虚血性脳血管障害における血小板ADP凝集とアラキドン酸刺激による血小板12-hydroxyeicosatetraenoic acid(12-HETE)産生能

102 原 著 〔東女医大誌 第59巻 第6号頁 560∼563平成元年6月〕

虚血性脳血管障害における血小板ADP凝集とアラキドン酸

刺激による血小板12−hydroxyeicosatetraenoic acid

（12−HETE）産生能

東京女子医科大学 脳神経センター神経内科 ムラカミ ヒロピコ ウチヤマシンイチロウ コバヤシ イツロウ マルヤマ ショウイチ

村上 博彦・内山真一郎・小林 逸郎・丸山 勝一

（受付 平成元年2月3日）

Production of 12・Hydroxyeicosatetraenoic Acid（12・HETE）from Platelets

Challenged by Arachidonate in lschemic Attack

Hirohiko MURAKAMI， Shinichiro UCHIYAMA， Itsuro KOBAYASHI

and Shoichi MARUYAMA

Department of Neurology， Neurological Institute， Tokyo Women’s Medical College It is not known whether the platelet lipoxygenase pathway has a physiological role in regulating hemostasis． In order to clarify a possible role of the platelet lipoxygenase pathway， we investigated the correlation between production by the platelet of 12−HETE， the final metabolite of lipoxygenase pathway， and platelet aggregation．

We studied the platelet function and 12・HETE production in 71 patient which include 31 with cerebral thrombosis（CVD），21with transient ischemic attack（TIA）and 19 with neurological disorders without cerebrovascular diseases（N）． ADP−induced platelet aggregation in citrated platelet rich plasma was determined by using NKK Hematracer I and divided into five types according to aggregation patterns． Arachidonate−induced 12−HETE production was measured by high−performance liquid chromatography．

There was no significant difference in the amounts of 12−HETE produced by platelets between any groups of the platelets． Among the 3 groups of patients as well as groups CVD and TIA，12・HETE production by hyperactive platelets（types III， IV and V）was significantly higher than that by platelets with normal aggregavility（types I and II）． ’

These results suggest that the lipoxygenase pathway in hyperactive platelets is m6re activated than that in platelets with normal aggregability．

緒 言

虚血性脳血管障害における血栓形成には血小板

アラキドン酸（AA）代謝のシクロオキシゲナーゼ

系の重要性が強調されている．血小板におけるア

ラキドン酸のリポキシゲナーゼ系代謝産物の生理

的意義は完全には解明されていない．12−

hydroperoxyeicosatetraenoic acid（12−HPETE）

には血小板凝集阻害やトロンボキシン（TX）合成

酵素阻害作用などが知られている．その最：終代謝

産物である12−hydroxyeicosatetraenoic acid

（12−HETE）には顯粒球の化学走性活性がある

が1），血小板凝集に及ぼす影響は不明である．今

回，血小板12−HETEの血小板凝集に及ぼす影響

を血小板ADP凝集能とAAで誘発した際の12−

HETE産生量の面から検討したので報告する．

一560一

！03

対象および方法

対象：脳血栓症群（CVD群）31例，一過性脳虚

血発作群（TIA群），21例および血管障害以外の神

経疾患群（N群）19例，計71例である．

方法：血小板凝集能は3．8％クエン酸ナトリウ

ム採血した静脈血（1：9）よりplatelet rich

1 II 111 IV

V

ム 三 図1 血小板凝集能パターン 1．血小板洗浄 1）PRPにPGI2−Na O．1μg／ml加える．（PRP lmlに対し2 μ1） 2）ゆるやかにvortexした後，2300r．p．m，10分遠心． 3）上清をdecantationによりのぞく． 4）PelletをTyrode液にsuspensionする．1mlあたり0．1μg のPGI2・Naを加える． 5）ゆるやかにvortexした後，2200r．p．m．，10分遠心， 6）上清はdecantationによりのぞぎ， pelletである血小板を Tyrode液20Gμ1でsuspensionを行なう．（使用まで4℃に 保存する） 2．血小板凝集 1）Sample（洗浄血小板）200μ1に終濃度1．09mM AAを加え る． 2）30分放置． 3）等量のメタノール（250μ1）を加え，反応停止． 4）15GOr．p．m．，5分遠心し上清を分析に供する． 3．HPLCによる分析 1）溶媒（アセトニトリル／水／酢酸；60／40／0．02） 2）カラム（Pak−A） 3）測定条件

Tri．Rotor−V TU−300 UVIDEC−100−V FIow rate： 一一Temp．：40℃ 一・ジWave Length：

1．2m1／分 カラム：Pak−A 235㎜

plaslna（PRP）を作製し，2μMADPをagonist

としNKK Hematracer Iを用いて測定した．得

られた凝集曲線を図1に示すように1型（正常

型），II型（直線解離型）， III型（2次凝集解離型）， IV型（2次凝集非解離型）， V型（持続凝集型）の

5型に分類した，12・HETE測定は上記PRPを

Takenagaら2）の方法に従い， PGI2−Na存在下に

遠心し，pelletをTyrode液で2回洗浄した．最終

的にpeUetである血小板をTyrode液200μ1に浮

遊し洗浄血小板浮遊液とし，これに1．09mM AA

を加え室温で30分間反応させ，等量のメタノール

を加え反応を停止した．1，500回転，5分間遠心し

上清を分析に供した．12・HETEはアセトニトリ

ル／水／酢酸二60／40／0．02の溶媒系で日本分光製

HPLCシステムで分析した（図2）．有意差検定は

Student−t検定によった．

結 果

1．血小板機能

血小板ADP凝集能は1型9例， II型11例， III型 9例，IV型16例， V型26例であった（表1）．血小

板機能は，この凝集パターンから凝集能正常群と

叡感群の2群に分け検：冠した．可逆凝集のパター

ンを示す1型およびII型を凝集能正常群，2次凝

集または，不可逆凝集を示すIII， IVおよびV型を 凝集能前進群とした3＞．凝集能正常群は20例，凝集

能充進群51例であった．疾患別ではCVD群， TIA

群，N群の3群間でκ2検定で分布に差はみられな

表1 疾患別のADP凝集能パターン 1型 H型 IH型 IV型 V型 計

CVD群

3 7 5 4 12 31

TIA群

2 3 1 8 7 21

N群

4 1 3 4 7 19 計 9 11 9 16 26 71 表2 アラキドン酸で誘発した際の血小板12−HETE産 生量

CVD群

TIA群

N群

図2 血小板12・HETEの測定系 22．5±18．1ng／106platelets 23．9±18．4 25．2±22．4 mean±SD． 一561一

！04 表3 血小板ADP凝集能とアラキドン酸で誘発し た際の血小板12−HETE産生量 （ng／106platelets） 凝集能正常群 凝集能充進群

CVD群

@（31） 12．2±10．0 @（10） 28．1±19．3率 @（2工）

TIA群

i21） 18．2±14．3 @（5） 26，2±19．8准 @（16）

N群

i19） 12．1±8．6 @（5） 29．9±24．1奉 @（14） 全 体 i71） 13．2±1！，4 @（20） 27，5±20．1喰 @（51） ＊：pく0．05 mean±SD， かった．

2．血小板AA刺激による12−HETE産生量

AA刺激による12・HETE産生量は， CVD群

22．5±18．1ng／106platelet（mean±S．D．）， TIA群 23．9±18．4，N群25．2±22．4であった（表2）．

CVD群で低値を示す傾向があったが，3群間で有

意差はなかった．次に，12−HETE産生量と凝集能

の関係を1およびII型の凝集能正常群とIII， IVお

よびV型の充進群の2瞬間で比較した．凝集能正

常群13．2±11．4ng／106platelet，献進群27．5±20．1

であり，凝集能充進群で危険率5％以下で有意な

増加を示した（表3）．また，虚血性脳血管障害を

有するCVD群， TIA群の2群で比較すると，

CVD群では凝集能正常群は12．2±10．Ong／106

platelet，充祠官28」±19，3であり，TIA群では凝 集能正常群は18．2±14．3ng／106platelet，充進群 26．2±19．8であった．CVD群， TIA群とも血小板

凝集能充進群で危険率5％以下で12−HETE産生

量の有意な増加を示した（表3）．

考 察

血小板リポキシゲナーゼ系代謝産物の血小板凝

集に及ぼす作用については，まだ一定の見解が得

られていない．血小板リポキシゲナー庶系代謝の

低下が存在すれぽ，両系に共通の基質であるアラ

キドソ酸の代謝がシクロオキシゲナーゼ系代謝に

かたむき，血小板機能を充進させる可能性がある．

事実，血小板リポキシゲナーゼ単独欠損症におい

て血小板リポキシゲナーゼ系代謝の低下に伴う血

小板シクロオキシゲナーゼ系の代謝充進に起因す

一562 る血小板機能の充進が示唆されている4）．しかし，

逆に本症に出血性素因を伴うことも報告されてお

り4）5），血小板リポキシゲナーゼ系代訴産物も血小

板凝集に重要な役割をはたしていると推察され

る．また，血小板リポキシゲナーゼ系代謝産物は

血小板の不可逆凝集の誘発に必要であるとする報

告もあるが6）7），これに反する報告もなされてお

り8），一定していない．今回の1血小板ADP凝集と

AAで凝集を誘発した際の12−HETE産生：量に関

する検討からは血小板凝集能充進群で12−HETE

産生量が増加することが示された．これは凝集能

充進吊すなわち，不可逆凝集を示す群では血小板

リポキシゲナーゼ系代謝の充進状態が存在するこ

とを示唆する所見と考えられ，血小板リポキシゲ

ナーゼ系代謝産物は血小板の2次凝集に何等かの

影響を与えているものと推測した．虚血性脳血管

障害における血栓形成には血小板シクロオキシゲ

ナーゼ系代謝の詠進状態が重要と考えられている

が，リポキシゲナーゼ系代謝産物も2次凝集の発

現など血栓形成に重要な役割りをはたしているも

のと考える．血小板シクロオキシゲナーゼ，リポ

キシゲナーゼ両系の代謝のバランスに関しては今

後更に検討する必要がある． 稿を終えるにあたり，実験にご協力いただぎました 研究室の小原三千代，橋口孝子両氏に，またPGI2−Na の提供を戴いた小野薬品工業（株）に深謝致します．

文 献

1）Tumer SR， Tainer JA，1．ynn WS：

Biogenesis of chemotactic molecules by the arachidonate lipoxygenase system of platelets． Nature 257：680−681，1975

2）Takenaga M， Hirai A， Terano T e亡al：Com− parison of in vitro effect of eicosapentaenoic acid（EPA）一derived lipoxygenase metabolites on human platelet function with those of ara・ chidonic acid． Thromb Res 37：373−384，1986 3）Uchiyama S，愛akeuchi M， Osawa M et al： Platelet function tests in thrombotic cere・ brovascular disorders． Stroke 14：511−517，1983 4）Okuma M， Uchino H： Altereσarachidonate metabolism by platelets in patients with myelo− proliferative disorders． Blood 54：1258−1271，

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5) Schafer AI: Deficiency of platelet ygenase activity in myeloproliferative orders. N Engl J Med 306 l 381-386, 1982 6) Dutilh CE, Haddeman E, Jouvenaz GH et al : Study of the two pathways for arachidonate oxygenation in blood platelets. Lipids 14 : 241-246, 1978

7) Dutilh CE, Haddeman E, Don JA et al : The role of arachidonate lipoxygenase and fatty

acid during irreversible blood platelet gregation in vitro. Prostagrandin Med 6 I 111-126, 1981

8) Sams AR, Sprecher H, Sankarappa SK et al: Selective inhibitors of platelet arachidonic acid metabolism aggregation independent of

ygenase. Adv PG TX Leukotriene Res 9 I

19-28, 1982