九州大学学術情報リポジトリ

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Kyushu University Institutional Repository

メタンフェタミン誘発逆耐性現象における皮質-線条 体グルタミン酸神経伝達に関する電気生理学的解析

森口, 茂樹

九州大学薬学研究科医療薬学専攻

https://doi.org/10.11501/3180250

出版情報：Kyushu University, 2000, 博士（薬学）, 課程博士 バージョン：

権利関係：

メタンフェタミン誘発逆耐性現象における

皮質一線条体グルタミン酸神経伝達に関する電気生理学的解析

2001年

森口 茂樹

θ

メタンフェタミン誘発逆耐性現象における

皮質一線条体グルタミン酸神経伝達に関する電気ゾJ:_.ÐE学的解析

2001イr

九州大学大学I�� 薬乍併先科 同1:1課干lt

jih.効解析学分野 森I I 茂樹

目次 緒 言-

第 -章 メタンフェタミン誘発行動逆耐性モデルラットの作製一一一一一一一一一一一- 3

1. 実験材料ならび、に実験方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一3 1-1. 実験動物ならびに飼育方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 3 1-2. 使用薬物ならびに投与方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一3 1-3. 実験スケジュール一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一---4 1・4. 実験方法ならびに実験装置一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一4 1-5. 統計学的処理一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一-4

2. 実験成績一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一6 2-1. メタンフェタミンによる自発運動興室作用一一一一一一一一一一一一一一一一一6

3. 考察一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一-ó

第二章 メタンフェタミン休薬時における線条体ニューロンのグルタミン酸受容体の変化 に関する検討一一一一一一一一一一一一一一一---一一一一一一一一一一一一一一一一9

第 一節 メタンフェタミン休薬時における皮質一線条体グルタミン酸神経伝達の変化に関 する電気生理学的検討一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一ー9

1. 実験材料および実験方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一9 1-1. 実験動物ならびに飼育方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一--- 9

1-2. 人て栄養液の調整方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一--- 9

、lj-ti Jft\

1-3. パッチ電極内人工液(Internal solution)の調整方法一一一一一一一一一一一一一10 ト4. 線条体スライス標本の作製方法ならびに保生法一一一一----一一一一一一一一一-10 1-5. 実験装置一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一13 1・6. 記録電極作製一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一13 1-7 細胞内染色法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一13 1・8. 刺激電極作製， 刺激方法ならびに記録部位一一一一一一一一一一一一一一一一一16 1・9. 使用薬物ならびに調整方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一16 1-10. 実験スケジュールー一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一ー16 1-11. 統計学的処理一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 19

1・1. 実験動物ならび、に飼育方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一--33 1-2 使用薬物ならびに実験スケジュール一一一一一一一一一一一一一一一一一一一--33 1-3. SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびイムノブロット(ウ エスタンプロッティング)一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一---一一一一一・33 1-4. 実験装置一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一34

2. 実験成績一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一- 34 2-1. NMDA受容体サブユニットの検討一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一- 35 2・2-1. NR2Cサブユニットの発現一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一- 35

2. 実験成績一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一ー19 2-1. 線条休神経細胞のシナプス形態一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一19 2-2. 線条体神経細胞の電気的膜特性一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一19 2-3. 白質単発刺激により誘発される線条体神経細胞のシナフ。ス後電位へのメタンフェ タミン休薬時の影響一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一22 2-4. 白質高頻度刺激により誘発される線条体神経細胞のシナフ。ス後電位へのメタンフ ェタミン休薬時の影響一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一ー一一一一---22 2-4・1. NMDA， AMPNKinate (non-NMDA)， GABAA受容体桔抗薬の影響一一一一一-22 2-4-2. Mg2+ free条件下の影響一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一28 2-5. 臼質高頻度刺激により誘発されるNMDA受容体を介したシナブpス後電位へのメタ ンフェタミン休薬期間の影響一一一一一一一一一一一一一-一一一一一一一一一一一一--28

3 考察ー一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一35

第三節 cAMP依存'性Protein kinase (Protein kinase A)ならび、にProtein kinase Cによるリン酸 化の影響一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一37

3. 考察一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一- 31

1. 実験材料および実験方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一- 37 1-1. 実験動物ならびに飼育方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一37 1・2. 人工栄養液の調整方-法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一--39

1-3 パッチ電極内人工液の調整方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一39 1-4. 線条体スライス標本の作製方法ならびに保生法一一一一一一一一一一一一一一一39 1-5. 実験装置一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一39 1-6. 記録電極作製一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一--39 1-7. 刺激電極作製， 刺激方法ならびに記録部位一一一一一一一一一一一一一一一一一39 1-持. 使用薬物ならびに調整方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一--39 1-9. 実験スケジュール一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一40 1-10. 統計学的処理一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一- 40 第二節 NMDA受容体サブユニットの組換えの影響一一一一一一一一一一一一一一一-- 33

1. 実験材料および実験方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一- 33

、、，JJ・­.‘EE--〆't、、 、1/・1よ・・1ム.，aEA f'\

2. 実験成績一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一- 40 2-1. メタンフヱタミン休薬時における高頻度刺激によ り 誘発されるシナフ。ス後電位へ のリン酸化阻害薬の影響一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一40 2-ト1. protein kinase C阻害薬の影響一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一40 2・1-2. protein kinase A阻害薬の影響一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一---41 2-2. 高頻度刺激によ り 誘発されるシナブpス後電位へのリン酸化活性化薬の影響一一一41 2・2-1. Protein kinase C活性化薬の影響一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一41 2・2-2. protcin kinase A活性化薬の影響一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一43 2-2-3. protein kinase C活性化薬および戸otein kinase A活性化薬の影響一一一一一一 43 3. 考察一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一- 43

第L章 メタンフェタミン休薬時におけるグルタミン酸神経伝達の可塑的変化に関する電 気性理学的検討

1. 実験材料および実験方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一- 48 1-1 . 実験動物ならびに飼育方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一48 1・2. 線条体スライス標本の作製方法ならびに保生法一一一一一一一一一一一一一一一48 1-3. 実験装置一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一---48 1 ・4. 記録電極作製一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一49 1・5 刺激電極作製， 刺激方法ならびに記録部位一一一一一一一一一一一一一一一一一49 1-6. 使用薬物ならびに調整方法一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一49 1-7. 実験スケジュール一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一49 1・8 統計学的処理一一一一一一一一一一一一一一---ー一一一一一一一一一一一一一49

2. 実験成績一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一-- 51

( iv )

2-1.

テ

タ

ヌ

ス刺激によ り 誘発

さ

れるシナ

プス後電位の長期 増 強現象

一一一一一一一一51 2・1・1. NMDA受容体結抗薬の影響一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一- 51 2-1 -2. Mg2+仕ee条件下の影響一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一--51 2・1-3. protein kinase C活性化薬の影響一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一54 2-1-4. protein kinase A活性化薬の影響---一一一一一一一一一一一一一一一一---54

3. .-f号祭ーーー一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一- 54

総 括一一ー一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一--57

参考文献一一一一一

謝辞-一一--一---一一一一一ーー一一一一----一一一一一ーー一一一一-一一一一一-一ー一一--65

(v)

AMPA

BMI

CPP

DA DPSPs

EPSPs

KA

LTD LTP MW NBQX NMDA

PBS PDA PKA PKC Str

略語表

:α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate :bicuculline methiodide

:3-

(

2-carboxypiperzin-4-yl

)

-propyl-l-phosphonic acid :dopamine

:depolarizing postsynaptic potentials :excitatory post synsptic potentials :kainate

:long-term depression :long-term potentiation

:methamphethamine withdrawal

:3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamony-benzo

[

^f

]

quinoxaline :N-methyl-D-aspartate

:phoshate buffered saline

:phorbor 12， 13-DL-acetate :cAMP-dependent protein kinase

:protein kinase

C

:neostnatum

緒言

大脳基底核は運動機能にとって重要な役割を担っており、 運動の発現や制御を行ってい ると考えられている。 なかでも、 線条体は大脳基底核の主要部分を占める大きな核であ り、 高次機能を担い、 運動を円滑に遂行するというような調節機能において重要な役割を 果たしている(Alexander& Crucher， 1990)。

線条休へ投射する主な入力系として大脳皮質および視床からグルタミン酸、 黒質紋銃汚I�

からドーパミンの投射を受けている。 これらグルタミン酸およびドーパミンは線条体の運 動機能の調節において非常に重要な役割を果たしている。

線条体ニューロンは、 α国amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate

(AMPA)、 カイニン酸(KA)、 N-methyl-D-aspartate

(

NMDA)および代謝型グル タ ミン酸受容体の4つの主要なグルタミン酸のサブタイプを有している(Herring， 19R5;

Cherubini et a1.， 1988; Jiang

&

North， 1991; Kita， 1996)。 線条体ニューロンの膜電位が静止 膜電位の際、 皮質一線条体グルタミン酸シナプス伝達は主にAMPNKAにより調節されて いる。 この際、 NMDAおよび代謝型グルタミン酸受容体のシナプス伝達に対する関与は

小さいo 方、 線条休ニューロンの皮質入力による脱分極が閥値レベル近くまで十分に強 められたとき、 NMDA受容体は活性化され、 シナプス伝達に関与する(KÜa， 1996)。

NMDA受容体の活性化は、 学習や記憶の獲得の基礎と考えられているシナプス可塑性に 潜花的に関与している。 加えて、 NMDA受容体の活性化は一酸化窒素(NO)を産生し、

神経調節凶子、 神経の毒性分子として作用している(Bogdanov & Wurtman， 1997)。 さら に、 NMDA受容体の活性化は興奮毒性を有し、 神経細胞死を誘導し、 ハンチントン病の 民側の 」っとして与えられている。

近年、 我が国の大きな社会問題のーっとして、 覚醒剤の乱用による精神障害が考えられ ている。 覚醒剤の一つであるメタンフェタミンは、 ドーパミン神経終末からのドーパミン 遊離促進、 ドーパミン取り込み阻害、 モノアミンオキシターゼ(MAO)の阻害の3つの作 JlJによってドーパミン神経伝達を克進することによりドーパミン神経終末部でシナプス間 隙のドーパミンを増加させ、 ラットでは異常行動を誘発すると考えられている(Stephans

& Yamamoto， 1995)。 さらに、 メタンフェタミンは、 ドーパミントランスポーターの数を

減少させることが報告されている(Nakayama et a1.， 1993)。 ラットにおけるメタンフェタ

1

ミンの反復投与は;、 メタンフェタミンの行動量増加作用に基ずき、 長期的な休薬後にメタ ンフェタミンの再投与による行動逆耐性の発現が認められる(メタンフェタミン行動逆耐 性)

(Hirabayashi

&

Alam， 1981; Kuczenski

&

Segal， 1989)。 現在、 メタンフェタミン行動 逆耐性の貴重なメカニズムは明らかにはされておらず、 NMDA受容体を介した皮質一線 条体シナプス伝達が、 メタンフェタミン行動逆耐性において変化している可能性が考えら れる。 メタンフェタミン行動逆耐性において、 ラット線条体におけるドーパミン遊離は冗 進している(Cattaneda et al.， 1998 ; Patrick et al.， 1991)。 さらに、 ドーパミンはNMDA受 容体機能を充進する(Blank et al.， 1997; Colwcll et al.， 1995; Capeda et al.， 1998)。 アンフヱ

タミン行動逆耐性は、 NMDA受容体桔抗薬であるMK-801の投与により抑制される

(Karler _ct al.， 1989， 1991; Ohmori et al.， 1994， 1996)。 さらに、 MK-801は、 メタンフェタ ミン行動逆耐性と相関している線条体のFos蛋白の発現の増加を抑制する(Ohno et al.，

1994)。 さらに近年、 メタンフェタミン逆耐性ラットにおける皮質一線条体シナプス伝達 の長期的な可塑性の変化が報告されている(Nishioku et al.， 1999)。

本研究では、 メタンフェタミン逆耐性における線条体のNMDA受容体チャンネルの性 質の変化を電気生理学的、 さらに、 westem immunoblot法を用いて検討した。 そこで第 ­

章では、 メタンフェタミン行動逆耐性を自発運動量を指標に検討した。 第二章では、 メタ ンフェタミン休薬ラットを用いて、 NMDA受容体を介した皮質一線条体グルタミン酸シ ナフ。ス伝達の変化について電気生理学的に検討した。 さらに、 線条体二ユーロンの細胞内 情桜伝達系について電気生理学的手法、 westem immunoblot法を用いて検討した。 第三章 では、 メタンフェタミン休薬ラットを用いて、 皮質一線条体グルタミン酸シナプス伝達の

可塑的変化について検討した。

本研究により、 メタンフェタミン行動逆耐性における潜在的なメカニズムとして、 メタ ンフェタミン反復投与後、 休薬期間におけるNMDA受容体を介した皮質一線条体シナプ ス伝達の充進が引き起こされていること、 さらに、 このNMDA受容体を介した皮質一線 条体シナプス伝達の充進は、 膜電位依存性Mg2+閉塞の解除が原因である可能性を初めて 報告した。

2

第 a章 メタンフヱタミン誘発行動逆耐性モデルラットの作製

覚醒剤は乱用により深刻な精神障害を引き起こすことから、 我が国でも大きな社会問題 になっている。 人においては、 覚醒剤の連用により幻覚、 妄想、の出現が起こりやすくな り、 長期に断薬した後でも少量の薬物再使用やさらには非特異的な刺激によってもこの症 状は容易に出現するようになる(フラッシュパック現象)。 一方、 動物にメタンフェタミ ンを投与すると自発運動量充進作用および常同行動誘発作用が認められる。 さらに、 メタ ンフェタミンを反復投与し、 長期休薬後、 メタンフェタミンおよび、中枢刺激薬の少量再投 与、 ストレスなどによってもこの症状が容易に出現するようになる、 いわゆる逆耐性現象 (行動逆耐性)が発現することが知られている(Kalivas ^& Stewart， 1991)。 このような 特徴を有している逆耐性現象は、 休薬日数によりその自発運動量の充進の程度が変化する

ことがこれまでに報告されている(Kalivas ^& Duffy， 1993: Wolf et al.， 1993)。

そこで第 A章では、 メタンフェタミン誘発行動逆耐性モデルラットの確立のため、1^J-.動 薬理学的側面から検討した。

1. 実験材料ならびに実験方 法

1-1. 実験動物ならびに飼育庁法

本実験には、 Wistar系雄性ラット(8'"'-'10週齢、 九動産)を用いた。 ラットは恒温恒湿 (23士20C、 60%)、 12時間の明暗サイクル(点灯7 : 00---19 : 00)の動物飼育室で、 プラ スチック製ケージ(30X35X17cm)内に実験開始前は各々3'"'-'4匹、 実験開始後は同じ薬 物処倍したラットを2'"'-'3匹を一群にして飼育した。 また、 餌と水は自由に摂取させた。

1之使用薬物ならびに投与方法

使用した薬物は、 methamphetamine ^• HCl (大日本製薬)を用いた。 メタンフヱタミン は、 生理食塩水に溶解して室温で保存し、 メタンフェタミン(1.0 mg!kg)および対照群 として空時食塩水をラットの体重100g当たりO.1mlの容量で腹腔内投与で用いた。

1-3. 実験スケジュール

実験スケジュールはFig.lに示すとおりである。 SC.lのスケジュールについては、 メタ ンフェタミン(1.0 mg!kg)および生理食塩水をホームケージで1回投与し、 翌日にMAP(

0.5 mg!kg i.p. )を再投与して自発運動量を測定した(メタンフェタミン急性効果)。

-)j、 SC.2のスケジュールについては、 メタンフェタミン(1.0 mg!kg)および生理食塩 水をホームケージで1日1回反復投与(計6日間)し、 翌日にメタンフェタミン(0.5 mg/kg i.p. )を再投与して自発運動量を測定した(メタンフェタミン休薬1日)。

さらに、 SC.3のスケジュールについては、 メタンフェタミン(1.0 mg!kg)および午用食 出ノkをホームケージで1円1回反復投与(計6日間)し、 7日後にメタンフェタミン( 0.5 mg!kg i.p.)を再投与して自発運動量を測定した(メタンフェタミン休薬7日)。

Sc.1 ιZF1j

methamphetamine 1 mg/kg for 6days

1-4. 実験方法ならびに実験装置 Sc.2

/ト +|

↑ ↑ ↑ ↑

11非軍動量海I[W挟

自発運動量の測定は30X35X17cmのケージの中に1匹ずつ動物を入れ、 赤外線エリアセ ンサー(形F5B、 オムロン社製)を用いて点灯下6分間隔で行った。

Sc.3 ζ竺竺ω ^… y

↑↑↑↑↑↑

( 1 )臼発運動量測定装置

41

_X

90

_X

180cmのボックスを4段に区切り各段に2ヶずつ赤外線エリアセンサーを取り付 け、 その真下にケージを置いた。 センサーは隣のケージの動物を感知しないように適当な 間隔をあけて設置し 、 装置の各段には換気扇と蛍光灯を取り付けてある。

\，「 A干

MAP O.5mg/kg

vf1側\

MAP O.5mg/kg

abstinence 7days

斗

MAP O.5mg/kg

Fig. 1 Schedule of locomotor activity; Sc. 1 (Acu) : a single treatment of methamphetamine， Sc. 2 (1 d) : chronic treatment of methamphetamine for 6 days fo"owed by withdrawal for a day， Sc. 3 (7d) : chronic treatment of methamphetamine for 6 days followed by withdrawal for 7 days.

( 2 )赤外線エリアセンサー

このセンサーは赤外線エネルギーを検出する複数のエリアを水平、 垂直方向にあらかじ め設定しておき、 このエリア内での動物の運動を感知するものである。 よってエリア以外 で動物が運動している場合やエリア内で静止している場合は感知しない。

1・5. 統計学的処理

値はすべて平均士標準誤差で表し、 データの有意差検定はStudent's t-testを用いて行つ

4 5

「

^ーーーーーーーーーーー一一一一一一一一一

....

一一一一ーー一一一一一一ー一一一一一一一

一 週

。

た

2. 実験成績

2-1. メタンフェタミンによる自発運動興奮作用

Fig.2には、 メタンフェタミン再投与による90分間の自発運動量を示した。 メタンフエ タミン急性効果(Sc.1)を測定した結果、 生理食塩水投与群(408+129.9: n=5)およびメ タンフェタミン投与群(517+ 107.5: n=5)において有意な差は認められなかった。 次に、

生理食塩水反復投与およびメタンフェタミン反復投与(1日1回計6日間)後、 休薬1日目に [iî]様にメタンフェタミン再投与による自発運動量を測定した。 その結果、 生理食塩ノ'1<&復 作lJ群(490.2

+

124.6: n=5)およびメタンフェタミン反復投与群(752.4土181.1: n=5)に おいて有意な差は認められなかった。 さらに、 生理食塩水反復投与および、メタンフェタミ

ン反復投与(1日1回計6日間)後、 休薬7日目に同様にメタンフェタミン再投与による自発 運動量を測定した。 その結果、 生理食塩水反復投与群(458.8土59.5: n=5)に比べ、 メタ

ンフェタミン反復投与群(1745.8:::t 227ぷn=5)において有意な自発運動量の増加が認め られた。

**

口Saline 1-1

.E2000「

11

^MW

ε

3C4z

^{4 2}

¹⁵⁰⁰

0

81000 雪 4 。

=d h

500

《 。

7d

Acu 1d

3. 考察

Fig. ² Effect of methamphetamine challenge on locomotor activity after treatment of methamphetamine (1 mg/kg， i.p.) with various schedules. Acu:

a single treatment of methamphetamine， 1 d: chronic treatment of

methamphetamine for ⁶ days followed by withdrawal for a day， 7d: chronic treatment of methamphetamine for ⁶ days followed by withdrawal for 7 days. At the end of these schedules， locomotor activity of each animal was measured after injection of saline or methamphethamine (0.5 mg/kg， i.p.).

(対Pく0.01 as compared with saline-injection groups; Student'sιtest).

第 ー章では、 メタンフェタミン再投与により観察される自発運動量元進の増強を、 赤外 線エリアセンサーを用いて評価した。 メタンフェタミンの自発運動量充進作用の発現は、

'1-J淑ドーパミン神経系が関与しており、 中脳ー側坐核、 黒質一線条体ドーパミン神経系の 活性化が必要とされている(Kelly et al.， 1975)。 本研究で用いたメタンフェタミンの濃度 (低容量)を考えると、 メタンフェタミンによるドーパミン神経終末からのドーパミン 遊離促進、 ドーパミン取り込み阻害作用により自発運動量が増加したものであり、 ドーパ ミントランスボーターを介した神経終末部でシナプス間隙のドーパミンを増加させ、 異常 行動を誘発したことが考えられる(Stephans， 1995)。

本研究では、 自発運動量発現を指標にメタンフヱタミン急性効果(Sc.1)、 メタンフェ

6 7

タミン休薬1H (Sc.2)、 メタンフェタミン休薬7日(Sc.3)のスケジ、ユールで検討した。

その結果、 メタンフェタミン休薬7日において、 メタンフェタミン行動逆耐性の有意な増 強が認められたが、 メタンフェタミン急性効果、 メタンフヱタミン休薬1日においては、

影響は認められなかった。 これまでコカイン慢性投与 による行動逆耐性発現には、 休薬1

11 l j において自発運動量の有意な増加は認められない(Kalivas & Duffy， 1993)。 さら

に、 アンフヱタミン慢性投与による行動逆耐性発現には、 休薬3--4日目において有怠なI'J 党運動量の増加が認められることが報告されている(Wolf et al.， 1992)。 本研究結果 (Fig.1)および上記の報告より、 ラットにおけるメタンフェタミン誘発行動逆耐性の允 現には、 メタンフェタミン反復投与後、 ある一定の休薬が必要であることが明らかとなっ た。 第 」章では、 メタンフェタミン誘発行動逆耐性モデルラット作製のスケジュールの確

\ l!�をわ:った。

8

第二章 メタンフェタミン休薬時における線条体ニューロンのグルタミン酸受容体の変化 に関する検討

第 a節 メタンフェタミン休薬時における皮質一線条体グルタミン酸神経伝達の変化に関 する電気生理学的検討

メタンフヱタミン逆耐性現象の神経科学的基盤の検討は、 メタンフェタミンの急性効果 がドーパミン遊離増加 に基ずくことから、 ドーパミ ン神経 系を中心に行われてきた (Karlar et al.， 1991; Hamamura et al.， 1991; Ujike et al.， 1990)。 近年、 この逆耐性現象には ドーパミン神経系以外の神経系の関与を示唆する報告がいくつかなされている(Ujike et al.， 1992; Wolf & Khansa.， 1991; Karler et al.， 1989， 1991; Ohmori et al.， 1994， 1996; Ohno et al.ヲ 1994)。 なかでも、 アンフェタミン行動逆耐性は、 NMDA受容体括抗薬であるMK-801の 投与により抑制される(Karler et al.， 1989， 1991; Ohmori et al.， 1994， 1996) 0 MK-801は、

メタンフェタミン行動逆耐性と相関している線条体のFos蛋白の発現の増加を抑制する (Ohno et al.， 1994)など、 グルタミン酸神経系、 特にNMDA受容体の関与が指摘されてい る。

第二章第一節では、 メタンフェタミン誘発行動逆耐性の形成期間におけるグルタミン酸 受代休、 特にNMDA受容体の関与を検討する目的で、 NMDA受答体を介した皮質一線条 体グルタミン酸シナプス伝達の変化について電気生理学的手法を用いて検討した。

1. 実験材料および実験方法

1-1. 実験動物ならびに飼育方法

実験動物ならびに飼育方法は、 第一章1・1と同様に行った。

1-2. 人工栄養液の調整ノぢ法

スライス標本の人工栄養液としてKrebs-Ringer液を用いた。 その化学的組成はTable.1に

9

ぶした。 このKrcbs-Ringer液は370C恒温槽中で保温しながら95%-02 / 5%-C02混合ガスを30 分以上通気し、 酸素を飽和させた。 この操作で作製した溶液は、 PHは約7.4、 浸透圧は約 307mOsmとなり、 生体内とほぼ同ーとなる。 なお、 特に明記しない限り、 Krebs-Ringer液 は_{実験期 間}中_常に95%ー02 / 5%-C02混合ガスを通気した。 また、 本研究に用いた水は全て 白動蒸留装置(Yamato WG25)によって蒸留精製したものを超純水製造装置(Milli Q，

Mjllipore)に通したものである。

1-3. パッチ電極内人工液(Internal solution)の調整方法

パッチクランプ法の電極内人工液の組成はTable.2に示した。 電極内人工液はKOHによ りPHを約7.4に調整した。 この操作で作製した溶液は、 神経細胞内の組成とほぼ同 Aとな

る。

1-4. 線条体スライス標本の作製方法ならびに保生法

線条体スライス標本の作製方法は、 Nakanishi et al.， (1997b); Yamamoto et al.， (1999)に準 じて行った。 ラットの胸部および頚部を殴打した後、 頭頂部を開頭し脳組織を損傷しない ように素早く脳を摘出し、 約40CのKrebs- Ringer液中に入れ、 冷却した。 この操作により、

神経細胞の代謝および酵素活性を一時的に低下させ、 酸素供給不足による損傷を防ぐとと もにスライス標本作製が容易となる。 約40CのKrebs-Ringer液より取り出した脳は、 正中線 より切断し、 2分した。 このように作製した脳組織を平面より約百℃の角度で傾けたカミ ソリ刃をもっビブラトーム(Vibroslice， 752M， Campden， Instruments) (Pic.1)の試料台に 寒天ブロック(寒天末を蒸留水に4%となるように加熱溶解し、 約40Cに冷却して作製)と ともに瞬間尿着剤を用いて接着固定した。 次に試料台内を約40Cに冷却したKrebs-Ringer液 を満たし、 脳組織を約400μmの厚さで前額断面スライス(細胞外記録)および水平断面ス

ライス(パッチ・ クランプ)を作製した。 さらに、 カミ ソリ刃でトリミ ングするととによ り大脳皮質と線条体を含むスライス標本を作製した。 作製したスライス標本はインタ ーフェイスチャンパに移し、 少なくとも2時間以上95%ー02 / 5%-C02混合ガスで通気した Krebs-Ringer液で保坐した。

10

Table1

Composition of Kreb's Ringer Solution

Compound Concentration (mM)

NaCI 126.0

KCI 2.5

KH2P04 1.2

MgS04 1.2

CaCI2 2.4

NaHC03 25.0 Glucose 11.0

Table.2

Composition of Internal Solution

Compound Concentration (mM) K-glucronate 120.0

HEPES 10.0

EGTA 1.0

KCI 20.0

MgCI2・6H20 20.0

Na2・ATP 2.0

Na2・GTP 0.25 KOH ajust

PH 7.4

11

Pic. 1 Vibroslice

12

1・5. 実験装置

Fig .3に電気生理用実験装置を図示した。 さらに、 Pic-2には電気生理用実験装置の写真 を示した。 線条体ニューロンからのホールセル記録 はEP C・ 9パッチクランプ用増幅器(ア ンプ)(HEKA， Lambrecht， Germany )で増幅し、 ブラウン管オシロスコープ(VC-I0，日本 光電)にて観察すると共に、 解析装置(HEKA， Lambrecht， Germany ) を用いて解析した。

チャンパはアクリル製インターフェイスタイプを使用した(Pic-3) 。 水槽内の水はヒー ターにより 35+ 0.1 ocに保たれており、 潅流液はこの水槽を通過した後、 流速3.5ml/minの スピードで記録用槽に入る。 記録用容器の側面はやや傾いており、 潅流液はスライス標本 の底面をゆっくり通過し、 ぺリスタポンプにより 吸引除去した。 また、 スライス容器内 に水分を飽和し、 35士O.lOCに保たれた9 5%・02/5%-C02混合ガスを満たすことによりスラ イス標本の表面の乾燥ならびに酸素欠乏を防いだ。

1-6. 記録 電極作製

パッチ電極には、 外径1.5mm、 内径O.9mmのガラス電極を使用した(成茂科学製)。 電 極はサッタ一社製フラー(Model P-97， Sutter Instruments， Navato， CA) (Pic-4)により電極 抵抗が5�10MQなるように調整した。 電極内には、 パッチ電極内人工液を充填した。

1-7. 細胞内染色法

線条体二ユーロンは、 1% Neurobiotin (Vector Laboratories， Burlingame， CA)により細胞 内染色を行った。 染色後、 スライスは 4%パ ラホルムアルデヒドにより40Cにおいて一晩固 定し、 PBSで洗浄後、 40Cにおいて 20%煎糖液に 2 4時間液浸後、 クリオスタットにより 30μmの切片を作製し、 室温においてStreptavidin-Alexa 488 (Molecular Probes， Eugene，

OR)で2時間反応させた 。 PBSで洗浄後、 ス ラ イ ス切片はVe c t a s h i e l d ( Vecto r Laboratories)と共にスライドガラス上で固定し、 蛍光顕微鏡により観察した。

13

0295 %/C025 %通気

薬物混入リンゲル液 リンゲル液

ぞ〉

=方コック ペンレコーダー

。

ータ'

^。

。

。

Fig. 3 Methods of inter-face type chamber on electrophysiological study

Pic.2 Electrophysiological methods

14

Pic. 3 Inter-face chamber

Pic. 4 PULLER

15

1-R. 刺激電極作製， 刺激方法ならびに記録部位

刺激装置は、 日本光電製 E lectronic Stimulator SEN-3301を使用した。 刺激電極には直径 O.25mmのステンレススチール線を先端約0.5mm を残してポリウレタンで絶縁した双極電 極を使用した。 Fig.4に示すように、 実体顕微鏡下で操作しながら、 刺激電極を白質に設 問した。 刺激はパルス幅0.2msec、 刺激強度1・15V、 刺激頻度O.lHzを用いた。 記録部作 は、 線条体ニューロンより 記録した。

1-9. 使用薬物ならびに調整方法

実験に用いた薬物は以下の通りであり 、 それぞれ所用濃度にKrebs-Ringer液中に溶解し 潅流適用した。

Methamphetamine HCl (大日本製薬)， 3-(2・carboxypiperzin・4・yl)-propyl・1・phosphonic acid

(CPP，

Sigma)， bicuculline methiodide (BMI， Sigma)， 3・dihydroxy-6-nitro・7・sulfamony­

benzo[ f]quinoxaline (NBQX， Research Biochemicals International， Natick， MA)

1-10. 実験スケジュール

メタンフェタミン投与 スケジュールは第一章1-3と同爆に作製した。 線条体スライスは Fig.5に示すスケジュールにおいて作製した。

Sc.lのスケジュールについては、 メタンフェタミン(1.0 mg/kg)および、生理食塩水をホ

ームケージで1回投与し、 翌日にスライスを作製した(メタンフェタミン急性効果)。

Sc.2のスケジュールについては、 メタンフェタミン(1.0 mg!kg)および、生理食塩水をホ ームケージで1日1回反復投与(計6日間)し、 翌日にスライスを作製した(メタンフェタ ミン休薬1日)。

SC.3のスケジュールについては、 メタンフェタミン(1.0 mμ喝)および、生理食塩水をホ ームケージで1日1回反復投与(計6日間)し、 7日後にスライスを作製した(メタンフェタ ミン休薬7日)。

16

Stimulating Electrode

Subcortical Wh itematter

Cerebral Cortex

Recording Electrode

Fig. 4 Position of stimulating and recording electrode in neostriatal slice

17

Sc.1 ，. ¹ : ^g / ^{ぷ or} ロ ^e y

尚、 本研究におけるメタンフェタミン休薬ラットとは第一章の自発運動量の測定結-*よ り、 SC.3のスケジュールで作製したラットである。

abstinence 1day

斗 ¹ -

^{11. 統 計 学}

^的

^処理

値はすべて平均士標準誤差で表し、 データの有意差検定はStudent's t -testを用いて1 JOOっ

slice

た。

preparation

Sc.2 ぶ

n o

e a

、冒 司

・h‘l同町

e \

-

4 剖 叩 C 同 国

n

­ e y - p n

d - -U a -

S

、、E『 Aali--

a園田

hu - 1 ・

a-IE11

Aalii­

aali--

Aait--

methamphetamine 1 mg/kg for 6days

Sc.3 ，. ^1mg附6days y

↑↑↑↑↑↑

2. 実験成績

2-1. 線条体神経細胞のシナプス形態

abstinence 7days

正常ラットの線条体ニューロンは、 1% Neurobiotinによる細胞内染色を用いて形態を観 察した(Fig.6)。 染色した線条体ニューロンは樹状突起が広範囲に伸びており、 特に遠 似の樹状突起は高密度のスパインに覆われていた。 また、 軸索に多数の分岐が認められ た。 これ らの形態学的特徴より今回得られた記録は全て投射ニューロンであることが知ら れてい る中型有赫細胞(Medium Spiny Neuron)からのものであると考えられる。

斗

slice preparation

2-2. 線条体神経細胞の電気的膜特性

Fig. 5 Schedule of neostriatal slice preparation ; Sc. 1 (Acu) : a single treatment of methamphetamine， Sc. 2 (1 d) : chronic treatment of methamphetamine for 6 days followed by withdrawal for a day， Sc. 3 (7d) : chronic treatment of methamphetamine for 6 days followed by withdrawal for 7 days.

18

ホールセル記録には、 対照ラット(n=32)およびメタンフェタミン休薬ラット

(休薬7日、 n=34)の線条休ニューロンからそれぞ、れ記録を行った。 記録した線条体ニュ ー口ンは、 少なくとも60分間以上安定していた。

始めに 、 線条体神経細胞の静止膜電位ならびに入力抵抗の測定を 行った(Fig.7，

Tahle.3)。 記録中の電位と細胞外電位との電位差として測定した静止膜電位の、下均は、

対照ラット(-74.9::t 2.0m _V， n二32)、 メタンフェタミン休薬ラット(ー73.1::t_1.6mV， n=34) であり、 有志な差は認められなかった(Table.3)。 一方、 細胞内にパルス幅が 4定で、

強度の異なる外向きならびに内向き電流(400 -.. -800pA， Duration: 200msec， Interval : 10scc)を通電したときに得られる膜電位応答から、 線条体ニューロン膜の電流(1)と電

19

Fig. 6 Striatal neurons were injected by Neurobiotin. Recording of striatal neurons were morphologically identified as medium-spiny neurons， based on their medium sized somata and extensive dendrites laden densely with

spmes.

20

A

Naive

Fこ たとこ二

C

ロNaive

• MW

-10∞ ^-切O

四 ー ー

二ミ~一 三�

30 _mV 20

10 ー

。

ー ・10 -20

-30

B

ロ.

5∞pA

MW

じ--- �斗

一一一

一一f

1 nA

50 ms

Fig. 7 Current- Voltage relationship on neostriatal neurons of naive and MW rats

21

ハ�(V)の関係を求めた(Fig.7， Table.3)。 膜応答は内向きならびに外向きの細胞内通'42 で、 刺激電流を次第に強くしてい くと電流に比例して増大が認められた(電気緊張泡 (江)。 外l白Iき電流の通電においては、 刺激の強度を大きくすると持続の短い活動電位が発 牛した(600pA以上)。 さらに強度を強くすると反復放電が生じ、 この放電頻度は通電強 )えに依存していた。

卜V曲線は刺激電流通電終了時において測定した。 通電する刺激電流の強度が比較的小 さい範閤(400"'-'-400pA)では、 I-V曲線は直線であった。 この直線の勾配より膜抵抗を算 出すると、 記録した線条体神経細胞の膜抵抗の平均は、 対照ラット(36.8::!::1.8 MQ，

n=7)、 メタンフェタミン休薬ラット(35.7::!::1.1 MQ， n=8)であり、 有意な差は認められ なかった(Fig.7， Table.3)。

2-3. ドT質単発刺激により誘発される線条体神経細胞のシナフ。ス後電位へのメタンフェタ ミン休薬時の影響

自質単発刺激によ り誘発される線条 体神経細胞のシナプス後電位(Dep olizing postsynaptic potentiation :DPSPs)の測定をホールセル記録により行った(Fig.8， Table.3)。

静止膜電位のDPSPsの振幅は、 対照ラット(17.0::!:: 1.3mV， n=9)、 メタンフェタミン休薬 ラット(16

.3

₊ l.Omv， n=10)であり、 有意な差は認められなかった(Table.3)。 しかし ながら、 対照ラット(Fig.ふA)に比べメタンフェタミン休薬ラットにおいては、 DPSPsの 州統的な成分の増大が認められた(Fig.8・C)。 さらに、 このDPSPsの持続的な成分の増大 は、 NMDA受容体括抗薬であるCpp(10μM)の濯流適用により抑制が認められた(Fig.8- D)。

2・4. 白質高頻度刺激により誘発される線条体神経細胞のシナフス後電位へのメタンフエ タミン休薬時の影響

2-4・1. NMDA， AMPNKi nate (non-NMDA)， GABAA受容体括抗薬の影響

メタンフェタミン休薬時におけるNMDA受容体を介した皮質一線条体シナプス伝達に

22

Naive A

MW C

-74mV 一 一 一 一

Control

Control

B

Cpp

h

D

Cpp

�

100ms

Fig. 8 Postsynaptic responses evoked in neostriatal neurons from the naive (A) and MW (C) rats by single stimulation of the subcortical white matter. Application of the competitive NMOA receptor antagonist CPP (50μM) suppressed postsynaptic responses from the naive (8) and MW

(0)

_rats.

23

Table 3

Passive membrane properties and DPSPs of neostriatal neurons in naive and MW rats

Naive MW

Resting membrane potential， mV -74.9土2.0(32) ー73.1土1.6 (34)

Input resistance， M g 36.8土1.8(7) 35.7土1.1(8)

Subspike DPSPs amplitude， mv 17.0土1.3(9) 16.3土1.0(10)

Half duration DPSPs evoked by

275.4士19.9(5) 443.9土16.2(5)*事

repetitive stimulation， ms

24

ついて検討するために、 白質高頻度刺激(10 stimuli with 5 ms interspike intcrvals)により 誘発される線条体神経細胞のシナプス後電位(DPSPs)における対照ラットおよびメタン フェタミン休薬ラットの測定をホールセル記録により行った(Fig.9， Fig.l0)。 さらに、

DPSPsの膜電位依存性について検討するため、 過分極電流の通電により膜電位を変化させ た際のDPSPsについて測定した。 白質高頻度刺激は、 線条体ニューロンにおいてNMDA成 分を多く含む大きなDPSPsの誘発を引き起とした(FigふA，E)。 対照ラット(Fig.9-A)お よびメタンフェタミン休薬ラット(Fig.9-E)の線条体ニューロンにおけるDPSPsの典型例 を示した。 その結果、 DPSPsは対照ラットに比べてメタンフェタミン休薬ラットでは、 非 常に持続性のあるDPSPsの観察が認められた。 白質高頻度刺激により引き起こされる DPSPsのDecay Half Durationは、 対照ラット(274.5+ 19.9ms， n=5)、 メタンフェタミン 休薬ラット(443.9士16.25ms， n=わであり、 メタンフェタミン休薬ラットは有意にDPSPs のDecay Half Durationの増強が認められた(Table. 3)。 さらに、 このDPSPsの持続性成 分は、 対照ラットに比べてメタンフェタミン休薬ラットでは、 膜電位依存的に顕著な変化 が認められた(Fig.9・A，E )。

次に、 AMPNKainate受容体桔抗薬であるNBQXおよびGAB九久受容体括抗薬であるビク クリン(BMI)の潅流適用により、 白質高頻度刺激によるNMDA受容体を介した興奮性シ ナプス電位(NMDA-EPSPs)の測定を行った(Fig.9・B，F)。 その結果、 対照ラットに比べ メタンフェタミン休薬ラットの線条体ニューロンにおけるNMDA-EPSPsでは、 より明確 な膜電位依存的な変化が認められた(FigふB， F， Fig.l0)。 対照ラットの線条体ニューロ ンにおいて過分極電流の通電による測定の結果、 NMDA-EPSPsの振幅は膜電位に依存し て減少した(Fig.9-B， Fig. 10)。 一方、 メタンフェタミン休薬ラットの線条体二ユーロン において過分極電流の通電による測定の結果、 NMDA-EPSPsの振幅の減少は認められ な かった(Fig.9-F， Fig.l0)。 さらに、 対照ラットおよびメタンフェタミン休薬ラットの線 条体ニューロンにおけるNMDA-EPSPsはNMDA受容体措抗薬であるcppにより完全に抑制

された(Fig.9-D，H)。 加えて、 対照ラットおよびメタンフェタミン休薬ラットの線条体 ニューロンにおけるNMDA-EPSPsの膜電位依存的な影響についてFig.10に示した。 その結 果、 NMDA-EPSPsの振幅は、 -70 mV以下において有意な差が認められた。

同様に、 NMDA受容体括抗薬であるcPPおよびGABAA受容体括抗薬であるBMIの瀧流 通用により、 同質高頻度刺激によるAMPA/KA受容体を介した興奮性シナプス電位

25

*

Naive (Mg2+ free) MW (Mg2+ free) MW

Naive

司.，a・h

十十t

tt

15

10

5

(〉E)03 ---d

z-aECω色一ω色一凶

E《02z

NBQX + BMI + Mg2+ free + CPP

NBQX + BMI + Mg2+ free + CPP

H D

F

NBQX + BMI + Mg2+ free

NBQX+ BMI + Mg2+ free

C

G

NBQX+ BMI

NBQX+ BMI

B

Control

ヘ~一---

mV

-70

i�ll�

_{\一一一一~一一九一}

Control Naive

A

E mV

・70

MW

-90 -90 -110

- 70 -110 ・100 ・90 -80

Membrane potential (mV)

10mv

L 。

100ms

-110

Fig. 10 The voltage-dependency of corticostriatal NMDA-EPSPs in neostriatal slices from the naive and MW rats. NMDA-EPSPs were pharmacologically isolated by NBQX (10μM) and BMI (100μM). In slices from the naive rats， the amplitude of NMDA-EPSPs was decreased at a membrane potential more negative than -90mV. This reduction is considered to be due to be voltage- dependent Mg2+ blockade of NMDA channels because the amplitude of NMDA-EPSPs did not decrease but rather increased at hyperpolarized levels during pe付usion with a Mg2+・free solution. By contrast， the amplitude of NMDA-EPSPs did not show voltage-dependency in slices from MW rats.

The amplitude of NMDA-EPSPs in slices from MW rats was not change during perfusion with a Mg2+-free solution.

Asterisks indicate significant differences between naive and MW rat (対P<0.01;

Student'sιtest). Swords indicate significant differences between naive and Mg2+ーfree (↑P<0.05， ↑↑P<0.01; Student'sιtest) .

27 Fig. 9 Postsynaptic responses evoked in neostriatal neurons from the naive (A-D) and

MW (E-G) rats by repetitive stimulation of the subcortical white ma社er.A，E: Repetitive stimulation induced DPSPs with a long-Iasting decay phase. The intensity of the stimulus was adjusted to evoke subspike DPSPs. The decay of the DPSPs recorded from

neostriatal neurons obtained from MW rats is much slower than that from the naive rat. B，

F: NBQX (10μM) and BMI (100μM) application to the recording bath isolated NMDA­

EPSPs. The amplitude of NMDA-EPSPs showed different voltage-dependency in neostriatal slices from the naive and MW rats. C，G: Perfusion of Mg2+-free medium containing NBQX and BMI inhibited voltage-dependency of NMDA-EPSPs in slices from the naive rats. D，H: Addition of the competitive NMDA receptor antagonist CPP (50μM) totally suppressed postsynaptic responses.

26

(AMPNKA-EPSPs)の測定を行った。 対照ラットおよびメタンフェタミン休薬ラット問 の線条体ニューロンにおけるAMPAぽA-EPSPsによる膜電位依存的な変化に有意な差は必 められなかった(

Data not shown)。

2斗2. Mg2+ free条件下の影響 ^{Naive Acute}

A B c D

Control NBQX ₊ BMI Control NBQX ₊ BMI

Mg2+free条件下の影響を検討するために、 白質高頻度刺激によるNMDA受容体を介した 興奮性シナプス電位(NMDA-EPSPs)の測定をMg2+free条件下で行った(Fig.9-C，G，

Fig.l0)。 対照ラットの線条体ニューロンにおいて過分極電流の通電による測定の結果、

NMDA-EPSPsの振幅は減少した(Fig.9・F， Fig. 10)。 一方、 Mg2+ 仕ee条件下において は、 NMDA-EPSPsの振幅の減少は有意に回復した(Fig.9・C， Fig.10)。 このNMDA-EPSPs の娠中国は、 -90mV以下においてNMDA-EPSPsは対照群に比べ有意な差が認められた。 さら に、 メタンフェタミン休薬ラットにおいても同様にMg2+free条件下におけるNMDA-EPSPs の影響を検討した。 メタンフェタミン休薬ラットの線条体ニューロンにおいて過分極電流 の通電による測定の結果、 NMDA-EPSPsに変化は認められなかった(Fig.9・G， Fig. 10)。

mV -70 -90 -110

1d E

11

mV -70

vooo

mJan

F 7d G H

Control NBQX ₊ BMI Control NBQX ₊ BMI

-

; �� �二世二二二

^.

^1:

2・5. 高頻度刺激により誘発されるNMDA受容体を介したシナフス後電位へのメタンフエ タミン休薬期間の影響

叩mV

L

第 -市において、 メタンフェタミン誘発行動逆耐性の発現には、 ある一定の休薬期間が 必要であることを明らかとした。 さらに、 メタンフェタミン休薬期間中には、 NMDA受 存体機能の允進が誘発しているととが認められた。 そこで、 メタンフェタミン誘発行動逆 耐性の発現の休薬期間におけるNMDA受容体機能の影響について、 AMPA尽A受容体桔抗 薬であるNBQXおよびGABAA受容体桔抗薬であるBMIの潅流適用により、 白質高頻度刺 激によるNMDA受存体を介した興奮性シナプス電位(NMDA-EPSPs)の測定をホールセ ル記録により行った(Fig.11， Fig.12)。 さらに、 NMDA-EPSPsの膜電位依存性について検 討するため、 過分極電流の通電により膜電位を変化させた。 実験スケジュールは、 第三章 1-10に従って、 SC.1(メタンフェタミン急性効果)、 SC.2(メタンフェタミン休薬1日)、

SC.3 (メタンフェタミン休薬7日)で行った。

Fig. 11 Postsynaptic responses evoked in neostriatal neurons from the naive (A-B) ， acute (C・0)， 1 d (E-F) and 7d (G-H) rats by repetitive stimulation of the subcortical white matter. A，C，E，G: Repetitive stimulation induced DPSPs with a long-Iasting decay phase. The intensity of the stimulus was adjusted to evoke subspike DPSPs. The decay of the DPSPs recorded from neostriatal neurons obtained from 7d rats is much slower than that from the naive， acute and 1 d rat. NBQX (10μM) and BMI (100μM) application to the recording bath isolated NMDA-EPSPs. The amplitude of NMDA-EPSPs showed d iffe re nt vo Itag e圃dependency in neostriatal slices from the 7d rats.

28 29

Fig. 12 Relative peak amplitude of corticostriatal NMDA-EPSPs in slices from rats after an acute treatment with methamphetamine (Acute)， a chronic treatment with methamphethamine for 6 days followed by withdrawal for a day (1 d)， and a chronic treatment with methamphetamine for 6 days followed by withdrawal for 7 days(7d).

NBQX (10μM) and BMI (100μM) were used to isolate NMDA-EPSPs induced by repetitive cortical white ma社er stimulation. The intensity of the stimulus was adjusted to evoke subspike EPSPs in the neurons at the resting membrane potential. To assess the degree of Mg2+ blockade， the peak amplitude of NMDA­

EPSPs was measured at the membrane potential of -110 mV. The mean amplitude of NMDA-EPSPs recorded from slices from rats which received an acute treatment with methamphetamine and a chronic treatment with methamphetamine for 6 days followed by withdrawal for one day were similar to that observed in the naive rats.

By contrast， the mean peak amplitudes of NMDA-EPSPs in slices from rats after a chronic treatment with methamphetamine for 6 days followed by withdrawal for 7 days was significantly larger than that of the naive rats (対P<0.01 as compared with control

(C) ;

Student'sιtest) .

(〉ε

対照ラットの線条体ニューロンにおいて膜電位を過分極側に設定した際、 SC.l、 SC.2、

SC.3 のいずれのスケジュールにおいてもNMDA-EPSPsの振幅 は減少した(Fig.11，

Fig.12)。 一方、 メタンフェタミン休薬ラット(メタンフェタミン休薬7日)の線条体 ニューロンにおいて過分極電流の通電により膜電位を変化させた際は、 NMDA-EPSPsの 振幅の減少は認められなかった(Fig.9・F， Fig. l1-H， Fig.12)。 しかしながら、 SC.1(メタ ンフェタミン急性効果)、 SC.2(メタンフェタミン休薬1日)について同様に検討を行っ たが、 いずれのスケジュールにおいても膜電位依存的なNMDA占PSPsの振幅の減少が認 められ、 対照群と有意な差は認められなかった(Fig.11， Fig.12)。

、『圃'" 16

第二章第一節ではメタンフェタミン誘発行動逆耐性の形成期間にNMDA受容体機能の JC進が引き起こされているかを電気生理学的手法を用いて検討した。 始めに、 メタンフエ タミン休薬ラット(休薬7日)と対照ラットにおける線条体神経細胞(中型有線細胞:

Medium Spiny Neuron)の膜特性の相違を追究した。 この中型有東京細胞の静止膜電位なら びに膜抵抗は2群聞において有意な差は認められなかった。 次に、 白質単発刺激により誘 允される線条体神経細胞のシナプス後電位(DPSPs)へのメタンフェタミン休薬時の影響 についてホールセル記録により検討した。 静止膜電位におけるメタンフェタミン休薬ラッ トと対照ラットのDPSPsの振幅には有意な差は認められなかったが、 対照ラットに比べメ タンフヱタミン休薬ラットではDPSPsの持続性成分(NMDA成分)の増大が認められた。

通常、 線条体ニューロンの皮質一線条体のグルタミン酸の投射は、 主にAMPNKA受容 体により調節されており、 NMDA受容体、 代謝型グルタミン酸受容体の関与は非常に小

。司コzaE《弘一ω弘一凶

12

8 3. 考察

《OEZω〉

4

wmw-ω匡

。 C MW

1d

さいことが報告されている(Heπing， 1985; Cherubini et al.， 1988; Jiang & North， 1991; Kita，

1996)。 そのため、 白質単発刺激では、 通常NMDA受容体機能の先進は認められな い。

しかしながら、 メタンフェタミン休薬ラットでは、 NMDA受容体機能の八;進が引き起こ されていることが明らかとなった。 そこで、 次に、 白質高頻度刺激(1() stimuli ^with 5 ms intcrspikc intervals)により誘発されるDPSPsへのメタンフェタミン休薬時の影響について 検討した。 白質高頻度刺激は、 十分に細胞膜の脱分極を引き起とし、 膜脱分極時における 細胞外K+濃度の上昇、 さらにはGABA受容体が調節するシナプス抑制効果を増強による

30 31

細胞外K+濃度の上昇など複雑なメカニズムによりNMDA受容体の反応性を高めることが これまで報告されている(Ki同， 1996: McCarren _& Alger.， 1985)。 そこで、 白質高頻度刺 激により引き起こされるDPSPs'こついて比較検討した。 Half Decay Durationの結果からも メタンフヱタミン休薬ラットでは対照ラットに比べ白質高頻度刺激により引き起こされる DPSPsの持続性成分の有意な増大が認められた。 記録したDPSPsはAMPA/KA受容体桔抗 薬NBQXおよびGAGAA受容体括抗薬BMIの瀧流適用によりNMDA成分のみを単離し、 さ らには、 Mg2+-free条件下によりメタンフェタミン休薬ラットと対照ラットを比較検討し た。 その結果、 メタンフェタミン休薬ラットにおいてはNMDA受容体機能の克進が認、め

られ、 このNMDA受容体機能の八;進は電位依存性Mg2+閉塞の解除による可能性が考えら れる。 これまでにNMDAチャンネルのMg2+閉塞の解除は、 様々な条件により多くの脳部 位において検討されている(Kato _& Yoshimura， 1993: Mitani et a1.， 1998: Hori _& Carpenter.，

1994: Zhang et a1.， 1996: Furukawa et al.， 2000)。 これらの報告を参考にして本研究において もVoltage-Clamp法の解析を試みたが、 白質単発刺激に応じるNMDA電流は非常に小さ く、 その解析は困難であるため、 本研究ではCurrent-Clamp法によりより詳細な解析を 行った。 また、 メタンフヱタミン休薬ラットにおける電位依存性Mg2+閉塞の解除は、 ・70

"'-'-80 m VにおいてDriving Forceに従っておらず、 電位依存性Mg2+閉塞の解除以外の可能性 についても考えられる。

さらに、 本節ではメタンフェタミン誘発行動逆耐性の発現における休薬期間の影響につ いて検討した。 その結果、 メタンフェタミン休薬7日においてNMDA受容体機能の允進が 認められるが、 メタンフェタミン急性効果、 メタンフェタミン休薬1日においてはNMDA 受容体機能に変化は認められなかった。 との結果は、 第一章における行動薬理学的検討に よるメタンフェタミン誘発行動逆耐性の発現に関する休薬期間の影響との相関性が認めら れた。 アンフェタミン行動逆耐性は、 NMDA受容体桔抗薬であるMK・801の投与により抑 制される(Karler et a1.， 1989， 1991; Ohmori et a1.， 1994， 1996)などの報告、 さらには第二章 第一節の結果から考えると、 メタンフェタミン誘発行動逆耐性の発現には、 メタンフェタ ミン反復投与後、 休薬期間におけるNMDA受容体機能の元進が関与している可能性が明 らかとなった。

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第二節 NMDA受容体サブユニットの組換えの影響

第三章第一節において、 メタンフェタミン誘発行動逆耐性発現のメカニズムとして、 メ タンフェタミン反復投与後、 休薬期間にNMDA受容体機能の元進が引き起こされている

ことを明らかとした。 さらに、 このNMDA受容体機能の允進は電位依存性Mg 2+閉塞の解 除による可能性が考えられる。

NMDA受容体は、 異種多重結合チャンネルであり、 NRl、 NR2A-D、 NR3Aの6種類のサ ブユニットから成っている。 NMDA受容体は、 通常、 線条体ニューロンにおいてはNRl­

NR2A、 NR1-NR2Bの複合体として存在している(Wenzel et a1.， 1997， landwehmeyer et a1.，

1995)

0

Mitani et a1. (1998)は橋核(Pontine nucleus)の発達には、 NMDAチャンネルの 電位依存性Mg 2+閉塞の解除の際、 NMDA受容体サブユニットNR1・NR2Cの発現の増大が

認められることを報告している。 この報告は、 メタンフェタミン誘発行動逆耐性発現のメ カニズムとして考えているNMDA受容体機能の克進は、 NMDA受容体サブユニットの組 み換えにより引き起こされている可能性が考えられる(Fig. 13)。

そこで本節では、 メタンフェタミン休薬ラットにおける線条体NR2Cレベルの発現につ いてWestern immunoblot法を用いて検討した。

1. 実験材料および実験方法

1・1. 実験動物ならびに飼育方法

実験動物ならびに飼育方法は第一章1-1と同様に行った。

1-2. 使用薬物ならびに実験スケジュール

使用薬物ならびに実験スケジュールは第二章1・10と同様に行った。

1-3. SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびイムノプロット(ウエ

スタンブロッテイング)

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SDS-PAGEおよびイムノフロットはNakanishi et al. (1997a)に従って行った。

メタンフヱタミン休薬ラット(n=3)および対照ラット(n=3)はペントバルビタールナ

トリウム麻酔を行い、 生理食塩水により瀧流し、 頭頂部を関頭して脳組織を損傷しないよ うに脳を摘出した。 摘出した脳は、 小脳、 線条イ本を単離し、 試料とした。 試料は0.1%

Triton X -1 00含有PBSを加えて溶解させ、 さらにソニケーションを行った後に超遠心

(15000Xg、 30分間)により不可溶成分を取り除き、 細胞抽出液を試料溶液として得た。

試料溶液のそれぞれタンパク30陀を7.5% SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS­

PAGE)を行った。 試料溶液は、 電気泳動前に可溶化緩衝液(4%SDS、 10%ショ糖、

lOmM Tris-HCl pH8.0、 O.lmM EDTA )中で、 メルカプトエタノール存在下で、 1000C、 3 分間煮沸した。 泳動用緩衝液は、 Tris-glycine緩衝液(pH 8

.9)を用いた。

SDS-PAGE後、 イムノブロッティングを行った。 SDS-PAGEにより分離したタンパクを ニトロセルロース膜に転写した後、 スキムミルクでブロッキングを行った。 TBSで洗浄し た後、 ー次抗体(抗ラビットNR2Cポリクロナール抗体(200μglml) : Chemicon

lnternational， Temecula， CA)を40Cで1晩反応させた。 0.1% Tween 20含有TBS(ITBS)で十 分洗浄した後、 ビオチン化二次抗体(ビオチン化抗ラビットIgG)を40Cで2時間反応させ た。 ITBSで十分洗浄した後、 0.5% horseradish-peroxidase-avidin Dを40Cで2時間反応させ た。廿BSで十分洗浄した後、 enhanced chemiluminescence (ECL)法により可視化した。

暗室にてこト口セルロース膜に検出液(Amersham ECL detection reagent)をまんべんなく かけて発光させ、 それをX線フィルム(Kodak， X-ray Omat film)に30・60秒露光させた後、

現像液(フジフィルム、 レンドール)に90秒間反応させ、 停止液(レンフィックス)でそ れぞれ2・3分間処理した後に、 水道水による十分な水洗、 乾燥を行った。

1・3. 実験装置

電気泳動装置には、 BIO-RADのPOWER/PACl 000を使用し、 転写には、 BIO-RADの T孔t\NS-BLOT SD SEMI-DRY TRANSFER CELLを使用した。

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2. ^実験成^績

2・1. NMDA受容体サブユニットの検討

2-2-1. NR2Cサブユニットの発現

メタンフヱタミン休薬ラットの線条体において、 NR2Cサブユニットの発現の増大によ る電位依存性Mg2+閉塞の解除が引き起こされている可能性についてWestern immunoblot法 を用いて検討した(Fig. 14)⁰ Fig.14は対照ラットおよびメタンフェタミン休薬ラットか

ら採取した小脳および線条体のNR2Cレベルの発現を検討した。 小脳から採取したサンプ ルは、 NR2Cに対応する135KDaの分子量にバンドが発現していた。 一方、 対照ラットおよ びメタンフェタミン休薬ラットの線条体から採取したサンプルは、 NR2Cに対応する 135KDaのの分子量にわずかにバンドが発現していたが、 2群聞にその差は認められなかっ た(Fig.14)。

3. 考察

第て節では、 メタンフェタミン反復投与後、 休薬期間におけるNMDA受容体機能の冗 進の原閃として、 NMDA受容体NR2Cサブユニットの発現増大による電位依存性Mg2+閉塞 の解除の可能性について、 NR2Cサブユニットの発現レベルを指標にWestern immunoblot 法を用いて検討した。 その結果、 小脳では、 NR2Cに対応する135KDaの分子量のバンドの 発現が認められた。 しかしながら、 対照ラットおよびメタンフェタミン休薬ラットの線条 体では、 NR2Cに対応する135KDaの分子量のバンドがわずかに発現していたが、 影響は認

められなかった。 この結果は、 メタンフェタミン反復投与後、 休薬期間に電位依存性 Mg2+閉塞の解除によるNMDA受容体機能の充進の可能性として、 NMDA受容体サブユ ニットの組み換えは引き起こされていないことが明らかとなった。

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NR2A NR2B

NR2C NR2D

Mg2+ blockade Reduction of Mg2+ blockade

+ +

+ +

+ +

Fig. 13 Recombination of NMDA receptor subunit

Neostriatum

Cerebellum Naive MW kDa

NR2C ... ー絹綿掛;ヂ:苦情糊鎖線蛸朔機勝! 一 .:.:.:..:.:.: - 135

Fig. 14 Immunoblots from SOS.ゃolyacrylamide gel electrophoresis developed with antibody specific for NR2C. Contents of lanes are as follows: cerebellum extract from naive rat (Crebellum); Neostriatum extract from the naive rats (Naive Neostriatum); Neostriatum extract from MW rats

(MW

Neostriatum). The molecular weights calculated from standard proteins of markers is shown on the right.

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第う節 cAMP依存性Protein kinase (Protein kinase A)ならびにProtein kinase Cによるリン酸 化の影響

第一章、 第二章第一節、 第二節より、 メタンフヱタミン誘発行動逆耐性発現のメカニズ ムとして、 メタンフェタミン反復投与後、 休薬期間にNMDA受容体機能の充進が引き起 こされていることを明らかとした。 さらに、 NMDA受容体機能の允進は電位依存性Mg2+

閉塞の解除の可能性が考えられる。 第二章第二節では、 電位依存性Mg2+閉塞の解除の可 能性の一つであるNMDA受容体サブユニットの組み換えについて検討したが、 その影響 は認められなかった。 これまでにNMDAチャンネルのMg2+閉塞の解除は、 様々な条件に より多くの脳部位において検討されている(Kato & Yoshimura， 1993: Mitani et al.， 1998:

Hori

&

Carpenter.， 1994: Zhang et al.， 1996: Furukawa et al.， 2000)

0

Zhang et al. (1996)は、

虚血後の皮質培養細胞におけるNMDA反応のMg2+閉塞の解除は、 Protein

Kinase

C (PKC)の阻害薬、 Calphostin Cの前処置により回復することを報告している。 また、

NMDA受容体の卵母細胞に発現しているNR1-NR2A、 NR1-NR2Bの複合体は、 PKCの活性 化に関して感受性を持つ(Kutsuwada et al.， 1 992: Meguro et al.， 1992)。 さらに、 NMDA受 容体サブユニットのPKCによるリン酸化は、 NMDA受容体チャンネルのMg2+閉塞の解除 を引き起こす(Chen & Huang， 1992: Greengard et al.， 1999)。 一方、 cAMP依存性Protein Kinase (PKA)は、 線条体mRNAを注入した卵母細胞において、 DARPP-32を介して NMDA電流を増大させること(Blank et al.， 1997)が報告されており、 PKAおよびPKCの 活性化の増大が線条体におけるNMDA受容体を介したMg2+閉塞の解除を引き起こすこと が与えられる。 そとで、 本節では、 メタンフェタミン休薬ラットにおける電位依存性 Mg2+閉塞の解除の可能性のーっとして、 PKAおよびPKCのリン酸化の影響について検討 した(Fig.15)。

1 実験材料および実験方法

1-1. 実験動物ならびに飼育方法

実験動物ならびに飼育方法は、 第一章1・1と同様に行った。

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