ィ ング 戦 略 図 を 図6bに,用
い た キ メ ラ 分
子 の 配 列 を 図6cに
示 した.ESSENCE法
を治 療 に 応 用
す る に は,生 体 内 で の キ メ ラ分 子 の安 定性 や,臓 器 組 織
へ の デ リバ リ ー の 問 題 が 残 され て い る が,特 定 遺 伝 子 の
ス プ ラ イ シ ン グ を 人 工 的 に 効 率 よ く制 御 す る方 法 と して
は,現 在 の と こ ろ も っ と も有 力 な方 法 と考 え られ る.
C.筋
強 直 性 ジ ス トロ フ ィー
筋 強 直性 ジ ス トロ フ ィー は 常 染 色 体 優 性 遺伝 病 で,症
状 と して は,筋
強 直 ・筋 萎 縮 な ど の筋 症 状 に加 え,白 内
障,不 整 脈,糖 尿 病 な ど種 々 の 全 身 症 状 が み ら れ る31). 筋 強 直 性 ジ ス ト ロ フ ィ ー の 一 部 は,DMPK (dystrophia
myotonica protein kinase)
遺伝 子 の3'非 翻 訳 領 域 に 存 在 す
るCTGの3塩 基 く り 返 し 配 列 が 異 常 伸 長 す る ト リ プ レ ッ ト病 の ひ と つ で あ る こ と が 明 ら か に さ れ た32∼34). DMP1(遺 伝 子 は 正 常 で も3'非 翻 訳 領 域 に 約37個 の CTGく り返 し 配 列 を も つ が,筋 強 直 性 ジ ス トロ フ ィ ー 患 者 で は こ の く り返 し 配 列 が50∼5,000個 に も 伸 長 し て い る.リ ピ ー ト長 と 重 症 度 が 相 関 す る こ と,親 よ り子 で リ ピ ー トが 伸 長 し発 症 が 早 ま る 表 現 促 進 現 象 が み ら れ る こ と な ど,ほ か の ト リ プ レ ッ ト リ ピ ー ト病 と 同 様 の 特 徴 を 有 し て い る. 病 態 機 序 に つ い て は,CTGリ ピ ー ト の 伸 長 が,① DMPK蛋 白 質 の 発 現 に 影 響 す る,②DMPK近 傍 の 遺 伝
図6
5MN遺
伝 子 の スプラ イシ ング制 御 とESSENCE法
(a)SMN1で は 終 止 コ ドンを 含 む エキ ソン7が 含 まれ る ス プ ライ シ ン グ が起 こ る.5MN2の 場 合 は80%が エキ ソ ン7を ス キ ップ し,エ キ ソ ン8で 蛋 白 質 翻 訳 が 終 結 す る.そ の 結果,エ キ ソ ン7を 欠 い たSMN蛋 白 質 で は,C末 端 構 造 に エキ ソ ン7を 含 む も の と は異 な り, 翻訳 産 物 の安 定 性 が き わ めて 低 い.5MN1とSMN2遺 伝 子 の 違 い は,エ キ ソ ン7の5'宋 端 か ら6番 目の塩 基 が.SMN1遺 伝 子 で は シ ト シ ン(C).SMN2遺 伝 子 で はチ ミ ン(T)に な って いる こと であ る.こ の塩 基 置 換 に よ って,SMN2で はSF2/ASF依 存 性 のESE活 性 が 不 活化 す る.も うひ と つ のESEは エ キ ソ ン7の 中央 部 にあ り,tra2β1を 含 む ス プ ラ イ シ ン グ因子 が結 合 しス プ ラ イシ ン グ に影 響 を与 え る. [文献2よ り改 変 して 転載](b)ESSENCE法 の 概 略.ESSENCE法 はSR蛋 白 質 によ るESE依 存 性 ス プ ラ イ シ ング の 機構 を 応用 して いる,上 段 はESE依 存性 のSR 蛋 白質 に よる ス プ ラ イ シ ン グを 示 す.塩 基 変異 に よ りESEが 破 壊 さ れ る とエ キ ソ ンは スキ ップ す る(中央).ESSENCE分 子 は 標 的 の前 駆 体mRNAに 相 補 的 に結 合 し.RSド メイ ン(RSIO)を 使 って ス プラ イ シ ン グ を活 性 化 さ せ る(下 段). [文献30よ り改 変 して転 載] (c)ESSENCE法 に用 い る キ メラ 分 子の 核 酸 部分 の 塩基 配 列 と タ ーゲ ッ トとな るSMN遺 伝 子 と が ハイ プ リダ イ ズ す る 部 位 を 示 す.四 角 で囲 ま れ た部 分 が エ キ ソ ン7.SMN-RS10:SMNのESSENCEキ メ ラ 分 子,SMNーPNA:SMV遺 伝 子 のア ンチ セ ン スペ プチ ド核 酸. [文献30よ り改 変 して転 載]
339 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.50No.4(2005)
子 発 現 に 影 響 す る,③
リ ピ ー トが 伸 長 したmRNAそ
の
もの が毒 性 を 示 す,な
ど の仮 説 が 提 唱 さ れ た.そ れ ぞ れ
の 観 点 か ら研 究 が 行 な わ れ た 結 果,③
が 筋 強 直 性 ジ ス
トロ フ ィ ー の筋 病 変 を ひ き起 こす 原 因 と して 考 え られ る
よ う に な っ て き た.そ
の 仮 説 を 裏 づ け る 決 定 的 な 根 拠
は,DMPKと
は 関 係 の な い 骨 格 筋 ア ク チ ン遺 伝 子 の3'
非 翻 訳 領 域 にCTGリ
ピ ー トを 挿 入 し骨 格 筋 に 発 現 さ せ
る と,筋 強 直 性 ジス トロ フ ィー に 似 た筋 病 理変 化,筋
強
直 現 象 が み ら れ た こ と で あ る35).つ ま り,CTGリ
ピ ー
トが 伸 長 したmRNAが
存 在 す れ ば筋 強 直 性 ジス トロ フ
ィ ー の 発 症 に 十 分 で あ り,DMPKの
機 能 障 害 や 発 現 障
害 は必 要 で な い の で あ る.そ
れ で は,な ぜmRNA中
に
異 常 に伸 長 したCTGリ
ピー トが あ る と発 症 す る の だ ろ
うか?そ
の メ カ ニ ズ ム が 解 明 され る前 に興 味 深 い現 象
が 明 らか に さ れ て い た.そ
の ひ とつ は,CTGリ
ピー ト
が伸 長 して い るマ ウ ス で は,筋
強 直 と密 接 にか か わ る ク
ロ ラ イ ドチ ャ ネ ル の 異 常 ス プ ラ イ シ ン グが 起 こ っ て い る
こ とで あ る36).さ ら に は,ト
ロ ポ ニ ンTお
よ び イ ン ス
リ ン受 容 体 の ス プ ラ イ シ ン グ に も異 常 が 見 い だ され37β8),
ス プ ラ イ シ ン グ障 害 が 筋 強 直 性 ジ ス トロ フ ィー 発 症 の原
因 で は な い か と注 目が 集 まっ た.こ れ らの 異 常 ス プ ラ イ
シ ン グ を起 こ し た遺 伝 子 に は,い
ず れ もエ キ ソ ン前 後 の
イ ン トロ ン 内 にCUGやUGな ど の く り 返 し 配 列 が あ る と い う 共 通 の 特 徴 が あ る.CUGの く り 返 し 配 列 を 含 む mRNAは,2本 鎖 ヘ ア ピ ン 構 造 と い う 特 徴 的 な 立 体 構 造 を と る こ と が 想 定 さ れ て い る.一 方,こ の 配 列 に は, RNA結 合 蛋 白 質 で あ るCUG結 合 蛋 白 質(CUGlBP)や muscleblindフ ァ ミ リ ー(MBNL,MBLL,MBXL)が 結 合 し て 前 後 エ キ ソ ン の ス プ ラ イ シ ン グ に 影 響 を 与 え る こ と が 知 ら れ て い る39・40).Cooperら は,CUG-BPが 筋 強 直 性 ジ ス トロ フ ィ ー の 骨 格 筋 で 増 加 し て い る こ と を 示 す と と も に,CUG-BP蛋 白 質 や,CUGが 伸 長 し たmRNA を 強 制 発 現 さ せ る と,筋 強 直 性 ジ ス トロ フ ィ ー で み ら れ る い く つ か の 遺 伝 子 の 異 常 ス プ ラ イ シ ン グ と 同 じ現 象 を ひ き 起 こ す こ と を 見 事 に 証 明 し た41).現 在 考 え ら れ て い るCTGリ ピ ー ト に よ る ス プ ラ イ シ ン グ 異 常 の メ カ ニ ズ ム を 図7に 示 し た.こ の よ う な 研 究 成 果 に よ り,筋 強 直 性 ジ ス ト ロ フ ィ ー の 機 序 が 明 ら か に さ れ て き て い る が, 患 者 で な ぜCUG-BP量 が 増 加 し 活 性 化 す る の か,あ る い は,CUG-BP,muscleblindフ ァ ミ リ ー に よ る ス プ ラ イ シ ン グ 制 御 の 詳 細 に つ い て は 不 明 な 点 が 多 い.D.孤
発 性 ア ル ツ ハ イ マ ー 病
ア ル ツ ハ イマ ー病 は,ア
ミロ イ ド β蛋 白 質 の 沈 着,神
経 細 胞 内 に お け る リ ン酸 化 タ ウ の 蓄 積(神 経 原 線 維 変
図7DMPK遺 伝 子 内CTGリ ピ ー 卜伸 長 が 及 ぼ す 異 常 ス プ ラ イ シ ン グ の モ デ ル 図 DMPKmRNA内 のCUGリ ピ ー トは 2本 鎖 ヘ ア ピ ン 構 造 を と る.そ こ に muscleblind(MBNL)な どのCUG 結 合 蛋 白質 が-リク ル ー トさ れ,核 内 に ribonucIear inclusionと よ ば れ る凝 集 体 を形 成 す る.こ の 凝 集 体形 成 は な ん ら か の メ カニ ズ ムでCUG-BPを 活 性 化 さ せ る,活 性 化 したOUG-BPは ク ロ ラ イ ドチ ャネ ル,イ ンス リン 受容 体 お よ び ト ロポ ニ ンTの 遺伝 子 の イ ン トロ ン 領 域 に存 在 す るU/Gモ チ ー フ に結 合 し,そ れ ぞれ の 選択 的 スプ ラ イ シ ング に影 響 を 与 える.ク ロ ライ ドチ ャネル と イ ン ス リ ン 受容 体 の遺 伝 子 に 対 しては 、GUG-BP は 結合 位 置か ら下 流 の エキ ソン に抑 制 的 に 作用 してエ キ ソン を スキ ップ させ る. 一 方,ト ロ ポ ニ ンTの 遺 伝 子 に 対 して は,結 合 位置 か ら上 流の エ キ ソ ンの ス プ ラ イ シン グを 促 進 す る,こ れ らの 異 常 ス プ ライ シ ング の 結 果,筋 強 直性 ジス トロ フ ィー の 多彩 な 症 状 を ひき 起 こ され る こ と が示 唆 され て い る. [文献41よ り改 変 して転 載]340 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.50No.4(2005) 化),お よ び,神 経 細 胞 死 を 特 徴 と す る 進 行 性 の 神 経 変 性 疾 患 で あ る42).早 期 発 症 型 家 族 性 ア ル ツ ハ イ マ ー 病 (FAD)と 非 遺 伝 性 の 孤 発 性 ア ル ツ ハ イ マ ー 病 に 大 別 さ れ,FADは そ の 原 因 遺 伝 子 と し て,ア ミ ロ イ ド前 駆 体 蛋 白 質APP,プ レ セ ニ リ ン1(PS1),プ レ セ ニ リ ン2(PS 2)の 遺 伝 子 が 同 定 さ れ て い る43∼46).一 方,孤 発 性 ア ル ツ ハ イ マ ー 病 に つ い て は 発 症 の 詳 細 な 機 序 は よ く わ か っ て い な い. 筆 者 らが 孤 発 性 ア ル ツ ハ イ マ ー 病 の 機 序 解 明 を め ざ し 研 究 を 始 め た こ ろ,孤 発 性 筋 萎 縮 性 側 索 硬 化 症(ALS, ル ー ・ゲ ー リ ッ ク 病 と し て も 知 ら れ て い る)で は,患 者 の 脊 髄 運 動 神 経 細 胞 に お い て グ ル タ ミ ン酸 ト ラ ン ス ポ ー タ ーEAAT2を コ ー ド す る 遺 伝 子 に つ い て,い く つ か の エ キ ソ ンが 欠 失 し た,さ ま ざ ま な 異 常 ス プ ラ イ シ ン グ 産 物 が 発 現 し て い る こ と が 報 告 さ れ た47).そ し て,異 常 ス プ ラ イ シ ン グ に よ りEAAT2蛋 白 質 の 機 能 低 下 を ま ね き,グ ル タ ミ ン 酸 の 取 り 込 み 障 害 か ら神 経 細 胞 死 に 至 る 可 能 性 が 指 摘 さ れ た の で あ る.こ の 現 象 がALSの 発 症 原 因 な の か 結 果 な の か は 明 ら か に な っ て い な い が,孤 発 性 神 経 疾 患 に ス プ ラ イ シ ン グ 障 害 が 関 連 す る と指 摘 し た ア イ デ ア は 画 期 的 で あ り,魅 力 的 で あ っ た.筆 者 ら は こ の よ う な 論 文 を 参 考 に し て,孤 発 性 ア ル ツ ハ イ マ ー 病 患 者 脳 で 異 常 ス プ ラ イ シ ン グ を 起 こ し て い る 遺 伝 子 を 徹 底 的 に 調 べ た.そ の 結 果,FADの 原 因 遺 伝 子 と し て す で に 同 定 さ れ て い たPS2遺 伝 子 の エ キ ソ ン5が 欠 損 し た ス プ ラ イ シ ン グ バ リ ア ン ト(PS2V)を 発 見 し た48). PS2VmRNAは,エ キ ソ ン5を 欠 失 す る こ と に よ り, 野 生 型PS2のN末 端119個 の ア ミ ノ 酸 を コ ー ド し た の ち に フ レ ー ム シ フ トが 起 こ り,新 た に5つ の ア ミ ノ 酸 (SSMAG)を 付 加 し て 終 止 す る(図8a).PS2Vか ら は 確 か に 翻 訳 産 物 が 産 生 さ れ,驚 くべ き こ と に,こ れ は 調 査 し た 孤 発 性 ア ル ツ ハ イ マ ー 病 患 者 の 全 例(22例)か ら 検 出 さ れ た(図8b).そ れ に 対 し,対 照 群 で は1例 の み に 低 レ ベ ル の 発 現 を 認 め た が,そ れ 以 外 は ま っ た く観 察 さ れ な か っ た49.50).こ の よ う な 結 果 は,PS2遺 伝 子 の 異 常 ス プ ラ イ シ ン グ が 孤 発 性 ア ル ツ ハ イ マ ー 病 に か な り特 異 的 な 現 象 で あ る こ と を 示 唆 す る.し か し,PS2Vの 発 現 が 疾 患 の 原 因 の ひ とつ に な っ て い る の か,病 気 の 進 行 過 程 の な か で 産 生 さ れ て き た 二 次 的 産 物 な の か,現 段 階 で は ま だ 明 らか に で き て い な い. 筆 者 ら は,な ぜ 孤 発 性 ア ル ツ ハ イ マ ー 病 の 脳 にPS2 遺 伝 子 の 異 常 ス プ ラ イ シ ン グ が 起 こ る の か に 興 味 を も っ た.PS2Vは 低 酸 素 環 境 下 で 特 異 的 に 発 現 す る.低 酸 素 負 荷 の と き,PS2の エ キ ソ ン5を ス キ ッ プ す る た め に 必 要 な シ ス 配 列 と そ の 部 位 に 特 異 的 に 結 合 す る トラ ン ス 因 子 の 同 定 を 試 み た.そ の 結 果,PS2エ キ ソ ン5で は, 3'末 端 の 約25塩 基 が 低 酸 素 環 境 下 に お け る 異 常 ス プ ラ イ シ ン グ に 大 き な 影 響 を 与 え る こ と,さ ら に は,そ の 部 位 にHMGAlaが 特 異 的 に 結 合 す る こ と が わ か っ た51). HMGAlaはU1-snRNPの コ ン ポ ー ネ ン トの ひ とつ で あ る U1ー70Kと も 結 合 し て お り,PS2エ キ ソ ン5の3'末 端 に 結 合 し たHMGAlaはU1-snRNPを ト ラ ッ プ し,U1-snRNPの5'ス プ ラ イ ス 部 位 へ の ア ク セ ス を 阻 害 さ せ て エ キ ソ ン5を ス キ ッ プ さ せ る と 考 え ら れ る(図8c).こ れ ま で,HMGA1aが 特 定 遺 伝 子 の ス プ ラ イ シ ン グ 制 御 に 働 く こ と は ま っ た く報 告 さ れ て お ら ず,新 し い タ イ プ の ス プ ラ イ シ ン グ 制 御 が 明 ら か に な っ た の で あ る.興 味 深 い こ と に,HMGAlaは 低 酸 素 環 境 下 で 誘 導 が か か り, ス プ ラ イ シ ン グ 因 子 群 が 集 積 し て 存 在 す る ス ペ ッ ク ル に 強 く発 現 す る.PS2以 外 に も,ス トレス 環 境 下 でHMGAla に よ り ス プ ラ イ シ ン グ 異 常 を き た す 遺 伝 子 が 存 在 し て い て も お か し く な い.
お わ りに
ゲ ノ ム情 報 を蛋 白 質 翻 訳 に正 確 に変 換 し て い く過 程 に
お い て,ス
プ ラ イ シ ン グ は 重 要 な ス テ ッ プ に な っ て い
る.多 種 多 様 な遺 伝 子 か ら イ ン トロ ン とエ キ ソ ンを 認識
して 忠 実 に切 断 し,さ ら に はエ キ ソ ン ど う しの再 結 合 が
精 密 に コ ン トロ ー ル され る必 要 が あ る.本 文 中 に も記 載
した が,ひ
とつ の 遺 伝 子 の た っ た1塩 基 の 変 異 が ス プ ラ
イ シ ング の精 密 な制 御 を 撹 乱 し,重 篤 な疾 患 に結 びつ い
て しま う.そ れ ほ どRNAス
プ ラ イ シ ング は厳 密 に制 御
され な くて は な らな い.そ の 精 密 さ を担 うの が さ ま ざ ま
な ス プ ラ イ シ ン グ調 節 因 子・
群 と前 駆 体mRNA側
に 存 在
す る ス プ ラ イ シ ング信 号 配 列 の 巧 妙 な 相 互 作 用 で あ る.
最 近 で は,ス
プ ラ イ シ ン グ 制 御 は 前 駆 体mRNAを
切 断
す る だ け の独 立 した事 象 で は な く,RNAの
転 写,分 解,
核 外 輸 送 な ど と共 役 して 制 御 され て い る こ とが わか っ て
きて い る52,53).それ ら の情 報 ネ ッ トワ ー ク を も と にス プ
ラ イ シ ングが 制 御 さ れ て い る の で あ れ ば,話
は ます ます
複 雑 化 しそ うな 様 相 で あ る.そ れ らネ ッ トワー クが 有 機
的 に 働 く仕 組 み の 解 明 が ス プ ラ イ シ ン グ研 究 の 今 後 の課
題 に な る.
ヒ ト遺 伝 性 疾 患 が ス プ ラ イ シ ング異 常 に よ り起 こ る と
341 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.50No.4(2005)
考 え られ る 割 合 が 想 像 以 上 に 高 く驚 い て い る.さ
らに,
遺 伝 性 で な い 疾 患 の なか に は,こ
こ で 紹 介 した ア ル ツハ
イマ ー病 や 筋 萎 縮 性 側 索 硬 化 症 以 外 に も,環 境 因 子 や 各
種 の ス トレ ス な どに よ りス プ ラ イ シ ング 制 御 機 構 が 障 害
さ れ て 発症 す る疾 患 も存 在 して い る と思 わ れ る.原 因 の
わ か っ て い ない 非 遺 伝 性 の疾 患 に お い て は,こ の よ う な
異 常 ス プ ラ イ シ ング の 観 点 か ら発 症 機 序 を再 検 討 す る必
要 が あ る.
図8
孤 発性 アル ツハ イマ ー病 にお けるPS2の
異 常ス プラ イシ ン グ
(a)PS2お よ びPS2Vの 構 造 と,そ れぞ れ が コ ー ドす る 蛋 白質 を示 す.PS2Vは エ キ ソ ン5が スキ ッ プ する こ とで プ レ.ム シ フ トが起 こ り.5つ の ア ミ ノ酸(SSMAG)を コー ドした の ち終 止 す る. (b)PS2Vか ら産 生 さ れる 蛋 白質 は(矢 頭)患 者の 海 馬神 経 細 胞 に 発 現す る.上;免 疫組 織 化 学,下;免 疫 電子 顕 微鏡 法. (c)PS2の エキ ソ ン5欠 損 モ デル.HMGA-aが エ キ ソ ン5の3'末 端 に結 合 し,U1-snRNPの5'ス プ ライ ス 部 位 へ の ア クセ ス を 阻害 す る. その 結 果,エ キ ソ ン5の スキ ップ が起 こる.342 蛋 白質 核 酸 酵 素Vol.50No.4(2005)
以 上 の よ うに,ス
プ ラ イ シ ン グ は きわ め て 精 巧 に構 築
され た シ ス テ ム で あ る が,そ
れ と同 時 に,わ ず か な狂 い
で破 綻 を きた しや す い デ リ ケ ー トな シ ス テ ム で もあ る.
ス プ ラ イ シ ング 機 構 の 巧 妙 さ と “も ろ さ”の 二 面 性 を十
分 に 理 解 し,近 い 将 来,人
為 的 に そ の シス テ ム を う ま く
制 御 で き る技 術 開 発 が,ス
プ ラ イ シ ング異 常 を起 点 とす
る疾 患 治 療 に望 まれ る.
こ こで 示 した研 究 成 果 の一 部 は,大 阪 大 学 大 学 院 医 学 系 研 究科 遠 山正 彌 教 授 との共 同研 究 の 成 果 で あ り,感 謝 の意 を表 します.1) Breathnach,
R., Chambon, P. : Annu. Rev. Biochem., 50,
349-3830981)
2)
Cartegni, L., Chew, S. L., Krainer. A. R. : Nat. Rev. Genet.,
3,285-298(2002)
3)
Patel, A. A., Steitz, J. A. : Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 4,
970(2003)
4)
Padgett, R. A., Mount, S. M., Steitz, J. A., Sharp, P. A. :
Cell, 35.101-107 (1983)
5)
Kramer, A., Keller, W., Appel, B., Luhrmann, R. : Cell, 38,
299-307(1984)
6)
Black, D. L., Steitz, J. A. : Cell, 46, 697-704 (1986)
7)
Kramer. A. : Annu. Rev. Biochem., 65, 367-409 (1996)
8)谷 時 雄 ・坂 本 博:RNA研 究 の 最 前 線(志 村 令 郎 ・渡 辺 公 綱 編),pp.101-117,シ ュ プ リ ン ガ ー ・フ ェ ア ラ ー ク 東 京(2000)
