九州大学学術情報リポジトリ

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Kyushu University Institutional Repository

非臨床データを用いたヒトの代謝クリアランス及び分布容積の予測精度の検証と改良

八幡, 昌寛

https://doi.org/10.15017/4060098

出版情報：九州大学, 2019, 博士（創薬科学）, 課程博士バージョン：

権利関係：

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博士論文

非臨床データを用いたヒトの代謝クリアランス及び分布容積の予測精度の検証と改良

令和 2 年 2 月

八幡　昌寛

九州大学大学院　薬学府　創薬科学専攻

細胞生物薬学分野

(3)

2 目次

序論 ... 7

第1章 DSP‐0565 のin vitro-in vivo extrapolation (IVIVE) 法を用いたヒト代謝 clearance (CL) の予測精度検証 ... 12

1-1 概要 ... 12

1-2 各種肝細胞におけるDSP-0565の代謝物の同定 ... 14

1-3 DSP-0565のラット及びイヌpharmacokinetics (PK) ... 17

1-4 DSP-0565のラット及びイヌにおける排泄率及び排泄物中の代謝物の同定 ... 20

1-5 DSP-0565 のラット及びイヌの代謝経路の寄与率と肝固有 CL の in vitro-in vivo correlation (IVIVC) ... 31

1-6 第一相臨床試験 ... 33

1-7 ヒト代謝CLの予測精度の検証 ... 34

1-8 考察 ... 36

第2章 Øie-Tozer model のヒト volume of distribution (V1、Vdss及び Vdβ) の予測適応性 39 2-1 概要 ... 39

2-2 モデル化合物のラット、イヌ及びサルPK ... 43

2-3 ヒトV1、Vdss及びVdβの予測精度の検証 ... 46

2-4 ヒトにおける血漿中濃度推移、PKパラメータの予測精度の検証 ... 70

2-5 考察 ... 80

総括 ... 85

実験方法 ... 87

(4)

3 引用文献 ... 119 Appendices ... 130 謝辞 ... 144

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4 略語：

本論文では以下の略語・略号を用いた。

ALK anaplastic lymphoma kinase

AO aldehyde oxidase

AUC area under the plasma concentration-time curve

AUC0-inf area under the plasma concentration-time curve extrapolated to infinity BChE Butyrylcholinesterase

BTK Bruton's tyrosine kinase

C0 extrapolated plasma concentration at t = 0 CES Carboxylesterase

CL Clearance

CL/F oral clearance CLh hepatic clearance

CLint,in vitro in vitro intrinsic clearance CLint,in vivo in vivo intrinsic clearance

CLiv systemic plasma clearance after intravenous administration CLr renal clearance

Cmax maximal plasma concentration

DN dispersion number

F Bioavailability

Fa fraction absorbed Fh hepatic availability

(6)

5 fup unbound fraction in plasma

fut unbound fraction in tissues

fut1 unbound fraction in tissues belonging to V1

fut2 unbound fraction in tissues belonging to V2

IVIVC in vitro-in vivo correlation IVIVE in vitro-in vivo extrapolation kel elimination rate constant M8-GA M8-glucuronide

MRT mean residence time P450 cytochrome P450

PK pharmacokinetic

PON Paraoxonase

Qh hepatic blood flow Rb blood to plasma ratio

Re/i ratio of binding protein in extracellular fluid to that in plasma SA simple allometry

SFtotal scaling factor (in vivo intrinsic clearance/in vitro intrinsic clearance)

SFhydrolysis SF for the hydrolysis pathway

SFoxidation SF for the oxidation pathway

t1/2 half-life

Tmax time to maximal plasma concentration UGT UDP glucuronosyltransferase

V1 volume of distribution in the central compartment

(7)

6 V2 volume of distribution in the peripheral compartment

Vd volume of distribution

Vdss volume of distribution at steady state Vdβ volume of distribution at beta phase Ve extracellular fluid volume

Vp plasma volume

Vr remaining fluid volume Vr1 remaining fluid volume in V1

Vr2 remaining fluid volume in V2

(8)

7 序論

医薬品開発の成功確率の低迷及び開発コストの増加は製薬業界にとって大きな課題となっている。このため、非臨床段階から臨床試験の成功確度を見極め、効率的に医薬品開発を促進することが重要である。非臨床段階における開発候補化合物のヒトpharmacokinetic (PK) 予測は、候補化合物のPKパラメータの最適化及び選抜、臨床有効用量及び投与回数の推定、

さらには臨床における安全域の推定、に重要な位置づけであり、臨床試験の成功確度の評価や臨床試験計画を立案するための一助となり得る。ヒト PK 予測には、clearance (CL) や

volume of distribution (Vd) 等のPKパラメータを予測することが必要であり、予測した各種

PK パラメータを用いることで、bioavailability (F)、half-life (t1/2)、area under the plasma concentration-time curve (AUC)、maximal plasma concentration (Cmax) 等のパラメータ及び血漿中濃度推移を予測することが可能となる。

PKパラメータの中で CLの予測は、効率的に医薬品開発を促進する上で最も重要である

(Di et al., 2013)。中でもCLにおける代謝の種差はPKの種差に繋がる主要な原因の一つで

あり、代謝CLを精度よく予測することがヒトPKを予測する上で重要となる。CLの予測方法は、大きく分類するとアロメトリーに基づく方法とin vitro-in vivo extrapolation (IVIVE) 法の2種類の方法が報告されている。アロメトリー式を用いた予測は、経験則に基づき動物の体重とCLからヒトのCLを外挿する方法であり、代謝に種差がある化合物では用いることはできない (Tang et al., 2006)。一方、IVIVE法は、ヒト肝ミクロゾーム、肝S9などの細胞画分や肝細胞など、ヒトの生体試料を用いてin vivoの代謝CLを予測する方法であり、代謝に種差がある化合物に対しても有効な予測方法の一つである。これまでに cytochrome P450 (P450)、UDP glucuronosyltransferase (UGT)、aldehyde oxidase (AO) などの代謝酵素で主に代謝される化合物について、IVIVE法が有用であることが多数報告されている (Akabane

(9)

8 et al., 2012; McGinnity et al., 2004; Obach et al., 1997)。しかしながら、加水分解酵素に関して

はIVIVE法を用いた予測精度に関する報告は限定的である。加水分解酵素は、2002年の調

査において、米国でよく使用される医薬品200 種の中で 10%の医薬品の代謝に関与することが報告されており、医薬品の代謝に重要な役割を担っている (Williams et al., 2004)。これまでに butyrylcholinesterase (BChE; EC 3.1.1.8)、carboxylesterase (CESs; EC 3.1.1.1)及び

paraoxonase (PON; EC 3.1.1.2) などの複数の加水分解酵素がエステル、アミド及びチオエス

テル結合の加水分解を触媒することが報告されている (Fukami and Yokoi, 2012; Hosokawa,

2008)。これらの加水分解酵素は、代謝酵素が主に発現している肝臓のみならず、肝臓外の

組織や血漿においても発現している。例えば、血漿中にはBChE、CESs及びPONなどの加水分解酵素が存在することが確認されている (Bahar et al., 2012)。また、その発現部位には種差が認められおり、例えば、CES1 はヒトやイヌの血漿中には見出されないのに対して、

ラットの血漿中には主に肝臓で合成され分泌されたものが存在しており (Bahar et al., 2012;

Yan B et al., 1995)、CES2はヒトやラットの小腸に発現しているのに対して、イヌの小腸に

は発現していない (Taketani et al., 2007)。これらの加水分解酵素の発現部位の特性や種差により、加水分解酵素が関与する代謝評価は非常に複雑となる。加水分解酵素の基質となり得る構造的な特徴の中でアミド結合が加水分解される場合、代謝の種差が大きいことがN‐aryl isoxazolecarboxamide anticonvulsants、flumatinib、Bruton's tyrosine kinase (BTK) inhibitor及び anaplastic lymphoma kinase (ALK) inhibitorsなどの複数の化合物で報告されており、そのヒト PK 予測精度が医薬品開発の成功確度の判断に大きく影響する可能性がある (Gong et al., 2010; Liu et al., 2011; Martin et al., 1997; Teffera et al., 2013)。これまでの報告として、BTK

inhibitor及びALK inhibitorについて、IVIVE法によるヒトのCL予測が検討されているが、

ヒトの血漿中濃度が得られておらず、予測精度の検証に至っていない (Liu et al., 2011;

Teffera et al., 2013)。このため、アミド結合の加水分解に関する予測方法の確立が必要である。

(10)

9 臨床における投与間隔を推定するためにt1/2は重要なパラメータである。t1/2はCLとVd から構成され、CLと定常状態におけるVd (Vdss) の予測値から、以下の式によりt1/2を予測することが可能であり、その予測精度に関して、複数の報告がある (Boxenbaum et al., 1982;

Obach et al., 1997; Hosea et al., 2009)。

t1/2 = ln 2 × Vdss/CL

また、予測したCL及びVdssを1-compartment modelに組み込むことで、血漿中濃度推移やPKパラメータ (Cmaxや最低血漿中薬物濃度など) をシミュレーションすることが可能となる (Yamazaki et al., 2011; Jones et al., 2011)。さらに、薬効薬理試験やin vitro 活性評価などから得られた有効濃度とヒトPK予測結果から臨床有効用量を推定し、毒性試験や安全性薬理試験から得られた無毒性量との関係から安全域を推定することが可能となり得る。

上述の通り、VdはヒトPK予測において重要なパラメータの一つである。Vdには複数の種類がある。例えば、中心コンパートメントにおけるVd (V1)、抹消コンパートメントにおけるVd (V2)、定常状態におけるVd (Vdss)、β相におけるVd (Vdβ) などの種類がある。一般的には、VdssがヒトPK予測に用いられ、proportionality (Obach et al., 1997)、simple allometry (SA) (Boxenbaum et al., 1982) 及びØie-Tozer model (Øie and Tozer, 1979; Obach et al., 1997) などの複数の予測方法が報告されている (Table 1)。Proportionalityは、動物とヒトのVdが等しいと仮定し、動物のVdをヒトのVdとして用いる方法である。SAは、アロメトリー式を用いて、経験則に基づき動物の体重とVdからヒトのVdを外挿する方法である。Øie-Tozer

model は、Vdssを生理学に基づき血液、細胞間液、組織実質細胞に分けて表す数式であり、

生理学的パラメータ (Vp、Re/i、Ve及びVr) 及び薬物に依存するパラメータ (fup及びfut) から構成される (Table 1)。Vdssを予測する際には、in vitro実験で評価した血清中蛋白非結合型分率 (fup)、動物実験から得られた動物のVdss及び生理学的パラメータから組織中非結合

(11)

10 型分率 (fut) を Øie-Tozer model に基づき算出する。次に、futは動物とヒトで等しいと仮定し、動物のfut、ヒトのfup及び生理学的パラメータから、Øie-Tozer modelに基づきヒトのVdss

を予測する。

Table 1 Prediction methods of human Vdss

Methods Equation

Proportionality Hunman Vdss = animal Vdss

SA Vdss = a × body weight^b

Øie-Tozer Vdss = Vp × (1 + Re/i) + fup × Vp × (Ve/Vp − Re/i) + Vr × fup/fut

a, coefficient value; b, an exponent; fup, unbound fraction in plasma; fut, unbound fraction in tissues;

Ve, the extracellular fluid volume; Vp, the plasma volume; Vr, the remaining fluid volume; Re/i, the ratio of binding protein in extracellular fluid to that in plasma; SA, simple allometory

これらの予測方法の中でØie-Tozer modelは、最も予測精度が高いことが報告されている (Berry et al., 2011; Lombardo et al., 2013; Zou et al., 2012)。

このようにヒトの Vdss の予測方法は既に確立されているが、予測した Vdss を 1-

compartment modelに組み込み、血漿中濃度推移を予測する場合、二相性の消失を示す化合

物については適用することができない。例えば、2-compartment modelにおけるVdssとV1は Vdss > V1の関係にあるため、仮にV1の代わりにVdssを1-compartment modelに組み込みCmax

を予測するとCmaxは過小評価され、臨床でのCmaxに依存する毒性が過小に推定される。Cmax

に依存する毒性の例としては、hERGチャネルを遮断することで心電図のQT延長作用を示

すcisaprideなどの心毒性が挙げられる (Redfern et al., 2003)。安全性の確保に重点をおいた

医薬品の研究開発を推進する上では Cmaxの過小評価は可能な限り避けるべきである。2-

(12)

11 Compartment modelを用いたヒトPK予測を行うためには、Vdssに加えて、V1及びVdβを予測する必要がある。アロメトリー式を用いてV1、Vdss及びVdβを予測し、予測したVdを2-

Compartment model に組み込みヒトの血漿中濃度推移を予測検証した報告は複数あるが

(Mordentira., 1985; Matsushita et al., 1990; Mahmood and Goteti, 2012)、Vdssの予測精度が高いことが確認されているØie-Tozer modelはそれらの報告では検証されおらず、また評価化合物数も限られることから、二相性の消失を示す化合物の予測方法のさらなる検証と確立が必要である。

本研究では、非臨床データからヒトPKを予測する上で課題となる、アミド結合の加水分解により代謝される化合物のCL 予測、二相性で消失する化合物の血漿中濃度推移の予測、

に着目し、予測方法の適応性の検証と改良を目的とした。アミド結合の加水分解により代謝されるモデル化合物として、抗てんかん薬の開発候補化合物である DSP‐0565 [2‐(2′‐

fluorobiphenyl‐2‐yl)acetamide] (Fig. 1) を用いて、in vitro代謝実験及びin vivo薬物動態実験による代謝種差を比較し、さらにIVIVE法によるヒトのCL予測精度を検証した。また、Øie-

Tozer modelがVdssに加えてV1及びVdβへの予測、さらに二相性の消失を示す化合物の血漿

中濃度推移及びPKパラメータの予測に対して、適応可能であるかを検証した。

F

NH₂ O

Fig. 1 Chemical structure of DSP‐0565

(13)

12 第1 章 DSP‐0565 のin vitro-in vivo extrapolation (IVIVE) 法を用いたヒト代謝clearance (

CL)

^{の予測精度検証}

1-1 概要

序論で述べた通り、非臨床データからヒトの代謝CLを精度高く予測することは、開発成功確度の向上に繋がる重要な要素の一つである。これまでにP450などの主要な酵素を介した代謝CLの予測方法は多くの検証がなされているが、加水分解酵素を介した代謝については十分な知見がないのが現状である。加水分解反応の中でアミド結合が加水分解される化合物では、顕著な代謝種差が認められる事例が複数報告されており、その代謝CLの予測方法の確立が期待される。しかし、アミド結合の加水分解を介して代謝される化合物の予測精度を検証した報告はなく予測精度が全く不明であるため、既知の方法で予測した結果を意思決定や臨床試験計画の立案に役立てることが非常に困難である。

DSP-0565は抗てんかん薬の候補化合物として、大日本住友製薬で創製された化合物であ

り、アミド結合を有する (Fig. 1)。また、DSP-0565は第一相臨床試験が既に実施されており、

ヒトにおけるPKの実測値が得られている。さらに、DSP-0565 は、ヒトにおいてアミド結合の加水分解を介して代謝されることが確認されている。そこで、DSP-0565をモデル化合物として、IVIVE法を用いたヒトの代謝CL予測精度を検証した。

本研究では、DSP-0565の代謝経路がヒトと動物間で顕著に異なることを示した。すなわち、ヒト肝細胞においてDSP-0565は主にアミド結合の加水分解を介して代謝されるのに対して、ラット及びイヌではアミド結合の加水分解に加えて、ベンゼン環及びベンジル位の水酸化を受けることが明らかとなった。また、ラット及びイヌでの DSP-0565 の代謝経路は、

in vivo では水酸化経路の割合が最も高く (57–62%)、次に加水分解経路の割合が高かった

(23–33%) のに対して、肝細胞では加水分解経路の割合が高く (55–71%)、次に水酸化経路の

割合が高かった (11–15%)。次に、DSP-0565のヒトでのoral clearance (CL/F) をヒト肝細胞

(14)

13 から算出した肝固有クリアランス (CLint,in vitro) から、(方法1) 補正なしでCLint,in vitroを用いる方法、(方法2) 動物のscaling factor (SFtotal, in vivo intrinsic clearance/in vitro intrinsic clearance)

を用いてCLint,in vitroを補正する方法、 (方法3) 動物の加水分解経路のscaling factor (SFhydrolysis)

を用いてCLint,in vitroを補正する方法、を用いて予測精度を検証した。これらの三つの方法の

中で動物のSFhydrolysisを用いてCLint,in vitroを補正する方法が最も良好な予測性を示した。以上のことから、ヒトで認められる代謝経路に相当するscaling factorのみを予測に用いることで動物特有の代謝経路の影響が取り除かれ、予測精度が向上する可能性が示唆された。本研究

では、DSP-0565をモデル化合物としてIVIVE法によるアミド結合の加水分解を介した代謝

CLの予測精度を検証し、IVIVE法が有用であることを示した。また、ヒトと動物間の代謝経路の種差を理解することが動物のscaling factorを用いたヒトの代謝CL予測の際に重要であるという知見を得ることができた (Yahata et al, 2019）。

(15)

14 1-2 各種肝細胞におけるDSP-0565の代謝物の同定

代謝物を網羅的に定量分析するために放射線標識した[¹⁴C]DSP-0565 を検討に用いた。構

造式をFig. 1に示した。[¹⁴C]DSP-0565をヒト肝細胞とインキュベーションした結果、初発

代謝物としてアミド結合の加水分解を受けて生成した M8 が検出された (Table 2)。ラット及びイヌ肝細胞では、初発代謝物として、ヒトと同様にM8が検出されたのに加えて、ベンゼン環が水酸化を受けた代謝物 (ラット：M1及びM3、イヌ：M1、M2及びM3) 及びベンジル位が水酸化を受けた代謝物 (M7) が検出された。M8は、ラット、イヌ及びヒト肝細胞に共通して主要代謝物であった。二次代謝物としては、カルボン酸がグルクロン酸抱合を受

けた M8-glucuronide (M8-GA) が全ての種で認められたのに対し、M8 のベンゼン環が水酸

化を受けた代謝物 (M10(3OH)、M10(4OH) 及びM10(5OH)) はヒト肝細胞でのみ認められた

(Table 2)。DSP-0565の代謝経路は、未変化体が加水分解を受けてさらにグルクロン酸抱合あ

るいは水酸化される代謝経路、また未変化体が水酸化される代謝経路が存在することが示

唆された (Fig. 2)。また、ヒトと動物間で代謝経路に顕著な差があることが明らかとなった。

(16)

15 Table 2 Percentages of the main components detected after incubation of [¹⁴C]DSP-0565 at 10 μM with hepatocytes (1 × 10⁶cells/mL) obtained from rat, dog, and human for 4 h

Component Rat Dog Human

% of peaks

M1 0.14 (0.17, 0.11) 1.10 (1.08, 1.12) N.D.

M2 N.D. 0.16 (0.18, 0.14) N.D.

M3 0.31 (0.33, 0.28) 0.17 (0.18, 0.16) N.D.

M7 1.41 (1.45, 1.36) 3.62 (3.56, 3.67) N.D.

M8 6.74 (6.66, 6.81) 21.74 (22.85, 20.62) 25.65 (26.67, 24.63) M8GA 2.10 (2.18, 2.01) 3.62 (3.80, 3.43) 9.51 (9.56, 9.45)

M10(3OH) N.D. N.D. 1.08 (1.08, 1.08)

M10(4OH) N.D. N.D. 0.31 (0.33, 0.28)

M10(5OH) N.D. N.D. 0.71 (0.69, 0.72)

DSP-0565 87.62 (87.47, 87.77) 53.55 (51.83, 55.27) 61.84 (60.71, 62.97) Unknown 1.68 (1.74, 1.66) 16.04 (16.52, 15.59) 0.90 (0.96, 0.87) Data are expressed as the mean of n = 2, with individual values in parenthesis. N.D., not detected.

(17)

16 Fig. 2 Proposed metabolic pathways of DSP-0565 in human, dog, and rat hepatocytes

(18)

17 1-3 DSP-0565のラット及びイヌpharmacokinetics (PK)

DSP-0565を1 mg/kgでラット及びイヌに静脈内投与したときのクリアランス (CLiv) は、

それぞれ13.2 mL/min/kg及び30.7 mL/min/kgであり、ラットのCLivと比較してイヌのCLiv

は大きいことが明らかとなった (Table 3及びFig. 3)。ラット及びイヌのVdssは、それぞれ 2.11及び1.18 L/kgであり、t1/2はイヌの方が短かった。また、DSP-0565を1、3及び10 mg/kg でラット及びイヌに経口投与したときの Cmax及び AUC は用量依存的に増加することが確認された (Table 4)。

Table 3 DSP-0565 pharmacokinetic parameters in rats and dogs

Route Parameters Rat Dog

i.v. Dose (mg/kg) 1 1

CLiv (mL/min/kg) 13.2 30.7 ± 3.0

MRT (h) 2.54 0.624 ± 0.022

Vdss (L/kg) 2.11 1.18 ± 0.11

t1/2 (h) 3.72 0.626 ± 0.040

p.o. Dose (mg/kg) 10 10

Cmax (ng/mL) 2990 ± 477 1620 ± 180 Tmax (h) 0.833 ± 0.289 0.833 ± 0.289

AUC0-inf (ng·h/mL) 9940 ± 1740 3750 ± 361

F (%) 78.5 68.6

CL/Fplasma (mL/min/kg) 17.5 ± 3.2 44.8 ± 4.3

Data are expressed as mean, n = 2 (rat i.v.), and mean ± SD, n = 3 (rat p.o. and dog i.v. and dog p.o.).

CLiv, systemic plasma clearance after intravenous administration; MRT, mean residence time; Vdss,

(19)

18 volume of distribution at steady-state; t1/2, half-life; Cmax, maximal plasma concentration; Tmax, time to maximal plasma concentration; AUC0-inf, area under the plasma concentration-time curve extrapolated to infinity; F, oral bioavailability; CL/Fplasma, plasma oral clearance.

Table 4 PK parameters in rats and dogs after single oral administration of DSP-0565

Parameter Dose Rat Dog

AUC0-inf (ng·h/mL)

1 mg/kg 1160 ± 91 407 ± 68

3 mg/kg 2288 ± 119 1171 ± 231 10 mg/kg 9940 ± 1740 3750 ± 361

Cmax (ng/mL)

1 mg/kg 258 ± 29 180 ± 29

3 mg/kg 662 ± 99 418 ± 31

10 mg/kg 2990 ± 477 1620 ± 180 Data are expressed as mean ± SD (n = 3).

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19 Fig. 3 Plasma concentration of DSP-0565 following intravenous administration at 1 mg/kg (□) or oral administration at 10 mg/kg (■) to rats and dogs, and plasma concentration of M8 after the 10 mg/kg oral administration (▲)

(21)

20

1-4 DSP-0565のラット及びイヌにおける排泄率及び排泄物中の代謝物の同定

[¹⁴C]DSP-0565を10 mg/kgで胆管カニュレーションしたラットに経口投与した結果、放射

能として尿及び胆汁中にそれぞれ投与量の39.7%及び56.0%が排泄された (Table 5)。ラットの吸収率は、尿及び胆汁中の排泄率の合計値から、投与量の96%と推定され、良好な吸収性が確認された。[¹⁴C]DSP-0565を10 mg/kgでラット及びイヌに経口投与した結果、放射能は主に尿中に排泄され (71.6%及び71.2%)、一部は糞中に排泄された (25.1%及び22.7%)。

ラット及びイヌの排泄物中の代謝物プロファイリングをLC-MS/MS 及びラジオクロマトグラフィーで実施した結果、初発代謝物としてラットではM1、M2、M3、M7、M8及び未変化体のグルクロン酸抱合体が検出され、イヌではM1、M2、M3、M7及びM8が検出され

た (Table 6-9)。二次、三次代謝物としては、ジヒドロキシ体、水酸化体のグルクロン酸抱合

体、水酸化体の硫酸抱合体、水酸化体のアセチルシステイン抱合体及びM8のグルクロン酸

抱合体 (M8GA (rearrangement isomersを含む)) がラット及びイヌで検出された。これらの代

謝物の情報からin vivoにおける推定代謝経路をFig. 4にまとめた。また、加水分解経路及び水酸化経路の寄与率を推定した結果、水酸化経路 (ラット: 61.7%, イヌ: 56.7%) は加水分解経路 (ラット: 22.5%, イヌ: 32.5%) よりも寄与が大きいことが示唆された (Table 10)。

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21 Table 5 Cumulative excretion of ¹⁴C radioactivity in urine and feces after single oral administration of [¹⁴C]DSP-0565 at 10 mg/kg to rats and dogs

Species Time period Urine Feces Bile Total

h % of dose % of dose % of dose % of dose

Rat 0−168 71.6 ± 2.0 25.1 ± 2.0 − 96.7 ± 1.9

Rat 0−48 39.7 ± 5.9 1.6 ± 1.0 56.0 ± 9.0 97.3 ± 2.8 (bile duct cannulation)

Dog 0−168 71.2 22.7 − 93.9

Data are expressed as mean ± SD, n = 3 (rat), and mean, n = 2 (dog).

(23)

22 Table 6 Metabolites of DSP-0565 in urine after oral administration of [¹⁴C]DSP-0565 to rats (n = 3)

Components % of peaks [M+H]⁺ Major fragments Estimated structure Metabolic pathways

mean ± S.D. m/z

RU1 2.3 ± 0.7 438 262, 244, 199 Glucuronide of dihydroxylated metabolite Oxidation

RU2 14.1 ± 3.8 422 246, 201, 181 Glucuronide of hydroxylated metabolite Oxidation

RU3 3.2 ± 1.4 438 262, 244 Glucuronide of dihydroxylated metabolite Oxidation

RU4 2.0 ± 1.8 407 347, 301, 284, 260 Acetylcysteine conjugate of hydroxylated metabolite Oxidation RU5 1.3 ± 1.2 407 347, 301, 284, 260 Acetylcysteine conjugate of hydroxylated metabolite Oxidation

RU9 6.2 ± 1.0 409 345, 303, 286, 262 Hydroxyacetylcysteine conjugate Oxidation

RU10 6.5 ± 2.3 409 345, 303, 286, 262 Hydroxyacetylcysteine conjugate Oxidation

RU11 2.9 ± 0.3 326 246, 201 Sulfate of hydroxylated metabolite Oxidation

RU13 0.8 ± 0.5 245^a 201, 153 M11 (hydroxylated metabolite of M8) N.A.^b

RU14 2.9 ± 0.6 262 217, 199 Dihydroxylated metabolite Oxidation

RU15 a, b, c 5.0 ± 2.5 326 246, 229, 201

a; Sulfate of hydroxylated metabolite,

Oxidation

(24)

23

Components % of peaks [M+H]⁺ Major fragments Estimated structure Metabolic pathways

mean ± S.D. m/z

RU16 2.2 ± 1.1 246 201, 181 M1 (Hydroxylated metabolite) Oxidation

RU17 1.4 ± 0.7 231 213, 185 M8 (Hydrolyzed metabolite) Hydrolysis

RU18 17.4 ± 14.7 407 231, 213, 185 M8-GA (Glucuronide of M8) Hydrolysis

RU19 1.7 ± 0.8 246 183 M7 (Hydroxylated metabolite) Oxidation

RU20 8.0 ± 3.4 407 231, 213, 185 M8-GA rearrangement isomers Hydrolysis

RU21 1.4 ± 0.6 230 213, 185, 165 DSP-0565

a [M−H]⁻

b Not applicable. M11 can be generated both oxidation and hydrolysis pathways.

(25)

24 Table 7 Metabolites of DSP-0565 in feces after oral administration of [¹⁴C]DSP-0565 to rats (n = 3)

Components % of peaks [M+H]+ Major fragments Estimated structure Metabolic pathways mean ± S.D. m/z

RF1 5.2 ± 1.8 244 227, 199, 171 Reduced metabolite of M7 Oxidation

RF2 3.4 ± 0.7 245^a 201, 153 M11 (Oxidized metabolite of M8) N.A.^b

RF3 6.1 ± 2.1 262 245, 217, 199 Dihydroxylated metabolite Oxidation

RF4 a, b 6.7 ± 1.1 262 217, 199 a; Dihydroxylated metabolite,

Oxidation RF5 6.7 ± 1.0 406 230, 213, 185 Glucuronide of DSP-0565 Glucuronidation

RF6 14.9 ± 7.8 246 201, 181 M1 (Oxidized metabolite) Oxidation

RF7 14.4 ± 5.8 406 230, 213, 185 Glucuronide of DSP-0565 Glucuronidation

RF8 5.8 ± 1.1 ̶ ̶ Unknown

RF9 6.5 ± 0.4 406 230, 185, 165 Glucuronide of DSP-0565 Glucuronidation

RF10 9.8 ± 8.4 231 213, 185 M8 (Hydrolyzed metabolite) Hydrolysis

RF11 8.1 ± 4.8 246 183 M7 (Oxidized metabolite) Oxidation

RF12 8.2 ± 5.9 246 229, 201, 181

M2 (Oxidized metabolite) and

Oxidation

RF13 3.0 ± 1.3 230 213, 185, 165 DSP-0565

a [M−H]⁻

(26)

25 Table 8 Metabolites of DSP-0565 in urine after oral administration of [¹⁴C]DSP-0565 to dogs (n = 2)

Components % of peaks [M+H]+ Major fragments Estimated structure Metabolic pathways

mean ± S.D. m/z

DU1 0.6 438 262, 244, 199 Glucuronide of dihydroxylated metabolite Oxidation

DU2 7.3 422 246, 201, 181 Glucuronide of hydroxylated metabolite Oxidation

DU3 0.6 Unknown

DU4 a, b, c 1.9 438 262, 244 a; Glucuronide of dihydroxylated metabolite,

Oxidation

DU5 1.7 367 332, 303 Hydroxycysteine conjugate Oxidation

DU6 0.6 Unknown

DU10 0.9 Unknown

DU12 0.9 245^a 201, 153 M11 (Oxidized metabolite of M8) N.A.^b

DU13 0.7 Unknown

DU14 0.6 Unknown

DU15 0.9 246 201, 181 M1 (Oxidized metabolite) Oxidation

(27)

26

mean ± S.D. m/z

DU16 1.8 324^a 244, 201, 181 Sulfate of hydroxylated metabolite Oxidation

DU17 5.6 231 213, 185 M8 (Hydrolyzed metabolite) Hydrolysis

DU18 20.6 407 231, 213, 185 M8GA (Glucuronide of M8) Hydrolysis

DU19 0.9 246 229, 201, 181 M2 (Oxidized metabolite) Oxidation

DU20 1.4 246 229, 201, 181 M3 (Oxidized metabolite) Oxidation

DU21 4.9 407 231, 213, 185 M8GA rearrangement isomers Hydrolysis

DU22 0.2 246 229, 201 M4 (Oxidized metabolite) Oxidation

DU23 0.3 230 213, 185, 165 DSP-0565

a [M−H]⁻

(28)

27 Table 9 Metabolites of DSP-0565 in feces after oral administration of [¹⁴C]DSP-0565 to dogs (n = 2)

mean ± S.D. m/z

DF1 1.0 422 246, 229, 201 Glucuronide of hydroxylated metabolite Oxidation

DF2 a, b 1.6 262 217, 199

a; Dihydroxylated metabolite,

Oxidation

DF3 1.0 245^a 201, 153 M11 (Oxidized metabolite of M8) N.A.^b

DF4 1.5 262 217, 199 Dihydroxylated metabolite

DF5 1.2 Unknown

DF6 4.6 246 201, 181 M1 (Oxidized metabolite) Oxidation

DF7 38.1 231 213, 185 M8 (Hydrolyzed metabolite) Hydrolysis

DF9 7.5 338 213, 185 M8 taurine conjugate Hydrolysis

DF10 3.0 246 183 M7 (Oxidized metabolite) Oxidation

DF11 19.8 246 229, 201, 181 M2 (Oxidized metabolite) Oxidation

DF12 11.7 246 229, 201, 181 M3 (Oxidized metabolite) Oxidation

DF14 4.1 230 213, 185, 165 DSP-0565

a [M−H]⁻

(29)

28

(30)

29 Fig. 4 Postulated metabolic pathways of DSP-0565 in rats and dogs

(31)

30 Table 10 Contribution of metabolic pathways and intrinsic clearance of each pathway in hepatocytes and in vivo

Species Contribution of metabolic pathways

%

CLint

mL/min/kg CLint,in vivo/CLint,in vitro

Pathway Oxidation Hydrolysis Oxidation Hydrolysis Oxidation Hydrolysis

Rat Hepatocytes 15.0 71.4 0.45 2.1

62 4.7

In vivo 61.7 22.5 28 10

Dog Hepatocytes 10.9 54.6 2.2 11

58 6.6

In vivo 56.7 32.5 130 72

Human Hepatocytes N.D. 97.6 − −

− −

In vivo − − − −

N.D., not detected by radiochromatography.

In vivo CLint of rat and dog was calculated from total CL using the well-stirred or dispersion model. Selecting the appropriate mathematical model is important for calculation of CLint,in vivo of high clearance compounds (Iwatsubo et al., 1997). In dogs, the dispersion model is more suitable for calculation of DSP-0565 CLint than the well-stirred model, because DSP-0565 hepatic clearance was high (Table 3). In the method 3, 4.7 and 6.6 were used as rat SFhydrolysis and dog SFhydrolysis, respectively.

(32)

31

1-5 DSP-0565 のラット及びイヌの代謝経路の寄与率と肝固有 CL の in vitro-in vivo

correlation (IVIVC)

ラット及びイヌの in vivo における肝固有クリアランス (CLint,in vivo) と肝細胞から算出したin vitroでの肝固有クリアランス (CLint,in vitro) の比であるscaling factorは、それぞれ15倍、

11倍であり、CLint,in vitroはCLint,in vivoを過小評価した (Table 11)。ラットのin vivoにおける酸化代謝経路 (61.7%) は加水分解経路 (22.5%) よりも寄与率が高かったのに対し、ラット肝細胞では酸化代謝経路は加水分解経路よりも寄与率が低かった (Table 10)。イヌでも同様に

in vivo での酸化代謝経路は加水分解経路よりも寄与率が高かったのに対し、イヌ肝細胞で

は酸化代謝経路 (15.0%) は加水分解経路 (71.4%) よりも寄与率が低かった (Table 10)。そこで代謝経路別にscaling factorを算出した結果、酸化代謝経路のscaling factor (SFoxidation) は加水分解経路のscaling factor (SFhydrolysis) の9倍以上高いことが明らかとなった。

(33)

32 Table 11 DSP-0565 intrinsic clearance in hepatocytes and in vivo

Hepatocytes In vivo CLint,in vivo/CLint,in vitro

CLint CLint CLint

µL/min/1 × 10⁶cells mL/min/kg mL/min/kg

Rat 0.55 3.0 45 15

Dog 2.6 20 220 11

Human 2.0 5.0 23 4.6

CLint, intrinsic hepatic clearance. In vivo CLint of rat and dog was calculated from total CL using the well-stirred or dispersion model. In vivo CLint of human was calculated from CL/F using the well- stirred model assuming that Fa is equal to of the rat and intestinal metabolism is negligible. Selecting the appropriate mathematical model is important for calculation of CLint,in vivo of high clearance compounds (Iwatsubo et al., 1997). In dogs, the dispersion model is more suitable for calculation of DSP-0565 CLint than the well-stirred model, because DSP-0565 hepatic clearance was high (Table 3).

(34)

33 1-6 第一相臨床試験

DSP-0565を30 mg/kgで健常成人6例に経口投与した結果、加水分解体であるM8の血漿

中濃度は未変化体体よりも高く、DSP-0565のCL/Fは 7.6 ± 1.7 ml/min/kg であった。DSP- 0565の尿中排泄率は極めて低い (< 1% of dose) 結果であった。

Fig. 4 The pharmacokinetics profile of DSP-0565 (■), M8 (▲) dosed at 30 mg to healthy volunteers (n = 6)

(35)

34 1-7 ヒト代謝CLの予測精度の検証

ラットの吸収率 (0.96) はヒトの吸収率と等しく、小腸代謝は無視できると仮定し、ヒト肝細胞から算出したCLint,in vitroを用いてヒトCL/Fの予測検証を行った。CLint,in vitroを補正する方法として、(方法1) 補正なしでCLint,in vitroを用いる方法、(方法2) 動物のscaling factor (SFtotal, in vivo intrinsic clearance/in vitro intrinsic clearance) を用いてCLint,in vitroを補正する方法、

(方法3) 動物の加水分解経路のscaling factor (SFhydrolysis) を用いてCLint,in vitroを補正する方法、

を用いて検討を行った。

CLint,in vitroの補正方法

CLint,in vitro × 各種scaling factor 方法1：scaling factor = 1

方法2：scaling factor = CLint,in vivo/CLint,in vitro

方法3：scaling factor = 加水分解経路のCLint,in vivo/加水分解経路のCLint,in vitro

方法1では、ヒトのCL/Fを過小評価した (fold error = 0.22)。一方、方法2では、過大評価した (fold error = 2.4-3.3)。方法3では、最も良好な予測結果が得られた (fold error = 1.0- 1.4、 Table 12)。

(36)

35 Table 12 In vitro-in vivo extrapolation of human CL/F

Prediction methods Predicted CLint

Observed CLint

Predicted CL/F^a

Observed CL/F^a

Fold error Species mL/min/kg mL/min/kg mL/min/kg mL/min/kg

Method 1 − 5.0

23

1.7

7.6 ± 1.7

0.22

Method 2 Rat 76 25 3.3

Dog 56 19 2.4

Method 3 Rat 23 7.7 1.0

Dog 33 11 1.4

Human CL/F was predicted using CLint of human hepatocytes assuming that Fa is equal to that of the rat and intestinal metabolism is negligible with method 1 (no use of scaling factor), method 2 (use of SFtotal in rats or dogs), and method 3 (use of SFhydrolysis in rats or dogs).

Fold error, ratio of predicted CL/F divided by CL/F.

a The CL/F value is expressed as blood CL/F. Human plasma CL/F was 7.2 ± 1.6 mL/min/kg after singe oral administration of DSP-0565 at 30 mg to healthy volunteers (n = 6).

(37)

36

1-8 考察

IVIVE法は、ヒトの代謝CLを予測する上で有用な方法の一つである。しかしながら、加

水分解酵素により代謝される化合物に対する適応可能性は十分な知見がない。本研究では、

加水分解により主に代謝を受けるDSP-0565をモデル化合物とし、ラット、イヌ、ヒトにおける代謝及びPKについて検証した。In vitro及びin vivo代謝実験の結果、DSP-0565の代謝にはヒトと動物の間で顕著な種差が認められた。すなわち、DSP-0565はヒト肝細胞において、主にアミド結合が加水分解されるのに対して、ラット及びイヌ肝細胞ではアミド結合の加水分解に加えて、ベンゼン環もしくはベンジル位の酸化代謝を受けることが明らかとなった。ラット及びイヌの排泄物中代謝物プロファイルの結果から代謝経路の寄与率を推定した結果、主要代謝経路は酸化代謝経路であり (57–62%)、次に加水分解経路が大きいことが明らかとなった (23–33%)。さらに、DSP-0565 のヒト CL/F をヒト肝細胞から算出した

CLint,in vitro、ラットの吸収率はヒトの吸収率と等しく、小腸代謝は無視できると仮定し、予測

精度を検証した。その結果、予測値は方法1では過小評価 (fold error = 0.22, Table 12) し、

方法2では過大評価 (fold error = 2.4–3.3)、方法3では最も正確な予測値を示した (fold error

= 1.0–1.4)。

IVIVE法は代謝に種差が認められる化合物に対しても有用であると考えられるが、CLの

予測は他のPKパラメータと比較すると難しいケースが多い。例えば、ヒト肝細胞もしくは細胞画分におけるCLint,in vitroは過小評価される傾向があり、その要因は十分に解明されていない (Rawden et al., 2005; Riley et al., 2005; Wood et al., 2017)。実際に、DSP-0565のラット及びイヌ肝細胞におけるCLint,in vitroは、CLint,in vivoの11-15倍小さい結果が得られている。同様にヒト肝細胞におけるCLint,in vitroは、CLint,in vivoを4.6倍過小評価した (Table 11)。その要因は不明であるが、in vitro及びin vivoの実験は線形性が確認された条件で実施していることから、少なくとも代謝の飽和ではないと考えられる。ヒトCLint,in vitroからヒトCLint,in vivo を予

(38)

37 測する際の過小評価を補正するための方法論として、動物における被験物質のscaling factor を用いる方法 (Ito et al., 2005; Naritomi et al., 2001; Naritomi et al., 2003)、各代謝酵素に対するプローブ基質のscaling factorを用いる方法 (例えば、アルデヒドオキシダーゼのプローブ基質のscaling factorである約10倍を用いて補正する方法) (Akabane et al., 2012)、モデル化合物に対する regression 式を用いる方法 (Hallifax et al., 2010; Sohlenius‐Sternbeck et al., 2012;

Yamagata et al., 2017)、などが提唱されている。後者２つの方法は、動物のデータを取得する

ことなく適応できる利点があるが、それらの方法を用いるには各代謝酵素に対するプローブ基質やモデル化合物に対するregression式が必要であり、背景データの蓄積が可能であることが条件となる。そして、評価化合物の代謝を担う代謝酵素による代謝が背景データに用いる化合物で網羅している必要がある。本研究で用いたDSP-0565では、ヒトでの主要代謝経路であるアミド結合の加水分解に関する背景情報が極めて限定的であるため、それらの方法を用いることはできなかった。そこで、本研究では DSP-0565 の動物における scaling

factorを用いて、ヒトの代謝CLの予測精度を検証した。ラット及びイヌのscaling factorを

用いて、DSP-0565のヒトCL/Fを予測した結果、過小評価は改善されたが、反対に過大評価

する結果であった (fold error = 2.4及び3.3、Table 12)。そこで、この過大評価の要因として、

DSP-0565の代謝種差が関与しているという仮説を立てた。ヒト肝細胞において、DSP-0565

の代謝経路は100%加水分解経路であった。一方、ラット及びイヌ肝細胞では、加水分解経路及び酸化代謝経路の両方が認められた (Table 10)。また、ラット及びイヌin vivo実験においては、酸化代謝経路の寄与が最も大きいのに対して、ラット及びイヌ肝細胞では酸化代謝経路よりも加水分解経路の寄与が大きい結果であった。ラット及びイヌの酸化代謝経路は、

CLint,in vitroはCLint,in vivoよりも58–62倍小さいのに対して、ラット及びイヌの加水分解経路で

は、CLint,in vitroはCLint,in vivoよりも4.7–6.6倍小さく、酸化代謝経路と比較して加水分解経路

ではCLint,in vitroとCLint,in vivoの差は顕著に小さかった。これらの結果から、方法2でヒトCL/F

を過大評価した要因は、SFoxidationが SFhydrolysisの 9倍大きく、ヒト肝細胞では認められてい

(39)

38

ないSFoxidationが動物のSFtotalに含まれるためであると示唆された。実際に、SFhydrolysisを用い

た方法3では、予測精度は良好であった (fold error = 1.0–1.4)。以上のことから、動物のscaling

factorをヒトのCL予測に用いる場合、各代謝経路に対するscaling factorの種差を十分に理

解することが重要であり、代謝経路に種差がある場合には予測精度に影響する可能性があることが示唆された。今後、方法3を用いた検証事例が蓄積されることで、他の化合物や加水分解酵素以外の代謝酵素への応用が期待される。

CLint,in vitroを算出するための方法論としては、基質減少法と代謝物生成法の二種類の方法

がある。代謝物生成法では主要な代謝物標準品を化学合成する、もしくは放射線標識した化合物を合成する必要がある。このため、創薬初期においては一般的に基質減少法が用いられる。非標識の未変化体を用いた基質減少法は、簡便に用いることができるが、代謝経路の寄与率は推定できない。また、非標識の化合物を用いて、in vivoの代謝経路を評価することは非常に困難である。動物におけるscaling factorは、ヒトの代謝CLの予測に有用であるが、

ヒトと動物間の代謝経路の種差や寄与率のIVIVCは加味されていない。一方、標識体を用いることでin vitro及びin vivoの代謝プロファイリングを定量的に評価することが可能である。本研究では、[¹⁴C]DSP-0565を用いて代謝経路を定量的に評価することで、各代謝経路

のscaling factor及びヒトと動物間の種差を理解することが動物のscaling factorをCL予測に

用いる際に重要であるという知見を得た。

(40)

39 第2章 Øie-Tozer modelのヒトvolume of distribution (V1、Vdss及びVdβ) の予測適応性

2-1 概要

非臨床データからヒトの PK を予測する場合、一般的に Vdss を予測し、さらに 1-

compartment modelに組み込み、t1/2や血漿中濃度推移を予測する。しかしながら、二相性の

消失を示す化合物の場合、その方法は適応不可であり、2-compartment model を用いる必要がある。2-Compartment modelを用いて予測するためには、Vdssに加えてV1及びVdβの予測が必要となるが、Vdssと比較してV1及びVdβの予測方法は十分に確立されていないのが現状である。また、Vdssの予測方法としては、これまでの研究から Øie-Tozer modelを用いた方法が最も精度が高いことから、Øie-Tozer modelをV1及びVdβの予測にも適応することが期待される。しかし、Øie-Tozer modelがV1、Vdss及びVdβの全ての予測に適応可能であるかは不明である。

本章では、Øie-Tozer modelがVdssに加えてV1及びVdβへの予測、さらに二相性の消失を示す化合物の血漿中濃度推移及びPKパラメータの予測に対して、適応可能であるかを検証した。検証に用いたモデル化合物は、臨床でのPK情報が報告されており、V1/Vdssが広範となるように文献情報から20化合物を選択した (Table 13)。まず、20化合物の動物のV1、Vdss

及びVdβ、血清蛋白結合率を評価した。さらに、Øie-Tozer modelと一般的によく用いられる予測方法であるproportionality及びsimple allometry (SA) を用いてヒトのV1、Vdss及びVdβ

を予測した。その結果、Øie-Tozer modelがV1、Vdss及びVdβの全ての予測に良好な精度で適応可能であることを初めて示した (三倍以内の精度で予測可能であった化合物の割合は、

それぞれ89%、85%及び68%であった)。また、Øie-Tozer modelは、他の予測方法と比較し

て精度が高い方法であることを示した。さらに、V1、Vdss及びVdβの各予測値を2-compartment

modelに組み込み、静脈内投与した後の血漿中濃度推移、Cmax及び終末挿のt1/2を予測した。

また、Øie-Tozer modelが Vdssの予測のみに適応可能である場合を想定し、Øie-Tozer model

(41)

40 でVdssを予測し、1-compartment modelに組み込み、予測した結果と比較した。その結果、

2-compartment modelは20化合物中18化合物に対して、ヒトPK予測に適応可能であり、1-

compartment modelと比較してヒトで二相性の消失を示す化合物をより精度高く予測可能で

あることを示した。

本研究では、Øie-Tozer modelが二相性の消失を示す化合物に対して、ヒトのVdssのみならず、ヒトのV1、Vdss及びVdβの全ての予測に適応可能であることを初めて示した。また、

予測したVd及び2-compartment modelを用いることで1-compartment modelで予測する場合と比較して、ヒトの Cmaxの過小評価を改善し、血漿中濃度推移の予測精度を向上させることを示した。これまではヒトのVdssを精度高く予測可能である Øie-Tozer modelがV1及び Vdβの予測にも適応可能であるか不明であったことから、2-compartment modelを用いた正確な予測ができなかった。本研究では、この課題に対する解決策を提示できたと考える。

(42)

41 Table 13 Human PK parameters after intravenous infusion or bolus administration of 20 compounds

Compound Compartmental

analysis^a Dose Route of

administration

Body weight^b

V1/Vdss

V1 Vdss Vdβ

References

(kg) (L/kg) (L/kg) (L/kg)

Acebutolol In this study 0.35 mg/kg i.v.bolus 0.28 0.40 1.4 1.6 Roux et al., 1980

Amitriptylin Literature 15 mg/30 min i.v. infusion 0.16 1.3 8.3 8.9 Jorgensen et al., 1976

Azithromycin In this study 1 g/2 h i.v. infusion 76 0.19 6.5 34 48 Luke et al., 1996

Chlorambucil In this study 10 mg i.v.bolus 0.35 0.13 0.37 0.48 Newell et al., 1983

Chloroquine Literature 3 mg/kg/15 min i.v. infusion 0.053 7.5 142 187 Aderounmu et al., 1986

Chlorpromazine In this study 10 mg i.v.bolus 0.30 2.7 9.3 10 Yeung et al., 1993

Cyclophosphamide Literature 500-800 μg i.v.bolus 0.51 0.38 0.74 0.71 Juma et al., 1979

Dofetilide In this study 2 μg/kg i.v.bolus 74 0.18 0.57 3.2 3.3 Gemmill et al., 1991

Enalaprilat In this study 10 mg i.v.bolus 64 0.26 0.11 0.43 4.1 Hockings et al., 1986

Flecainid Literature 2 mg/kg/5 min i.v. infusion 0.35 1.7 4.9 5.5 Tjandra-Maga et al., 1986

Folinic Acid In this study 25 mg i.v.bolus 63 0.27 0.32 1.2 2.0 Greiner et al., 1989

Haloperidol In this study 0.125 mg/kg i.v.bolus 0.19 4.0 21 23 Holley et al., 1983

Ketanserin In this study 10 mg i.v.bolus 0.46 1.4 3.1 7.9 Heykants et al., 1986

Nateglinide In this study 60 mg/10 min i.v. infusion 80 0.52 0.076 0.15 0.24 Weaver et al., 2001 Nefazodone In this study 4.64 mg/10 min i.v. infusion 72 0.43 0.37 0.85 1.4 Barbhaiya et al., 1996

(43)

42 Compound Compartmental

analysis^a Dose Route of

administration

Body weight^b

V1/Vdss

V1 Vdss Vdβ

References

(kg) (L/kg) (L/kg) (L/kg)

Nifedipine In this study 2.5 mg/2.5 min i.v. infusion 0.43 0.49 1.1 1.4 Rashid et al., 1995

Quinine Literature 5 mg/kg/5 min i.v. infusion 0.32 0.57 1.8 1.8 White et al., 1983

Ranitidine Literature 150 mg i.v.bolus 0.29 0.32 1.1 1.4 van Hecken et al., 1982

Tegaserod In this study 3 mg/40 min i.v. infusion 0.089 0.42 4.8 14 Appel-Dingemanse et al.,

Valproic acid In this study 347 mg/5 min i.v. infusion 63 0.66 0.072 0.11 0.12 Bryson et al., 1983

a PK parameters calculated using compartmental analysis were obtained from literature. When compartmental analysis was not conducted in the literature, the human plasma concentration-time curve after intravenous infusion or bolus administration was digitized using Origin 9.0 SR1 (OriginLab Corporation, MA) and two-compartmental analysis was conducted using WinNonlin version 7.0 (Pharsight Corporation, NC). Data points were weighted 1/Yhat² for analysis. The diffrerence between the obtained Vdss by two-compartmental analysis and Vdss reported in the literature was confirmed to be within 20%. When Vdss was not reported in the literature, the difference of AUC was confirmed to be within 20%.

b When body weight was not available in the literature, body weight was assumed to 70 kg.

(44)

43 2-2 モデル化合物のラット、イヌ及びサルPK

ラット、イヌ及びサルに 20化合物をそれぞれ0.1 mg/kgで静脈内投与した後の血漿中濃度推移を1もしくは2-compartment modelを用いて解析した。得られたV1、Vdss及びVdβを

Table 14に示す。Azithromycinをラットに0.1 mg/kgで静脈内投与した後の血漿中濃度は定

量下限であったことから、1 mg/kgに変更し、再度検討を行った。Cyclophosphamide (イヌ及びサル)、flecainide (ラット及びサル)、haloperidol (ラット及びサル)、nifedipine (ラット及びサル)、quinine (サル) 及び valproic acid (ラット、イヌ及びサル) の血漿中濃度は 1- compartment modelに、その他の血漿中濃度のデータは2-compartment modelに良好にfitting した。14化合物はヒトと同様に全ての動物種において、2-compartment modelに良好にfitting した (Appendices参照)。一方、6化合物 (cyclophosphamide, flecainide, haloperidol, nifedipine, quinine及びvalproic acid) について、ヒトでは2-compartment modelにfittingしたのに対し、

動物では少なくとも一動物種で1-compartment modelにfittingされ、記述されるモデルに種差が認められた。

(45)

44 Table 14 V1, Vdss, and Vdβ after intravenous bolus administration of 20 compounds at 0.1 mg/kg to rats, dogs, and monkeys

Compound Compartmental model V1 (L/kg) Vdss (L/kg) Vdβ (L/kg)

Rat Dog Monkey Rat Dog Monkey Rat Dog Monkey Rat Dog Monkey

Acebutolol 2 2 2 5.5 1.6 1.5 10 5.3 2.4 14 6.1 6.7

Amitriptyline 2 2 2 12 3.2 7.0 16 9.9 33 20 13 59

Azithromycin^a 2 2 2 9.6 3.2 2.5 76 19 18 94 22 22

Chlorambucil 2 2 2 3.4 0.39 0.26 4.8 0.75 0.75 10 3.2 2.2

Chloroquine 2 2 2 25 8.9 12 200 60 67 230 65 80

Chlorpromazine 2 2 2 10 2.5 6.7 15 6.8 8.2 21 8.0 9.4

Cyclophosphamide 2 1 1 1.4 1 0.62 1.8 NA NA 2.6 NA NA

Dofetilide 2 2 2 2.4 1.3 1.2 3.7 3.4 1.8 4.3 3.2 2.3

Enalaprilat 2 2 2 0.85 0.21 0.17 11 0.63 1.3 14 1.8 3.7

Flecainide 1 2 1 39 3.1 4.5 NA 4.9 NA NA 5.6 NA

Folinic acid 2 2 2 1.0 0.24 0.26 5.0 0.53 0.55 27 0.67 0.75

Haloperidol 1 2 1 16 7.6 7.3 NA 17 NA NA 18 NA

Ketanserin 2 2 2 0.32 7.0 0.93 0.50 11 1.3 1.1 21 3.9

Nateglinide 2 2 2 1.1 0.17 0.070 1.5 0.53 0.14 4.9 0.83 0.40

Nefazodone 2 2 2 2.3 1.1 0.41 3.9 3.3 0.58 5.9 6.0 1.4

(46)

45

Compound Compartmental model V1 (L/kg) Vdss (L/kg) Vdβ (L/kg)

Rat Dog Monkey Rat Dog Monkey Rat Dog Monkey Rat Dog Monkey

Nifedipine 1 2 1 0.82 2.6 0.45 NA 6.7 NA NA 9.2 NA

Quinine 2 2 1 5.7 0.42 0.34 8.2 1.3 NA 16 9.1 NA

Ranitidine 2 2 2 4.6 1.1 0.63 58 3.6 1.6 120 4.8 2.0

Tegaserod 2 2 2 2.9 0.55 1.0 18 8.8 30 34 12 41

Valproic acid 1 1 1 0.14 0.20 0.14 NA NA NA NA NA NA

NA, not applicable

a After intravenous administration of azithromycin at 0.1 mg/kg to rats, plasma concentration was below the lower limit of quantification. Therefore, 1 mg/kg was set as dose of azithromycin for rats.

(47)

46 2-3 ヒトV1、Vdss及びVdβの予測精度の検証

各種血清蛋白結合率を平衡透析法により評価した (Table 15)。ヒトのV1、Vdss及びVdβを以下の予測方法で予測した。

Proportionality：動物のV1、Vdss及びVdβは、それぞれヒトのV1、Vdss及びVdβと等しいと仮定し、ヒトのV1、Vdss及びVdβを算出した。

Proportionality fup：fupで補正したVdをproportionalityと同じ仮定で下記の式に基づき、ヒトのV1、Vdss及びVdβの予測に用いた (Obach et al., 1997)。

Human Vd = animal Vd × human fup / animal fup

Øie-Tozer：動物の定常状態における futを下記の式に基づき算出した (Øie and Tozer, 1979;

Obach et al., 1997)。

fut = Vr × fup/[Vdss − Vp − (fup × Ve)− (1− fup) × Re/i × Vp]

Ve: the extracellular fluid volume Vp: the plasma volume

Vr: the remaining fluid volume

Re/i: the ratio of binding protein in extracellular fluid to that in plasma

Re/iは、1.4と仮定した。用いた生理学的パラメータは実験方法の項に記載した (Obach et al.,

1997)。また、3動物種のfutの平均値を算出した。ヒトの futは、動物のfutと等しいと仮定

し、下記の式に基づきヒトの定常状態におけるVdss (L/kg) を算出した。

(48)

47 Human Vdss = Vp × (1 + Re/i) + fup × Vp × (Ve/Vp − Re/i) + Vr × fup/animal fut

生理学的パラメータ及びfupは、ヒトの数値を用いた。さらにVdβはVdssと等しいと仮定することで下記の式で示される (Imawaka et al., 2009)。

Vdβ = Vp × (1 + Re/i) + fup × Vp × (Ve/Vp − Re/i) + Vr × fup/fut

動物のβ相 (偽定常状態) におけるVr/futをØie Tozer modelに基づき算出し、ヒトのVdβを下記の式に基づき算出した。

Human Vdβ = Vp × (1 + Re/i) + fup × Vp × (Ve/Vp − Re/i) + animal Vr/fut × fup

2-Compartment modelでは、Vdssは下記の式で定義される。

Vdss = V1 + V2

Vp及びVeは、V1に含まれると仮定し、V1及びV2をØie-Tozer modelに基づき下記の式を導いた。

Vr/fut × fup = (Vr1/fut1 + Vr2/fut2) × fup

V2 = Vr2/fut2 × fup

V1 = Vp × (1 + Re/i) + fup × Vp × (Ve/Vp − Re/i) + Vr1/fut1 × fup

V2 = (Vr/fut − Vr1/fut1) ×fup

(49)

48 Vr1: the remaining fluid volume in V1

fut1: the unbound fraction in tissues belonging to V1

Vr2: the remaining fluid volume in V2

fut2: the unbound fraction in tissues belonging to V2

動物のVr1/fut1は、下記の式に基づき算出した。

Vr1/fut1 = Vr/fut − V2/fup

ヒトのVr1/fut1は動物のVr1/fut1と等しいと仮定し、ヒトのV1を算出した。動物のVr1/fut1、定常状態におけるfut及びβ相におけるVr/futが定義から逸脱する値 (Vr1/fut1< 0、fut < 0、fut > 1、 fut < 0) を示した値も予測の対象として用いた (Berry et al., 2011)。

Simple allometry (SA)：動物のVd (L/kg) を体重に対してlog-log scaleでプロットし、下記の式に基づき回帰した (Boxenbaum et al., 1982)。

Vd = a × body weight^b

a: coefficient value b: exponent

ヒトの体重は報告値もしくは標準的な値として70 kgを用いた (Table 13)。動物のVd及び体重から得られたa及びbを用いてヒトのVdを算出した。

(50)

49 SA fup：fupで除したVdをSAと同じ原則でヒトのVdを算出した。

動物で一相性の消失を示した化合物に関しては、1-compartment model に基づく解析で得られた動物のV1はVdss及びVdβと等しいと仮定し、動物のV1をヒトのV1、Vdss及びVdβ

の予測に用いた。ヒトのVdssの予測精度は、Øie-Tozer model及び三種の平均値を用いた予測法が最も良好な予測性を示し、60%の化合物で二倍以内の予測、85%の化合物で三倍以内の精度で予測可能であった (Table 16、Table 18)。

Øie-Tozer model を用いた予測法の中で三種の平均値を用いた予測法は、各動物一種を用

いた予測法よりも予測精度が高かった (Table 16)。また、Øie-Tozer model及び三種の平均値を用いた予測法は、ヒトのVdβの予測にも適応可能であり、58%の化合物で二倍以内の予測、

68%の化合物で三倍以内の予測が可能であった (Table 16、Table 19)。さらに、二倍以内の予測が可能であった化合物の割合は、検証した方法の中で最も高かった。Øie-Tozer modelは、

三種の平均ではなく、サルのVr1/fut1を用いた場合、ヒトのV1の予測に適応可能であり、74%

の化合物で二倍以内の予測、89%の化合物で三倍以内の予測が可能であった (Table 16、Table 17)。以上より、Øie-Tozer modelは、Vdssに加えてV1及びVdβの三つのVdの予測に高い精度で適応可能であり、その予測精度は他の予測方法と比較して高いことが示された。

ヒトのV1、Vdss及びVdβの予測値と実測値の関係性をFig. 5に示す。ヒトのV1は、三動物種を用いたØie-Tozer modelに基づく予測において、一相性を示したvalproic acidを除く 19化合物中8化合物で三倍以上過大評価し、反対に三倍以上過小評価した化合物は認められなかった (Fig. 5D)。Øie-Tozer modelにより予測したV1で過大評価の傾向が認められたのは、三動物種の中でラットでのみ顕著に認められた (Fig. 5)。一方、三動物種のVr/futの平均

値及びØie-Tozer modelを用いてヒトのVdss及びVdβを予測した際には、明らかな過大評価

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