氏 名(本 籍 地 〉 鈴 木 厚 子(福 島 県) 学 位 記 お よび 番 号 博 士(歯 学),甲 第335号 学 位 授 与 の 日 付 平 成27年3月10日
学 位 論 文 題 名
論 文 審 査 委 員
「酸 性 細 胞 外pHは,ル イ ス肺 癌 モ デ ル に お け る上 皮 問 葉 系 移 行 を促 進 す る」
(主査)伊 東博 司教授 (副査)加 藤靖正 教授 島村和 宏教授 論 文の内容 および審 査の要 旨
【研 究 目 的 】 癌 細 胞 の 浸 潤 や 転 移 の 過 程 で は,上 皮 の 性 質 か ら 間 葉 系 の 性 質 に 変 化 す る 上 皮 間 葉 系 移 行(EMT)が 注 目 され て い る 。
こ れ ま で に,Katoら,JBiolChem1992)は,
酸 性pHに よ りmelanoma細 胞 に お い てEMTが 誘 導 さ れ る こ と を 見 出 し て い る 。 本 研 究 で は, carcinomaモ デ ル と し て マ ウ ス 肺 扁 平 上 皮 癌 に 由 来 す る ル イ ス 肺 癌(LLC)細 胞 株 を 用 い て,酸 性 細 胞 外pH(pHe） がEMTを 誘 導 す る こ と を 検 証 し た 。
【研 究 方 法 】 始 め に,LLC細 胞 よ り 高 転 移 株 と 低 転 移 株 を 樹 立 し た 。C57BL/6マ ウ ス の 尾 静 脈 に LLC細 胞 を 注 射 し,約3週 後 肺 転 移 を 確 認 し た の ち 転 移 結 節 を 採 取 し デ ィ ッ シ ュ 内 の 培 養 を 繰 り 返 し行 う こ と で 選 択 し た 。 初 回 の 転 移 結 節 か ら 低 転 移 株(LLCm1)と さ ら に3回 の 計4回 の 転 移 を 繰 り 返 し て 得 ら れ た 高 転 移 株(LLCm4)を 用 い て 本 研 究 を 行 っ た 。
細 胞 培 養 はDMEMとF12を 等 量 混 合 し た 培 地 に15mM HEPEs,4mMリ ン 酸,重 炭 酸 ナ ト リ
ウ ムIg/Lお よ び10%fetal bovine serum(FBS) を 添 加 し て 行 い,培 地 のpHは 塩 酸 と 水 酸 化 ナ ト リ ウ ム で 調 整 し た 。 遺 伝 子 の 発 現 はRT‑qPCRに よ り 決 定 し,matrix metaloprotease(MMP)は
ゼ ラ チ ン ザ イ モ グ ラ フ ィ と ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト法 に て 評 価 し た 。 ま たE‑cadherinとvimentinの 発 現 は,免 疫 染 色 法 に よ り 蛍 光 顕 微 鏡 下 で 観 察 し た 。 細 胞 遊 走 はWound healing assayで,浸 潤 活 性 は Boyden chamber assayに よ り 分 析 し た 。
【研 究 結 果 】 両 細 胞 をpH7.4で 培 養 す る とLLCm1 細 胞 は 敷 石 状 に 増 殖 し,LLCm4細 胞 は 線 維 芽 細 胞 様 の 形 態 で 増 殖 し て い た 。 両 細 胞 の 肺 転 移 巣 の 数 を 比 較 し た と こ ろ,LLCm4細 胞 の 転 移 巣 の 数 はLLCm1細 胞 の そ れ よ り も9倍 多 か っ た 。 LLCm1細 胞 を 酸 性 条 件 下 で 培 養 す る と 線 維 芽 細 胞 様 形 態 に 変 化 し た 。MMP‑9活 性 は 両 細 胞 の い ず れ で もpH7.4の 場 合 と 比 べpH6.8条 件 下 で 有 意
に 増 加 し た 。RT‑qPCRに よ る 解 析 で は 両 細 胞 と も に,MMP‑9遺 伝 子 発 現 の み な ら ず,MMP‑3 やMMP‑13の 遺 伝 子 発 現 も 酸 性 条 件 で 有 意 に 増 強 し た 。酸 性pHeは,い ず れ の 細 胞 で も 上 皮 性 マ ー カ ー で あ るE‑cadherinの 発 現 を 減 少 さ せ,間 葉 系 マ ー カ ー で あ るvimentinの 発 現 を 誘 導 し た 。
ま た,酸 性 環 境 で は2種 の 細 胞 で,E‑cadherin の リ プ レ ッ サ ー で あ るTwist1,Twist2, Zeb2mRNAが 上 昇 し て い た 。 さ ら に 酸 性pH刺 激 は 両 細 胞 の 運 動 能 お よ び 浸 潤 活 性 を 促 進 し た 。
【考 察 ・結 論 】LLCm4細 胞 株 は,線 維 芽 細 胞 様 の 形 態 で,LLCm1細 胞 よ り 転 移 能 が 充 進 して い た 。 LLCm1細 胞 を,酸 性 条 件 下 で 培 養 す る と 線 維 芽 細 胞 様 の 形 態 に 変 化 し た 。 こ の こ と は 酸 性pHeに
よ りEMTが 誘 導 さ れ た こ と を 示 唆 し て お り,そ の 仮 説 に つ い て 検 討 した 。 ま ず 細 胞 外 マ ト リ ッ ク
ス の 分 解 酵 素 の 分 泌 に つ い て 調 べ た 。MMP‑3,
‑9,‑13の 発 現 が,酸 性 条 件 下 で 有 意 に 亢 進 し た 。 MMP‑9やMMP‑3,MMP‑13は 癌 細 胞 が 血 管 等 へ の 浸 潤 ・転 移 す る 際 の 重 要 な 分 子 で あ り ,基 底 膜 分 解 と 基 底 膜 内 移 動 は,転 移 の 律 速 段 階 と 考 え ら れ て い る 。 酸 性pHeに よ るE‑cadherinの 低 下 と vimentinやMMPsの 誘 導,そ し て 浸 潤 能 の 亢 進 は, 低 転 移 性 の 癌 細 胞 に 見 ら れ た,酸 性 細 胞 外pHに よ る 形 態 の 変 化 が 上 皮 問 葉 系 移 行(EMT)に よ
る 事 を 示 して い る 。 本 研 究 で は 酸 性pHeに よ り, い ず れ の 細 胞 に お い て もTwist1,Twist2,Zeb2 が 誘 導 さ れ た,一 方,Snail,Slug,Zeb1の 遺 伝 子 発 現 に は 変 化 を 及 ぼ さ な か っ た 。 こ の こ と か ら, 本 研 究 に お け るE‑cadherinの 転 写 抑 制 機 構 の1 つ に は,Twist1,Twist2,Zeb2が リ プ レ ッ サ ー
と して 作 用 し て い る 可 能 性 が 示 さ れ た 。
以 上 の こ と か ら,酸 性 細 胞 外pHはEMTを 誘 導, 促 進 す る 細 胞 外 微 小 環 境 因 子 で あ る と い う 結 論 を 得 た 。
本 論 文 の 審 査 委 員 会 は 平 成27年1月9日 に 開 催 さ れ た 。 初 め に 申 請 者 か ら論 文 内 容 に 関 す る 説 明 が あ り,そ の 後,委 員 よ り1)LLC細 胞 の 由 来,
2)LLCm1細 胞 とLLCm4細 胞 の 樹 立 方 法,3) 両 細 胞 のEMT関 連 遺 伝 子 発 現 様 式 の 違 い,4) E‑cadherinの 転 写 機 構 な ど に つ い て 質 疑 が あ り, そ れ ら の い ず れ に 対 し て も 申 請 者 か ら 的 確 な 解 答 が あ っ た 。 ま た,審 査 委 員 会 は 和 文 抄 録 の 一 部 修 正 を 求 め,後 日,修 正 が な され た こ と を 各 委 員 が 確 認 し た 。
審 査 委 員 会 は 本 論 文 が 歯 科 医 学 の 発 展 に 寄 与 す る も の で あ る と 認 め,申 請 者 は 学 位 授 与 に 値 す る と 判 定 し た 。
掲 載 雑 誌 Cancer Cell International 2014,14:129 DOI:10.1186/s12935‑014‑0129‑1
