九州大学薬学研究科薬学専攻

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

大腸菌F因子letD遺伝子による染色体分配及び細胞分 裂阻害機構に関する研究

村山, 信浩

九州大学薬学研究科薬学専攻

https://doi.org/10.11501/3065434

出版情報：Kyushu University, 1992, 博士（薬学）, 課程博士 バージョン：

権利関係：

‑ ︽

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一 O

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コ q o n o

一 刀

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信斗

1

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大 腸 菌 F 因 子 i e  t  D 遺 伝 子 に よ る 染 色 体 分 配 及 び 細 胞 分 裂 阻 害 機 構

に 関 す る 研 究

布斗 の ︿ ー

Uハ

u u

ハu u

噌111よ

村 山 信 浩

E ‑ 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ^{2 A}  

^4#... 

^{一 一 一 一} 一 一 一 一 回 幽

目 ど 欠

第

1

章 序 論

第

2

章 実 験 に 用 い たt1 d変 異 株 10 

第

1

節 斗益変異株分離の考え方 10 

第

2

節 本 研 究 に 用 い た 斗

A

変 異 株 10 

第

3

章 ト ラ ン ス ポ ゾ ン ・ タ ギ ン グ 法 を 用 い た 斗 止 遺 伝 子 近 傍 の 染 色 体

DNAの ク ロ ー ニ ン グ 16 

第 l節 新しい斗Ji遺伝子の存在 16 

第

2

節 ト ラ ン ス ポ ゾ ン ・ タ ギ ン グ 法 16 

第

3

節 斗益変異と連関したTn10の 分 離 18  第

4

節 TnlQに隣接した染色体DNAの ク ロ ー ニ ン グ 20 

第

4

章 叫益変異の相補性試験と斗止遺伝子のマッピング 23 

第 l節 野 生 型

i l l

遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ 23  第

2

節 変 異 型 斗 昼 遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ 26 

第

3

節 斗

A

変 異 の 相 補 性 試 験 27 

第

4

節 斗J

I

遺 伝 子 の 大 腸 菌 染 色 体 上 で の マ ッ ピ ン グ 30 

第

5

章 斗且

E

遺 伝 子 の 塩 基 配 列 決 定 と 遺 伝 子 産 物 同 定 34  第

l

節 欠 失 変 異 株 を 用 い た

t 1 

dO遺 伝 子 領 域 の 限 定 34  第

2

節 斗 盟 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 の 決 定 と 読 み 枠 の 検 索 34  第

3

節

t  1 

d 

0 5  

0変 異 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 41  第

4

節

ι s i l l

遺 伝 子 産 物 の 同 定 41  第

5

節 プ ロ モ ー タ ー 領 域 、 タ ー ミ ネ ー タ ー 領 域 の 検 索 48 

第

6

章

t  1  d  E

遺 伝 子 の 塩 基 配 列 決 定 と 遺 伝 子 産 物 同 定

5 3  

^第

²

^節

z  f  i  A

遺 伝 子 に つ い て

1 0 3  

第

1

節

t  1

日 遺 伝 子 領 域 の 限 定

5 3  

第

2

節

t  1  d  E

遺 伝 子 領 域 の 塩 基 配 列 の 決 定 と 読 み 枠 の 検 索

5 3  

^第

¹¹

^章 実 験 材 料 及 び 実 験 方 法

1 0 7  

第

3

節

t  1  d  E 3

変 異 遺 伝 子 の 塩 基 配 列

6 0  

^第

^l

^{節 実 験 材 料}

1 0 7  

第

4

節

t  1  d  E

遺 伝 子 産 物 の 同 定

6 0  

^第

²

^{節 実 験 方 法}

1 1 0  

第

5

節 プ ロ モ ー タ ー 領 域 の 検 索

6 6  

謝 辞

1 1  5 

第

7

章 斗

s i l l

、 斗

M

遺 伝 子 と 括 抗 的 作 用 を 持 つ と 考 え ら れ る ヰ 込 遺 伝 子

7 0  

第

l

節

z f i A 1 3 :   : T n 1 0

挿 入 変 異

7 0  

^{引 用 文 献}

1 1 6  

第

2

節

z f i A 1 3 :  : T n 1 0

変 異 の マ ッ ピ ン グ

7 0  

第

3

節

玉 ム A 1 3 : : T n

lQ変異を相補する

D N A

断 片 の ク ロ ー ニ ン グ

7 1  

第

4

節

z  f  i  A

遺 伝 子 領 域 の 塩 基 配 列 の 決 定

7 3  

第

5

節

z  f  i  A

遺伝子と

Zf  i  A

蛋 白 質 の 同 定

7 3  

第

8

章 ア ミ ノ 酸 配 列 か ら 推 測 さ れ る

T l d D

、

T l d E

、 お よ び

Z f i A

蛋 白 質 の

性 質

8 3  

第

1

節 ア ミ ノ 酸 配 列 か ら 予 測 さ れ る

T l d D

、

T 1 

日、

Z f i A

蛋 白 質

の 構 造

8 3  

第

2

節

T  1  d D

蛋白質と

T l d E

蛋白質の類縁￨生

8 3  

第

3

節 類 縁 蛋 白 質 の 検 索

8 3  

第

9

章

t  1  d D

、

t 1  d  E

及 び

z f i A

遺 伝 子 の 生 理 的 機 能

第

1

節 斗Jill、斗止

E

遺 伝 子 の 遺 伝 子 破 壊 株 の 作 製

第

2

節 遺 伝 子 破 壊 株 の 性 質

第

3

節 斗Jill、斗且

E

、立弘、

ιlli

変 異 と 斗 込 変 異 の

2

重 変 異 株 の 性 質

ハH

U

ハH u n

ノ臼

n u u n u U A U U  

9 6  

第

10

章 総 括 お よ び 考 察

第

l

節 斗

d D

、 斗

s l i

遺 伝 子 に つ い て

1 0 0   1 0 0  

円ノU 円ぺU

本 論 文 に に 用 い た 省 略 記 号

A p R   b p   C r nR  D A P I  

E R I C   s e q u e n c e  

k b   K r nR  1  e  t  O R f   P C R  

R E P   s e q u e n c e   S p R  

T cR  t  1  d 

第

1

章 序 論

a r n p i c i l l i n   r e s i s t a n t   b a s e   p a i r  

c h l o r a r n p h e n i c o l   r e s i s t a n t   4 '  

，

6 ‑ d i  a r n i n o ‑ 2 ‑ p h e n y l  i n d o   l e  

E n t e r o b a c t e r i a l   R e p e t i t i v e   I n t e r g e n i c   C o n s e n s u s   s e q u e n c e s  

1 0

³ 

b a s e   p a i r s   k a n a r n y c i n   r e s i s t a n t   l e t h a l   r n u t a t i o n   o p e n   r e a d i n g   f r a r n e  

p o l y r n e r

乱

s ec h a i n   r e a c t i o n  

R e p e t i t i v e   E x t r a g e n i c   P a r i n d r o r n i c   s e q u e n c e   s p e c t i n o r n y c i n   r e s i s t a n t  

t e t r a c y c l  i n   r e s i s t a n t  

t o l e r a n c e   t o   l e t D   p r o d u c t   g r o w t h   i n h i b i t i o n  

大 腸 菌 に は 、 性 を 決 定 す る い わ ば 性 染 色 体 と も い う べ き

F

因 子 が 存 在 する。

F

因 子 は 約

9 5

，

0 0 0

塩 基 対 の 環 状

2

本 鎖

D N A

で 、 こ の う ち

9 1 0 0

塩 基 対 の 大 き さ の

E c o R I f 5

断 片 領 域

( r n i n i ‑ f

領 域 ) 上 に

D N A

複 製 や 宿 主 細 胞 と の 相 互 作 用 に 関 与 す る 遺 伝 子 群 が 存 在 す る 。

F

因子は細胞当り

1 ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ 2

コ ピ ー し か 存 在 し な い に も か か わ ら ず 細 胞 分 裂 に 際 し 非 常 に 安 定 に 保 存 さ れ る 。 こ れ は 複 製 遺 伝 子 旦 旦

E

( M a k i

位 主

1 .

，

1 9 8 3

，辿iJi

1 9 8 4 )

の左側に江旦(̲c̲c̲坐)、 足 並 ( ヰ 必 ) 遺 伝 子

( B e xt l

叫.，

1 9 8 3 ;   K a r o u i

弘 主

1 .

^，

1 9 8 3 ;   O g u r a   &  H i r a g a

， 

1 9 8 3 1 2 ;   M i k i

旦

1 U.

， 

1984~ ， 12; S o r n r n e r

弘 主

1 .

，

1 9 8 5 )

、 右 側 に 旦 品 、 組 必 ( 辻

l s )

、 出̲c̲Q遺伝子

( O g u r a

& 

H i r a g a

， 

1983~; M i k i

未 発 表 ) が 存 在 し ( 図 卜 1 ) 、 複 製 の 終 了 し た

D N A

を 娘 細 胞 に 分 配 す る な ど の 機 構 に よ り 子 孫 へ の

D N A

分 子 の 伝 達 を 保 証 し て い る た め と 考 え ら れ て い る 。

1  e  t  A

遺伝子、与1Q遺伝子は、

r e s D

遺 伝 子 と 共 に 一 つ の オ ぺ ロ ン を 構 成 し て お り 、 こ の う ち

l e t D

遺 伝 子 産 物 は 宿 主 菌 の 染 色 体 分 配 及 び 細 胞 分 裂 を 阻 害 す る 活 性 を

( M i k i e t   a l .

， 

1 9 8 4 b ;   J a f f e   e t   a l .

， 

1 9 8 5 )

、

1 e  t  A

遺 伝 子 産 物 は 注 旦 遺 伝 子 産 物 の 活 性 を 抑 え る 機 能 を 有 す る

( K a r o u i tlU .

， 

1 9 8 3 ;   O g u r a

を

H i r a g a

， 

1 9 8 3 1 2 ;   M i k i   tlι.

， 

1 9 8 4

主) (図卜

2 )

。比比、ltl̲Q遺伝子の細胞内 で の 生 理 的 機 能 に 関 し て は

2

つ の 仮 説 が 提 出 さ れ て い る 。 一 つ は

M i k i

ら (

1 9 8 4  

主)の

t e r r n i n a t i o n p r o t e i n

モデjレ と で も い う べ き も の 、 も う 一 つ は

J a  f f   e

ち

( 1 9 8 5 )

の

n o n ‑ v i a b l e s e g r e g a n t

モデルである。

F

因子、

C o1 1

因子、

P l

フ ア ー ジ な ど の プ ラ ス ミ ド の

D N A

複 製 を 阻 害 す る と 、 大 腸 菌 の 染 色 体

D N A

の 複 製 を 阻 害 し た 場 合 と 同 じ よ う に 、 宿 主 菌 の 細 胞 分 裂 が 妨 げ ら れ る

( M o n k

，

1 9 6 9 ;   M a c   Q u e e n   &  D o n a c h i e

， 

1 9 7 7 ;   O g u r a   &  H i r a g a

， 

1 9 8 3 1 2 ;   M i k i t l   ̲ l i . .   1 9 8 4

主)0 

F 

因子の場合、 こ の 現 象 は 江 弘、与1Q遺伝子により制御されている

( O g u r a & 

H i r a g a .   1 9 8 3 1 2 ;   M i k i   t l 込 . . 1 9 8 4 1 2 )  

⁰ 

M i k i

ら の 考 え は 、 大 腸 菌 細 胞 周 期 に お い て 細 胞 分 裂 が 起 こ る に は 染 色 体

D N A

複 製 が 終 了 す る こ と が 必 要 で

( H e l r n s ‑ t e t t e r  

& 

P i e r u c c i .   1 9 6 8 ;   C l a r k .  1 9 6 8 )

、 分 裂 開 始 は 染 色 体

D N A

複 製 終 了 に よ り つ く ら れ る

R N A

及 び 蛋 白 質 に 依 存 し て い る と い う

t e r r n i n a ‑ t i o n p r o t e i n

モ

a4  r hυ  

40 

Eco  RIBa

斤1

H I  

45 

Bam  H I   Pst I  Pst  I  Pst  I  Pst I  Eco  R I  

^'喝

d ︐

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J ' e r ︐ a

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J ' ︐ . .

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， 

4

炉

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・

1

4  o r i ‑ 2  

I  I  口 口 E 二 コ

l e t A   resO 

l e t O  

分 離 ?

E ・ コ

^{E 11} 

^1‑

repE  sopA  sopB/ / e t B   •

， 

l  l 

複製 分 配 ?

ジ ^r

^与

^{ー 一 一 一 ー ー /}

図 1 ‑ 1 F 因子 m i n i ‑ F 領域￨こ存在する F 因子複製及び安定保持に関与する遺伝子群 F 因子 m i n i ‑ F 領域を示した。矢印は、複製開始点とその方向を示している。口は、

遺伝子を示している。

図1 ‑ 2 F 因子 / e t A (am) 変異株による染色体分配及ひ

^e

細胞分裂の阻害 受容菌として、 KP77 を用いた。供与菌としては、 (A)KP75(F13

・

1 ) 、 (B)KP75(KPF14) を用いた。供与菌及び受容菌は 3rc 、 C ‑ b r o t h て'対数増 殖期まで培養した。接合は、供与菌 0 . 8 m l と受容菌 O . 4 ml を混合、 60 分 間振とうすることにより行った。 1ml の接合混合液 i こ 0.1ml の T6 ファー ジ C 7 . 8 x 10 1 1   I m l ) を加えて、 3rC10 分保ち、供与菌を殺した後、

C‑broth 寒天平板にスポットし、 3rC120 分間保った。その後、核染色 を行い顕微鏡写真を撮影した。

‑ 6 ‑ ‑ 7 ‑

デ ル

( J o n e s &  D o n a c h i e ，  1 9 7 3 )

と基本的に同じ考えで、

F

因 子 の 複 製 が 行 わ れ て 細 胞 当 り

2

個の

F

因子

D N A

が 存 在 す る こ と が 細 胞 分 裂 が 起 こ る た め に 必 要 で あるという考えである。 細 胞 当 り プ ラ ス ミ ド

D N A

が

l

分子になった細胞では、

細 胞 分 裂 が 阻 害 さ れ て フ ィ ラ メ ン ト 状 の 細 胞 に な る こ と に な る 。 こ れ に 対 し 、

J  a  f  f  e

ら

( 1 9 8 5 )

の 考えは、プラスミド

D N A

の 複 製 を 阻 害 し た 場 合、 細 胞当 り プ ラ ス ミ ド

D N A

が

l

分 子 に な っ て も 細 胞 は 分 裂 可 能 で 、 分 裂 に よ っ て 生 じ た プ ラ ス ミ ド を 失 っ た 細 胞 の 分 裂 が 阻 害 さ れ て 死 に 至 る と い う 考 え で あ る 。 現 在 、 後 者 の 仮 説 が 広 く 受 け 入 れ ら れ て い る が 、 そ の 分 子 機 構 は ま だ 明 ら か に な っ て い な し斗。

ニットをコードする孟

m

遺伝子が関与することを明らかにしている。

M i  k  i

らが、

こ の 様 な 温 度 感 受 性

L e t D

耐 性 変 異 株 に 限 っ て 研 究 を 行 っ た の は 、 こ の よ う な 株 しかクローン化や遺伝解析ができなかった為であり、

L e t D

耐 性 変 異 株 の

99%

以 上 を 占 め る 増 殖 が 温 度 非 感 受 性 の 株 は 、 解 析 す る こ と が 出 来 ず に 残 さ れ て い た 。

私は、本研究において、 注1]遺伝子による染 色 体 分 配 及 び 細 胞 分 裂 阻 害に関与する全ての遺伝子を同定し、

i

旦1]遺伝子による阻害 の 分 子 機 構 を 明 ら か に す る こ と を目 標 に 研 究 を 行った。このため、

L e t D

耐性変異株中、

99%

以 上 を 占 め る 温 度 非 感 受 性 変 異 株 に つ い て の 解 析 を 行 い 、 と れ ら の 変異 が、 こ れ ま で 報 告 さ れ て い な い 新 し い 遺 伝 子

t l d D

、

ι 止 E

に生じた変異であることを明らか に す る と 共 に 、 こ れ ら斗且

D

、斗̲M遺伝子と措抗的に働いて

L e t D

蛋 白 質 作 用 を 調 節 す る と 考 え ら れ る 新 し い 遺 伝 子

z f i A

を 見 い だ し た 。 新 し く 見 い だ さ れ た こ れ ら 遺 伝 子 ば か り で な く 、 既 に 報 告 さ れ て い る

g y r A

、

g r o E S

、

g r o E L

遺 伝 子 産 物 を 含 め て 、 辻 1 ] 遺 伝 子 産 物 に よ り ど の よ う な 機 構 で 宿 主 菌 染 色 体 の 分 配 の 阻 害 が 行 わ れ る と 考 え ら れ る か と 言 う 点 に つ い て 考 察 す る 。

F

因 子 上 に コ ー ド さ れ た 辺 白 遺 伝 子と 宿 主 大 腸 菌 の 遺 伝 子 が 、 こ の よ う な高次のネッ トワークを形 成 し て い る こ と を 見 い だ し た の は 本 研 究 が 初 め て で あ る 。

私 は 、 足 並 遺 伝 子 に よ る 染 色 体 分 配 ・ 細 胞 分 裂 阻 害 の 分 子 機 構 を 解 明 す る こ と に よ り 、 細 胞 に お け る 染 色 体

D N A

複 製 か ら 染 色 体 分 配 、 細 胞 分 裂 に お け る 共 役 の 分 子 機 構 の 解 明 の 糸 口 を つ く る こ と が で き る と 考 え 、 本 研 究 に 取 り 組んだ。担̲ul遺伝子による染色体分配及び細胞分裂の阻害がどの様な機構で行 わ れ て い る か の 分 子 機 構 を 解 明 す る に は 、 ま ず 、 ど の 様 な因 子 が 関 与 している のかを見つけ出すことが重要である。 このために、

L e t D

蛋 白 質 が 作 用 する蛋 白質、 あ る い は 遺 伝 子 ( 本 論 文 で は 標 的 蛋 白 質 、 遺 伝子と記すこ と に す る ) を 見つ け る 一 つ の 遺 伝 学 的 方 法 と し て 、 サ プ レ ツ サ 一 変 異 株 を 分 離 す る こ と と し た 。 も し

L e t D

蛋 白 質 に 標 的 蛋 白 質 が 存 在 す る な ら ば 、 標 的 蛋 白 質 を 変 異 さ せ た 株 の 中 に は

L e t D

蛋 白 質 に よ る 阻 害 作 用 を 受 け な く な る 様 に 標 的 蛋 白 質 が 変 化 し たものもあると思われる。このような変異株は、

F

因子

l t l 主

(am)変 異 株 を 導 入 し て ( 江 山 遺 伝 子 を 発 現 さ せ て ) も

、 L e t D

蛋 白 質 に よ る 増 殖 限 害 を 受 け ず 生 存 で き る こ と が 予 怨 さ れ る 。 こ の よ う な 大 腸 菌 変 異 株 を 分 離 し 、 変 異 を 生 じ た 遺 伝 子 を 同 定 し て や れ ば、 標 的 蛋白質を見いだすことができるはずである。

Mi k  i 

ら

( 1 9 8 8

、

1 9 9 2 )

は、一つの変異によって担1]遺伝子に耐性になるのと同時に 増 殖 が 高 温 感 受 性 に な る 変 異 株 、 す な わ ち 許 容 温 度

( 2 8

⁰

C )

において、

L e t D

蛋 白 質 の 作 用 点 と し て の 活 性 は 失 っ て い る が 、 本 来 の 分 配

・

分 裂 蛋 白 質 と し て の 機 能 は 保 持 し て い る よ う な 変 異 株 に 限 っ て 解 析 を 行 い 、 蛋 白 質 の 折 り 畳 み に 関 与 す る 分 子 シ ャ ペ ロ ン を コ ー ド す る

ι

立医、紅立弘遺伝子

( M i k i t l ! l ̲   ， . 1 9 8 8 ;  

辻iJ

L 1 9 9 2 )

、

D N A

ジ ャ イ レ ー ス ( 大 腸 菌 の ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ

1 1 

)の

A

サ ブ ユ

円 ︒

_{n u υ}  

第

2

章 実験に用いた斗̲c1変異株

第

l

節 斗益変異株分離の考え方

能 で あ っ た た め 、 既 に 解 析 が 行 わ れ 、 分 子 シ ャ ペ ロ ン を コ ー ド す る

ι

旦盤、孟工旦

E L

遺伝子、

D N A

ジャイレースの

A

サ ブ ユ ニ ッ ト を コ ー ド す る 立 日 遺 伝 子 に 変 異 を 持 つ こ と が 明 ら か に さ れ て い る

O i i k i t l   t l . .   1 9 8 8 ;

斗j̲Q

1 9 9 2 )

。

本 研 究 に お い て 、 私 は 分 離 さ れ た

L e t D

耐性(斗Ji)変異株のうち大部 分 を し め る 増 殖 が 温 度 非 感 受 性 の 変 異 株 の 解 析 を 行 っ た 。 斗益変異株の内

9 9 . 5

% を し め る 温 度 非 感 受 性 変 異 株 は 選 択 に 使 用 可 能 な 表 現 型 が な く ク ロ ー ン 化 す る こ と が 困 難 で あ っ た た め 解 析 さ れ ず に 残 さ れ て い た も の で あ る 。 図

2 ‑ 1

に 代 表 的 な 温 度 非 感 受 性 斗

A

変異菌細胞に、

F

因 子 民 以

( a

皿)変異株

( K P f l 4 )

を 接 合 に よ り 導 入 し た 場 合 の 顕 微 鏡 写 真 を 示 し た 。 野 生 型 大 腸 菌 に 導 入 し た 場 合 に は 染 色 体

D N A

分 配 と 細 胞 分 裂 が 阻 害 さ れ て フ ィ ラ メ ン ト 状 の 細 胞 を 形 成 す る が 、

i l l

変 異 株 に 導 入 し た 場 合 に は 増 殖 阻 害 を 受 け ず に 、 正 常 に 分 配 ・ 分 裂 を 行 い 得状の細胞を形成する。 表

2 ‑ 1

には、

F

因 子 比 比

( a r n )

変異株を大腸菌野生株、

斗益変異株に接合により導入した場合の接合体形成の結果を示した。 野 生 型 大 腸 菌 に 導 入 し た 場 合 に は 、 受 容 菌 の ほ と ん ど が 殺 さ れ て い る ( 生 存 菌 の ほ と ん どは

F

因子を受け取らなかった受容菌)のに対し、 t

1  d

変 異 菌 の 場 合 に は

F

因 子 比 比

( a r n )

変 異 株 導 入 に よ っ て 受 容 菌 が 殺 さ れ る こ と は な く 、 正 常 に

L a c .

接 合 体(脚注)を形成できる。

表

2 ‑ 2

に、本研究で用いた変異株を、 こ れ ま で に 解 析 さ れ た 変 異 株 と 共に示した。これらの中には、

1

)温度非感受性として分離されたもの、

2 )

も

ともと、 増 殖 が 高 温 感 受 性 の 斗

A

変 異 株 と し て 分 離 さ れ た が 、 増 殖 の 高 温 感 受 性と

t1  d

変 異 が 別 の 遺 伝 子 に よ る こ と が 明 ら か に な っ た も の ( 長 尾

1 9 8 8 )

、 あ るいはその可能性が考えられるもの、

3 )

トランスポゾン

T n 1 0

の 挿 入 に よ り 得 られたもの、が含まれる。

野 生 型 大 腸 菌 に 江 日

( a r n )

変 異 を 持 つ

F

因子を接合により導入した場合、

接 合 体 細 胞 中 で

L e t A

蛋 白 質 が 合 成 さ れ ず 、 そ の 結 果 と し て 、 宿 主 大 腸 菌 は

L e t D

蛋 白 質 の 作 用 に よ り 染 色 体 分 配 阻 害 及 び 細 胞 分 裂 阻 害 を 受 け 、 フ ィ ラ メ ン ト 状 に な り 死 に い た る 。 も し

L e t D

蛋 白 質 が 染 色 体 分 配 ・ 細 胞 分 裂 に 必 須 な 宿 主 菌 の

D N A

あ る い は 蛋 白 質 に 作 用 し て 増 殖 阻 害 を 引 き 起 こ し て い る の で あ れ ば 、 こ の 機 な

D N A

領 域 、 あ る い は 蛋 白 質 に 変 化 が 生 じ

L e t D

蛋 白 質 の 作 用 を 受 け な く な っ た 変 異 株 が 存 在 す る こ と が 期 待 さ れ る 。 こ の 様 な 変 異 株 は 江 凶 変 異 を 持 つ

F

因 子を導入しても、

L e t D

蛋 白 質 の 作 用 を 受 け る こ と な く 増 殖 で き る で あ ろ う 。 従 って、

F

因 子 比 込

( a r n )

変 異 (

L  e  t  0

蛋 白 質 ) に よ る 増 殖 回 害 を 受 け な く な っ た 大 腸菌変異株を分離すれば、

L e t D

蛋 白 質 の 標 的 、 あ る い は

L e t D

蛋 白 質 作 用 に 関 与 する遺伝子を同定可能と思われる。

また、特に、

L e t D

蛋 白 質 が 宿 主 菌 の 蛋 白 質 に 作 用 し て い る 場 合 に は 、

L e t D

耐 性 変 異 株 中 に 同 時 に 増 殖 が 温 度 感 受 性 に な っ た も の 、 す な わ ち 、

L e t D

蛋 白 質 の 作 用 点 と し て の 活 性 は 失 っ て い る が 、 本 来 の 分 配 ・ 分 裂 蛋 白 質 と し て の 機能を

2 8

⁰

C

では保持しているが、

4 2

⁰

C

で は 失 う 変 異 株 が 存 在 す る こ と が 期 待 さ れ る 。 こ の 様 な 変 異 株 は 、 温 度 感 受 性 を 指 標 に 遺 伝 解 析 を 行 い 易 い と い う 利 点 が考えられる。

第

2

節 本研究に用いた斗益変異株

上 述 の 考 え に 基 づ き 、 三 木 ら は 、 大 腸 菌

K P 2 4 6

株 お よ び

K P 4 1 2 1

株 を 変 異誘起剤処理したものの中から、

F

因 子 江 且

( a r n )

変 異 株 に 耐 性 に な っ た 大 腸 菌 変異株(斗昼

=lo1erant t o   l e t D   p r o d u c t   g r o w t h   i n h i b i t i o n

と 命 名 ) を 分 離 した。このうち、

ι

丘 変 異 を 生 じ た 株 で 同 時 に 増 殖 が 温 度 感 受 性 と な っ た も の に つ い て は 、 増 殖 の 高 温 感 受 性 を 指 標 と し て 遺 伝 子 を ク ロ ー ン 化 す る こ と が 可

[脚注] 本 実 験 に は

F 1 3 ‑ 1

と 呼 ば れ る 大 腸 菌 の 斗 ど 遺 伝 子 を プ ラ ス ミ ド 上 に 組 み 込 ま せ た

F

因 子 、 お よ び そ の 変 異 株 を 用 い た 。 受 容 菌 細 胞 に 斗

f

変 異 株 を 使 用 す れ ば 、 ラ ク ト ー ス 発 酵 性 の 有 無 に よ っ て

F

因 子 を 保 持 し て い る か 、 否 か を 簡便に検定出来るからである。

‑ 1 0 ‑ l 

^‑EE'A 

F

因子担lA

( a m )変異株導入による野生型大腸菌の増殖阻害 とt !  d 変異による回復

表 2 ‑ 1

供与菌

K P 4 0 7 4 ( K P f 1 4 )  

生存菌 /1 0 0 受容菌 遺伝子型

9 7   9 9   3 9 0  

2 7 0   9 9  

9 7   1 0 0   3 7 0  

3 9 0   3 3 0   w i  !  d  t  y p e  

t ! d ‑ 3  t ! d ‑ 5 0   K P 2 4 5  

K P 6 2 4  K P 4 6 8 8  

K P 4 0 7 4 ( f 1 3 ‑

l)、

K P 4 0 7 4 ( K P f 1 4 )

を供与菌、

K P 2 4 5

、

K P 6 2 4

、

K P 4 6 8 8

を受容菌として

用いた。供与菌、受容菌は

C ‑ b r o t h

、

3 7 . C

で対数増殖期まで培養した。 接合は供 与 菌

1 . 0 m !

と受容菌

O . l m !

を混合

6 0

分間振還することにより行った。接

合後

、

0 . 0 5 m ! の接合

混合液に

O . 4 5 m !

の

T 6

ファージ

( 5 x 1 0

^1日

1 m !

^{)を加えて、}

3 7 . C 1 5 分保ち 供 与菌

を殺 した

後、マツコンキーラクトース

寒天培地に塗布、 3 7 . C

一夜培養した。

L a c +

、

L a c ‑ 菌 を 計

数、生菌数と

L a c +

接合体の割合を算出した。生存菌 数 は 接 合

開始時の受容 菌 1 0 0 個当

りの数で示した

。

‑ 1 3 ‑

︒

H 3

回芯叫肺門総括一踏ユヒ

ω m

眠

一

い剖 縦揺 いド ゎ選 リ一 刻・ 沢

Q

寸

(

の合

)℃

コ同

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睦EhhONFO

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械工

VO

﹂ ♀

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﹂材 料出 町岡 内判 巡︐ m w 越

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l h h

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・↑ 掴峠 悲︐ 吋一 句出 掛︒ け科

︑) 梢如 刊わ ド尚 蜜模 型紙 夜︑ い工 戸

O﹂ ♀

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︐O

︒

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同一

駒山

m b

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寸門

泣

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ギミ)↑F

ド 寸 仏 ﹀

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L X (

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ν J U州掴 駒山

m︒

μ f J E W (

寸正 門泣

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︐ ν J 心 個 峠 巡

出 [

一 弘

治 ︑

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Uリ

一隊 側も

EQ

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州N

市れ

国民

b

票

d

岡 山 岡 市

mA

品川WN

明治

︑

以u

リ一 件担

QS

姻

↑ ︐

N図

L a c + 接 合 体 /1 0 0 生 存 菌 K P 4 0 7 4 ( f 1 3 ‑ 1 )  

生存菌 /1 0 0

受容菌

L a 仁接合体 /1 0 0 生存菌 受 容 菌

+叶例)リV

" 

円. 4

11ゐ

+叶開U

U

表

2 ‑ 2

変異原 文 献

高温

親 株

感受性

l e t A  

耐性

R e c A

株

R e c .

株

変 異 遺 伝 子 実験に用いた t

I  d

変異株

未 発 表 未 発 表 未 発 表 未 発 表 未 発 表 未 発 表 未 発 表 未 発 表 未 発 表

Ihr'thr'﹃

kp

a‑

‑k

ドa '

小・氷川目+や+やふやし十小+fムや+・小十・小﹄kドht'tnh'tthr'fhrl

2 ‑ 7

ミ/7 リン

2 ‑ 7

ミ

/ 7 。

リン

2 ‑ 7

ミ

/ 7 。

リン

2‑7U

プリン

2 ‑ 7

ミ

/ 7

リン

2 ‑ 7

ミ/プリン

2 ‑ 7

ミ/7 リン

2 ‑ 7

ミ/7 リン

2 ‑ 7

ミ/7リン

T s ‑ 4 6   K P 4 1 2 1  

T s .   K P 4 1 2 1  T s .   K P 4 1 2 1   T s

^令

K P 4 1 2 1 T s .   K P 4 1 2 1   T s +   K P 4 1 2 1   T s .   K P 4 1 2 1   T s +   K P 4 1 2 1   T s +   K P 4 1 2 1  

nH

Un

民n

民 門 托 門 氏

nknH凶n民

n HU

K P 4 6 6 8   K P 4 6 6 9   K P 4 6 7 1   K P 4 6 7 2   K P 4 6 7 3   K P 4 6 7 4   K P 4 6 7 5   K P 4 6 7 6   K P 4 6 7 0   K P 4 6 8 4  K P 4 6 8 5   K P 4 6 8 6   K P 4 6 8 7   K P 4 6 8 8   K P 4 6 8 9   K P 4 6 9 0   K P 4 6 9 1   t l d ‑ 4 6  

t 

I  d  ‑ 4  7 

t 

I  d  ‑ 4 8  

t 

I  d  ‑ 4   9  t l d ‑ 5 0   t l d ‑ 5 1   t l d ‑ 5 2   t l d ‑ 5 3   t l d ‑ 5 4   R e c A

株

R e c +

株 遺 伝 子 変 異

未同定 文 献

親 株 変異原

局温

感受性

l e t A  

耐性

1 9 8 8   1 9 8 8   M i k i旦 a

l.，

M i k i   t l

主

1 .

，  長尾，

1 9 8 8  

長尾，

1 9 8 8  

長尾，

1 9 8 8  

長尾，

1 9 8 8  

長尾，

1 9 8 8   2 ‑ 7

ミ/プリン

2‑7U7 

リン

2 ‑ 7

ミ/プリン

2 ‑ 7

ミ/7リン

2 ‑ 7ミ / 7

リン

2 ‑ 7

ミ/7リン

2‑7U7 

リン

K P 2 4 6  

K P 2 4 6   K P 4 1 2 1   K P 4 1 2 1   K P 4 1 2 1   K P 4 1 2 1   K P 4 1 2 1   T s A  

T s A   T s A   T s A   T s A   T s A   T s A  

n民

nH

Un

民 円

HunHUn民

n HU

K P 3 0 3 8   K P 3 4 3 5   K P 4 1 6 1   K P 4 1 6 3   K P 4 1 6 5   K P 4 1 6 6   K P 4 1 7 0   K P 3 4 3 7  

K P 4 2 3 1   K P 4 2 3 2   K P 4 2 3 4   K P 4 2 3 5   K P 4 2 3 7   t  I d A 6  

t l d A 9   t l d A 2 1   t l d A 2 3   t l d A 2 5   t l d A 2 6   t l d A 3 0   ιoES 

M i k i

弘 主

1 .

，

1 9 9 2   1 9 9 2   1 9 9 2   1 9 9 2  

弘 主

1 .

， 

t l  

̲ti.， 

t l   ̲ t i . ，   M i k i   M i k i   M i k i   2 ‑ 7

ミ/プリン

2 ‑ 7

ミ/7。リン

2‑7U7 

リン

2 ‑ 7

ミ)70リン

K P 4 1 2 1  

K P 4 1 2 1   K P 4 1 2 1   K P 4 1 2 1   T s B  

T s f   T s f   T s f   R 

n民n

れ 門 氏

K P 4 1 6 9   K P 4 1 5 2   K P 4 1 5 5   K P 4 3 5 7   K P 4 2 3 6  

K P 4 2 2 0   K P 4 2 4 0   t l d B 2 9  

t l d C 1 2   t  1  d C   1 5   t l d C 3 6   ιoEL 

紅工主

ニトロソゲアニ

γ ン三木

未 発 表

2‑7U7

。リン 長尾，

1 9 8 8   2

ーた /7。リン 長尾，

1 9 8 8   2 ‑ 7

ミ

/ 7

⁰リン 長 尾，

1 9 8 8   2 ‑ 7

ミ)7。リン 長尾，

1 9 8 8   2

ーだ /7。リン 長尾，

1 9 8 8   2 ‑ 7

ミ

/ 7

⁰ンリ 長尾，

1 9 8 8   2‑7U7

。リン 長尾，

1 9 8 8   2‑7U7

。リン 長尾，

1 9 8 8   2 ‑ 7

ミ/7。リン 長尾，

1 9 8 8   2 ‑ 7

ミ/7。ンリ 長尾，

1 9 8 8  

トランスホ。

f

^{ン 長尾，}

1 9 8 8  

トランスホ。

f

^ン 長尾，

1 9 8 8  

トランスホ。

γ

ン 長尾，

1 9 8 8  

トランスホ。ソツ 長尾，

1 9 8 8   2 ‑ 7

ミ/7。リン 朴 未 発 表

2 ‑ 7

ミ/7。ンリ キト未発表

2 ‑ 7

ミ)7。リン キ卜 未 発 表

2‑7U7

。リン キト未発表

2 ‑ 7

ミ

/ 7

。リン キト 未 発 表

2‑7U7

リン 朴 未 発 表

2 ‑ 7

ミ)7。リン 朴 未 発 表

T s +   K P 2 4 6  

T s ‑ 1 1   K P 4 1 2 1   T s E 1 3   K P 4 1 2 1   T s 0 1 4   K P 4 1 2 1   T s C 1 6   K P 4 1 2 1   T s 0 1 7   K P 4 1 2 1   T s 0 1 8   K P 4 1 2 1   T s C 1 9   K P 4 1 2 1   T s G 2 0   K P 4 1 2 1   T s ‑ 2 4   K P 4 1 2 1   T s G 2 8  K P 4 1 2 1   T s .   K P 7 7   T s .   K P 7 7   T s +   K P 7 7   T s .   K P 7 7   T s .   K P 4 1 2 1   T s .   K P 4 1 2 1   T s .   K P 4 1 2 1   T s .   K P 4 1 2 1   T s +   K P 4 1 2 1   T s

^令

K P 4 1 2 1 T s +   K P 4 1 2 1  

n民nknknHunkn

れ 門 氏

nknHunH凶n民nHunkn

れ 門 氏 門 氏

nれ

門 氏

n氏

nH

un

HU

n民

K P 6 1 8   K P 4 1 5 0   K P 4 1 5 3   K P 4 1 5 4   K P 4 1 5 6   K P 4 1 5 7   K P 4 1 5 8   K P 4 1 5 9   K P 4 1 6 0   K P 4 1 6 4   K P 4 1 6 8  

K P 4 6 6 1   K P 4 6 6 2   K P 4 6 6 3   K P 4 6 6 4   K P 4 6 6 5   K P 4 6 6 6   K P 4 6 6 7   K P 6 2 4  

K P 4 2 2 1   K P 4 2 2 3   K P 4 2 2 5   K P 4 2 2 7   K P 4 2 2 8   K P 4 2 2 9  

K P 4 3 8 0   K P 4 3 8 3   K P 4 4 8 6   K P 4 4 8 7   K P 4 6 7 7   K P 4 6 7 8   K P 4 6 7 9   K P 4 6 8 0   K P 4 6 8 1   K P 4 6 8 2   K P 4 6 8 3  

t 

1  d ‑ 3  

t l d ‑ l l   t l d ‑ 1 3   t l d ‑ 1 4   t l d ‑ 1 6   t l d ‑ 1 7   t l d ‑ 1 8   t l d ‑ 1 9   t l d ‑ 2 0   t l d ‑ 2 4   t l d ‑ 2 8   t l d ‑ 3 1   t  I d ‑ 3 2  

t 

1  d  ‑ 3 3   t l d ‑ 3 4   t  I d ‑ 3 9   t l d ‑ 4 0   t  1  d  ‑ 4 1   t l d ‑ 4 2  

t 

1  d  ‑ 4 3   t  I d ‑ 4 4   t l d ‑ 4 5  

未同定

F﹁U1EA 

‑ 1 4 ‑

各種挿入変異との連関性による t

1  d

変異の分類 表

3 ‑ 1

ト ラ ン ス ポ ゾ ン ・ タ ギ ン グ 法 を 用 い た

l l i

遺 伝 子 近 傍 の 染 色 体

D N A

のク 第

3

章

ロ ー ニ ン グ

T c

^R、

K m

^R耐性と

T l d +

表現型の同時形質導入頻度(%)

新 し い

t 1  d

遺 伝 子 の 存 在 受容菌 第

1

節

供与菌

K P 5 2 5 4   叫上 l Q :  :  T n l 0   K P 5 2 5 3  

2 仁̲@

:  :  T n l 0   K P 5 2 5 2  

z h a ‑ 1 4   :  : T n   1 0  

則一

7

山

M

附

y

一 a

: (

刊 出 一 知

解析されずに残されていた増殖が温度非感受性の斗益変異株が、旦工工主、 変異

あ る い は 未 知 の 新 し い 遺 伝 子 に 変 異 を 虹立弘遺伝子に変異を持つのか、

ι o   E S

、

生 じ た 結 果 斗 丘 変 異 と な っ た の か を 確 認 す る こ と が ま ず 必 要 で あ る 。 この点を

5 0   K P 3 4 3 7  

旦辺監

(斗品 Q )

立工主遺伝子と

30%

連 関 し た

A

大 腸 菌 染 色 体 上

4 8

分に位置する 検討するため、

ι i l l

遺

9 4

分に位置する紅旦盤、

︑︑ ︑

a︐〆η

ノ臼 ハ吋

un u υ

'EEE   

a d a ‑

斗主:: 

K m

挿 入 変 異

0 1 i k i t l   U.

， 

3 0   K P 4 2 4 0   位且

(斗並lQ) 温 度 非 感

1 9 8 8 )  

伝子と

50%

連関したむ且二斗:: 

T n

辺 挿 入 変 異 が

( M i k i t l

斗.， 

6 9   。

8 6   9 6   9 6   1 0 0   9 3   9 5   9 5  

。 。

t l d ‑ 1 3   t l d ‑ 1 9   t l d ‑ 3 9   t l d ‑ 4 0   t l d ‑ 4 7   t l d ‑ 4 8   t l d ‑ 5 0   K P 4 2 2 1  

K P 4 2 2 9   K P 4 6 7 7   K P 4 6 7 8   K P 4 6 8 5   K P 4 6 8 6   K P 4 6 8 8  

すなわち孟工工主、

ι

♀匹、

受性変異株の持つ斗益変異と同時形質導入されるか否か、

調 べ た 表

3 ‑ 1

に示したように、

且旦

1 1

遺伝子近傍に位置するか否かを検討した。

い ず れ も カ

K P 4 6 8 8

株の

t I  d

変異は、

K P 4 6 7 7

、

K P 4 2 2 7

、

K P 6 2 4

^、

4

株 の 斗

A

変異株、

テトラサイクリン耐性と同時形質導入されなかった。 この結 ナマイシン耐性、

こ れ ら 変 異 株 が 立 込 、

ι i l l

、

ι

♀弘遺伝子ではない新しい

t I  d

遺 伝 子 に 果は、

ハHu

n uv  

・4

tEa

。

'

5 4   。

。 。

温 度 非 感 受 性 斗

A

変 これら

4

株の変異株を、

変異を持つことを示すものである。

異株の代表として以後の実験に用いた。

1 0 0   6 7  

7 3   2 4  

1 7  

。 。

。 。

t 

I  d ‑ 3   t l d ‑ 1 7   K P 6 2 4  

K P 4 2 2 7  

P l

形質導入は、

S i  1  h a  

vyら(1

9 8 4

)の方法に従って行った。供与菌中で集積した

P l

フ アージを用いて受容菌に形質導入し、テトラサイクリン耐性、あるいはカナマイシン耐 性形質導入体コロニーを得た。得られた形質導入体における斗

f

組み換え体の出現頻度 を、

K P 7 5( K P f 1 4 )

を供与菌とした平板接合法により調べた。

トランスポゾン・タギング法 第

2

節

上 述 の 新 し い 斗

A

遺伝子を

F

因 子 江 込

( a m )

変 異 株 耐 性

( T l d

表 現 型 )を ポ ジ テ ィ ブ な 選 択 手 段 が な クローン化することは、

指標にマッピングしたり、

そこで新たに、

T n l

立 を 用 い た ト ラ ン ス ポ ゾ ン ・ タ ギ ン グ いため容易ではない。

t 

1 

d

遺 伝 子 の ク ロ ー こ れ ら 温 度 非 感 受 性

ι

益変異株の解析に適用し、

法を開発、

ニングと遺伝解析を行った。

ト ラ ン ス ポ ゾ ン が 染 色 体 上 トランスポゾン・タギング法というのは、

目 的 と す る 遺 伝 子 の 近 傍 に 挿 入 さ れ た ト ラ ン ス ポ ゾ ン を 遺 伝 学 的 な 方 法 (

P  1

形質導入など)で検索、

ランダムな位置に挿入された大腸菌ライブラリーより、

門 ︐

1

11 4 

‑ 1 6 ‑

ト ラ ン ス ポ ゾ ン 上 の 遺 伝 子

(Tn

lQのテトラサイクリン耐性遺伝子など)を指標 に 目 的 の 遺 伝 子 を マ ッ プ し た り 、 ク ロ ー ン 化 す る 方 法 で あ る 。

実際には、以下に述べる手順により実験を進めることとした。(1)野 生 型 大 腸 菌 の 染 色 体 上 種 々 の 位 置 に ト ラ ン ス ポ ゾ ン

Tn1

立が挿入されたライブラ リーより、

P 1

ファージを用いた同時形質導入を指標にして、 斗益変異の近傍に 位 置 す る

T n

lQ挿入変異を分離する。

( 2 ) T n

lQ上のテトラサイクリン耐性遺伝子 を 指 標 と し て

T n

止 と 隣 接 す る 染 色 体

DNA

をクローニングする。

( 3 )

得 ら れ た 染 色 体 断 片 を プ ロ ー プ と し て 、 小 原 ら の 大 腸 菌 染 色 体 整 列 ク ロ ー ン

(Kohara e t   U.

，

1 9 8 7 )

と の ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 行 う こ と に よ り 染 色 体 上 で の 位 置 を決定する。

( 4 )

整 列 ク ロ ー ン か ら 目 的 の 遺 伝 子 の ク ロ ー ン 化 し 、 塩 基 配 列 の 決定により遺伝子の同定を行う。なお、

T n

lQ挿入の方向とクローン化された断 片の大きさによっては、

( 2 )

で ク ロ ー ン 化 さ れ た

D N A

断 片 上 に 目 的 の 遺 伝 子 が 乗 っている場合も考えられる。

第

3

節

i l l

変 異 と 連 関 し た

T n

lQ挿入変異の分離

まず、

i l l

変 異 株

KP624

、

KP4227

、

KP4677

、

KP4688

の 斗

A

変 異 近 傍 に 位 置 す る ト ラ ン ス ポ ゾ ン

T n

旦挿入変異のスクリーニングを行った。 野 生 株

KP245

の染色体上に、

Tn1

旦がランダムに挿入された

T n

辺 挿 入 変 異 ラ イ ブ ラ リ ー

(Miki

t l l i .

， 

1 9 8 8 )

から集積した

P 1

フ ァ ー ジ を 用 い て 、 こ れ ら

ιA

変 異 株 を 受 容 菌 と し て 形 質 導 入 を 行 い 、 テ ト ラ サ イ ク リ ン 耐 性 を 指 標 に

Tn1

立が形質導入された 株 を 選 択 し た 。 得 ら れ た

T n

辺 挿 入 変 異 株 の 中 か ら 同 時 に

LetD

感 受 性 ( 斗

s r )

に なった形質導入株を検索したところ、

KP624

株から

l

株

(KP5253) 、 KP4227

株 か ら

l

株

(KP5254)

、

KP4688

株から

3

株

(KP5250

、

K P 5 2 5 1

、

KP5252)

の

T n

lQ挿入変 異 株 が 得 ら れ た ( 表

3 ‑ 2 )

。 得 ら れ た 株 の 持 つ

T n

lQ挿入変異をそれぞれ主辺二段

:  : T n

段、五以斗五:: 

T n 1

旦、辿によ

1 : : T n

lQ、

μ 」 ニ1 1 : : T n

辺、三也二

l i : :TnLQ

と命名し た (

TnLQ

の 命 名 は 、 後 の 実 験 で 明 ら か に な っ た

TnLQ

の 染 色 体 上 で の 挿 入 位 置 を もとに行った)。なお、

KP4677

株 か ら は

848

株 の 形 質 導 入 体 を 検 索 し た が t

I  d

変 異 と 連 関 し た

T n

辺挿入変異は得られなかった。

‑ 1 8

^苧

表

3 ‑ 2

斗益変異と連関した

Tn1

立 挿 入 変 異 の ス ク リ ー ニ ン グ

受 容 菌 ( 斗

d

変 異 )

KP4677  KP4688  KP624  KP4227 

(t 

I d ‑ 3 9 )  

(斗

d‑50)

_(ιd二~)

( ̲ U ̲ d ̲ ‑ 1  7  ) 

調 べ た

T c

^R_{形 質 導 入 体}

8 4 8   6 6 4   2 6 5   5 6 3   T l d +

と な っ た

T c

^R_{形 質 導 入 体}

得 ら れ た

T n

辺 挿 入 変 異

zha‑12  _~ i l l ̲ : j ̲ ̲ Q   zfi‑13 

zha‑14 

KP245

株 の 染 色 体 上 に

T n

lQがランダムに挿入された

T n

辺 挿 入 変 異 ラ イ ブ ラ リ ー

(M i  k  i  t l   . u . ，   ^{1 9 8 8 )}

か ら 集 積 し た

P 1

フ ァ ー ジ を 用 い て 、 斗

A

変 異 株 に 形 質 導 入 を 行 い 、 テ ト ラ サ イ ク リ ン 耐 性 形 質 導 入 体 を 選 択 、 得 ら れ た 形 質 導 入 体 の 中から

T l d +

と な っ た 株 を 平 板 接 合 法 に よ り 検 索 し た 。 形 質 導 入 、 平 板 上 で の 接 合 は 表

3 ‑ 1

に記した方法に従って行った。

‑ 1 9 ‑

( A )  

得 ら れ た

T n

辺 挿 入 変 異 と 一 連 の 斗 益 変 異 の 連 関 性 を 調 べ た 結 果 を 表

3 ‑ 1

に示した。調べた斗益変異は辿仁よ

1 : : T n l

立と約

95%

同 時 形 質 導 入 さ れる

t l d ‑ 1 3

、 段 、 也 、 位、位 、 銭、担 変 異の 群 ( 第

l

群)と、 叫五斗立:

: T n

lQと約

20%

、斗 仁 lQ: 

: T n

lQと約

70%

同時形質導入される斗且ニ

3

、

1 1

変 異 の 群 ( 第

2

群 ) の

2

つ の 連 関 群 に 分 類 さ れ た 。 こ れ ら 斗

A

変異がいずれも立込近傍に位置するd.

m‑ ̲ u 主 k a n

、 紅旦

E

遺伝子近傍に位置する叫五斗よ:: 

T n

止と の 連 関 性 を 示 さ な か っ た こ と を 考 え 併 せ る と 、 こ の 結 果 は位工五、且旦 昼、 紅♀弘以外に少なくとも

2

つ の 新 し い

i l l

遺 伝 子が存在することを示唆するものである。 そ れ ぞ れ の 連 関 群 よ り

K P 4688

株の斗止二目変異、

K P 6 2 4

株の斗

d

二

2

変 異を 代 表 と し て 選 び 、 以 後 の 実 験 に 用 い た 。 な お 、 上 述 の 実 験 に お い て

K P 4 2 2 1

株、

KP4227

株、

K P 4229

株 の 増 殖 の 温 度 感 受 性 は 、 用 い た ど の

T n

辺 挿 入 変 異 株 と も 同 時 形 質 導 入 さ れ な か っ た ( 結 果 は 示 し て い な い ) 。 こ の 結 果 は 、 こ れ ら

3

株がいずれも

L e t D

耐 性 (

t  1  d )

変 異 と 高 温 感 受 性 増 殖

( T s )

変 異 の

2

重 変 異 株 で あ る と い う 長 尾

(1988)

の結果とよく 一致する。

また、玉斗斗~:: 

T n l

立挿入変異は、 斗

d ‑ 5

立変異、斗斗二

2

変 異 の 両 者 と

1 0 0

% の 連 関 性 を 示 す よ う に み え る 結 果 を 示 し た ( 表

3 ‑ 1 )

。 異 な る 染 色 体 領 域 に 位 置 す る と 考 え ら れ る

2

つの変異の両方と

1 0 0

見 連 関 す る と い う こ と は 考 え ら れ ず、この互斗二斗:: 

T n l

立はこれら

2

つの

i l l

変異を抑圧する

T n

辺 挿 入 変 異 で あ る と 考えられる。玉工とよ

1 : : T n

lQ

f

申 入 変 異 に つ い て の 解 析 結 果 に つ い て は 第

7

章 に 述

0 5  

工 コ Tn10

B 

ハUEE﹄

4司自・

15  20 

Chromosome 

B  B 

~

‑

・ ^{θ f t A   pKP1592}  _{R { " ' ¥ ̲ ̲ R}  

( m i n i F  v e c t o r ，  CmnSpcn) 

B  =  ^Bh￨lJ  R 

r"¥ ̲ ̲  

R 

^{1""¥  ̲  ̲} 

R 

T c "   Cm'  '8pc  ( B )  

B  EH  P  P B 

pKP1846 

pKP1857  B 

pKP1837  P H   E  B 

pKP1838 

pKP1856  KP5250 

( t / d   +  zha‑12 : : T n   10) 

B  EH  B  KP5252 

( t ld+zha‑14 : : T n   1 0 )  

B  EH 

^{戸 ﹂}

ベる。

KP5253 

( t / d  + z j g ‑ 1 5  : : T n   10) 

第

4

節

T n 1 0

と隣接した染色体

D N A

の ク ロ ー ニ ン グ

KP5254 

( t / d   +  z j g ‑16 : :  T  n  10 ) 

H

回 目

PK

白く

L..LJJ 

B  PP  B 

T n

lQの染色体上での位置の決定は、小原らの大腸菌染色体整列クロー ン と の プ ラ ー ク ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ り 行 う こ と と し 、 ま ず 、 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の プ ロ ー プ と し て 用 い る た め 挿 入 さ れ た

T n

止 と 隣 接 し た 染 色 体 断片のクローニングを行った。

T n

lQ上にはテトラサイクリン耐性遺伝子の外に

B a m H I

切 断 部 位 が

l

カ所存在し、

E

主旦

H1

で 切 断 す る こ と に よ り テ ト ラ サ イ ク リ ン 耐 性 遺 伝 子 と

T n

止 に 隣 接 す る 染 色 体 領 域 を 含 む 断 片 を 生 じ る ( 図

3 ‑ 1 A )

。 こ の

KP5251 

( t / d + z f i ‑ 1 3  : : T n   1 0 )  

図3

・

1( A )   Tn 10上のテトラサイクリン耐性遺伝子を指標とした染色体断片のクローン化 ( B )   ク口一二ングされた染色体断片の構造

黒塗の部分はTn10領域を、白抜きの部分は染色体領域を表している。制限酵素部位の略 号は、それぞれ、 B ， Bam  H I ;  E ，  E c o   R I ;   H ，  H i n d l l l ;   K ，  K p n   P   ; 1 ，  P s t l を示す。

‑ 2 0 ‑

^{円ノω 14} 

断 片 は テ ト ラ サ イ ク リ ン 耐 性 を 指 標 に 容 易 に ク ロ ー ニ ン グ す る こ と が で き る 。 この方法により、皿

i n  i  ‑f

プ ラ ス ミ ド

pKP1592

を ベ ク タ ー と し て 、 斗

1 1

遺 伝 子 の 近 傍 に 位 置 す る

TnlO

に隣接した染色体断片をクローニングした。 第

l

群 t 

1  d

変 異 の 近 傍 に 位 置 す る

zha‑12::TnlO

挿 入 変 異 を 持 つ

KP5250

株より

pKP1846

、 訟 に 込 :

: T n l

立を持つ

KP5252

より

pKP1857

を得た。

pKP1846

は

9.5kb

、

pKP1857

は

0.8kb

の

Tn10

領 域 を 含 む 染 色 体 断 片 が ク ロ ー ン 化 さ れ て い た 。 ま た 、 第

2

群 t

1  d 

変異近傍に位置する叫五二込:: 

T n

止 を 持 つ

K P 5 2 5 3

株より

pKP1837

、五辺二国:

: T n lQ 

を持つ KP5254 株より pKP1838 を得た。 pKP1837 は 7 . 5 k b 、 pKP1838 は 1 1 . 2 k  b

の

T n

lQ 領 域 を 含 む 染 色 体 断 片 を 持 つ 。 得 ら れ た 染 色 体 断 片 の 制 限 酵 素 地 図 を 図

3‑18

に 示した。

第

4

章 斗

A

変 異 の 相 補 性 試 験 と 斗

A

遺 伝 子 の マ ッ ピ ン グ

第

l

節 野生型斗昼遺伝子のクローニング

る 。

前 章 第

4

節で述べたように、

i l l

遺 伝 子 が 組 み 換 え プ ラ ス ミ ド

pKP1846

、

あ る い は pKP1838 に ク ロ ー ン 化 さ れ た 染 色 体 D N A 上 に 存 在 す る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 こ の 点 が 確 認 さ れ れ ば 、 叫 A 遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ は 既 に 終 了 し て い る こ と に な り 、 新 た に 大 腸 菌 染 色 体 上 に マ ッ ピ ン グ し て 、 小 原 整 列 ク ロ ー ン か ら

再 ク ロ ー ン 化 す る 必 要 が な く な り 、 実 験 を 非 常 に 簡 略 化 で き る の で こ の 点 を 検 討 し た 。 も し 、 ク ロ ー ン 化 さ れ た

D N A

断片上に

L

以遺伝子が存在するのであれば、

こ れ ら の 染 色 体 D N A 断 片 を 持 つ プ ラ ス ミ ド は 斗 益 変 異 を 相 補 し 得 る も の と 予 想 さ れ る 。 そ こ で 、 染 色 体 D N A 断片を m i  n  i ‑ R

プ ラ ス ミ ド

pKP1673

に 再 ク ロ ー ン 化 し た

プ ラ ス ミ ド pKP1839 (pKP1846 由来)、 pKP1796 (pKP1838

由 来 ) を 構 築 し 、 こ れ

らが l l i 変 異 を 相 補 し て F 因 子 与 弘 ( a m ) 感 受 性 に 戻 す か 否 か を 検 討 し た 。 ベ ク ターを mini‑R に 変 換 し た の は F 因 子 比 日 ( a m ) 変異株と共存可能にし、江よ A( a m )   変 異 に よ る 増 殖 阻 害 を 検 出 可 能 に す る た め で あ る 。

表

4 ‑ 1

に示すように、

m in  i ‑ R

ベクタ

‑pKP1673

を導入した

ι4

二日変異株

は F 因 子 i 旦日 ( a m ) 変 異 株 の 導 入 に よ っ て 殺 さ れ る こ と な く 、 そ の 生 菌 数 は 接 合 の聞に1. 9 倍 に 増 加 し て い た ( l i n e 6 )

。これに対し、

pKP1839

プ ラ ス ミ ド を 持

つ斗丘二盟変異株は F 因 子 江 込 ( a m ) 変異株の導入により 98% の 受 容 菌 が 生 存 活 性 を 失 っ て い た (line 7 ) 。なお、 2% の 生 存 菌 は F 因 子 が 導 入 さ れ な か っ た た め に 生 き 残 っ た 受 容 菌 で あ る 。 同 様 の 結 果 は 斗 d ‑ 3 9 変 異 株 を 用 い て も 得 ら れ た (line  1 1 、 l i n e 1 2 )

。以上の結果は、

pKP1839 (従って pKP1846) に ク ロ ー ン 化 さ れ た 9.5kb の D N A 断 片 上 の 遺 伝 子 が L 比二旦変異、斗且斗 2 変 異 を 相 補 し 得 る こ と、 即ち 9 . 5kbDNA

断片上によ̲Lc1遺伝子が存在していることを示唆する。

問機に

、

pKP1796

プ ラ ス ミ ド を 持 つ 斗

d ‑ 3

、斗且二

I I

株は、

F

因 子

1e 

t 

A  ( a m ) 変 異 株 を 接 合 に よ り 導 入 す る と 、 増 殖 阻 害 を 受 け コ ロ ニ ー 形 成 能 を 失 っ た ( l i n e   2 4

、

1i n e   2 9 )

。 こ の 結 果は

pKP1796 (従って pKP1838) に ク ロ ー ン 化 さ れた 1 1 . 2 k  b

の

DNA 断 片 上 の 遺 伝 子 が L 上 d ‑ 3 変異、斗丘二 1 1 変異を相補し得ること、

P 1

形 質 導 入 に お け る

2

つ の 遺 伝 子 の 同 時 形 質 導 入 の 頻 度 と 遺 伝 子 問 の 距離の聞には相関があり、

P l

ファージを用いた

i l l

変異と

T n

辺 挿 入 変 異 の 同 時 形 質 導 入 頻 度 か ら 両 者 の 距 離 を 求 め る こ と が で き る

(Wu

，

1 9 6 6 )  

0 

z h a ‑ 1 2 :  : T n  

1 0

と第

l

群 の t

1  d

変 異 の 同 時 形 質 導 入 頻 度 は 約

95%

であり、

W u

の 理 論 曲 線 よ り そ

の 距 離 は 約 2 k b であると推測される。 KP5250 (斗 f 辿主二以::  T n

lQ)株より得た

pKP1846 は 9.5kb の染色体領域を持つことから、 1 / 2 の 確 率 で ( 挿 入 の 方 向 性 に よ っ て ) 第 l 群 の 斗 f 遺伝子を含むことが期待される。 同 様 に 、 叫 i 斗 ̲ Q : : Tnl

立

と第 2 群 の t 1  d

変 異 は 約

70%

の 頻 度 で 同 時 形 質 導 入 さ れ る と こ ろ か ら 、 両 者 の 距 離は約 10kb であると推測される。従って KP5254 株(斗_d~~斗斗五

:

: 

T n

lQ)由来の pKP1838 の持つ染色体領域上に第 2群の ill~ 遺伝子が存在する可能性が考えられ

実際に、

pKP1846

、

pKP1837

プ ラ ス ミ ド が 、 そ れ ぞ れ 第

l

群 お よ び 第

2

群

の t 1  d

遺 伝 子 を 含 む こ と が 相 補 性 試 験 の 結 果 よ り 明 か と な っ た が 、 そ の 結 果 に

つ い て は 第 4 章に述べる。

円ノ山

内ノ

U nu nノ臼

ク ロ ー ン 化 さ れ た 染 色 体 断 片 を 持 つ プ ラ ス ミ ド を 導 入 し た 野 生 株 、 あ る い は 斗益変異株を受容菌に、

K P 4 0 7 4 ( K P f 1 4 )

を 供 与 菌 と し て 表

2 ‑ 1

に 述 べ た 方 法 に 従 っ て 接 合 を 行 っ た 。 但 し 、 生 菌 数 お よ び

L a c +

菌 数 は マ ツ コ ン キ 一 平 板 を 用 い て 計 数 し た 。 な お 、 実 験 結 果 を 見 易 く す る た め に 、 表

4 ‑ 2

の 相 補 性 試 験 に よ り 明 か と な っ た

l l i

遺 伝 子 名 を 遺 伝 子 型 欄 に 記 載 し た 。

ク ロ ー ン 化 さ れ た 染 色 体

DNA

断 片 に よ る t

1  d

変 異 の 相 補 表

4 ‑ 1

生 存 菌

L a c +

接 合 体

/100

受 容 菌

/100

生 存 菌 受 容 菌

遺 伝 子 型

KP4713  / pKP1673 

pKP1839  pKP1840  pKP1796  pKP1819 

11Ad斗‑nxu門

f f

nノU

‑ a E E

ム

‑B EE A‑ EE E

ゐ

n︐ 臼

1lAnノ

ω 1 1 4 nノω

/  m i n i R   m  i  n  i  R  ‑

t 

1  d  0 +  

皿

i n i R ‑ t l d D 5 0 m i n i R ‑ t l d E +   m i n i R ‑ t l d E 3  

t 

1  d 

+ 

宿 主 / プ ラ ス ミ ド

1 0 0   3  9 9   9 9   1 0 0   1 9 0  

1 7 0   2 2 0   2 0 0   t l d D 5 0   /  m i n i R  

田

i n  i  R  ‑ t  1  d D +   m i n i R ‑ t l d D 5 0   m i n i R ‑ t l d E +  

皿

i n i R ‑ t l d E 3 KP4714  / pKP1673 

pKP1839  pKP1840  pKP1796  pKP1819 

1 0 0   3  9 8   9 8   9 9   1 7 0  

1 6 0   1 8 0   1 8 0   t l d D 3 9   /  m i n i R  

m  i  n  i  R  ‑

t 

1  d  0 +   m i n i R ‑ t l d D 5 0  

皿

i n i R ‑ t l d E +

皿

i n i R ‑ t l d E 3 KP5932  / pKP1673 

pKP1839  pKP1840  pKP1796  pKP1819 

li a4

ρhvnXu‑‑ 

1 E 4 1

﹄ ム

4

斗 ゐ 円

︽U n

︽U A

吐 円

U

/  m i n i R  

m  i  n  i  R  ‑

t 

I  d  0 +   m i n i R ‑ t l d D 5 0   m i n i R ‑ t l d E +   m i n i R ‑ t l d E 3  

t 

1  d +  

K P 4 7 1 1   /  pKP1673  pKP1839  pKP1840  pKP1796  pKP1819 

9 9   9 9   9 8   1 0   1 0 0   2 8 0  

2 5 0   2 7 0   2  3 4 0   /  m i n i R  

m  i  n  i  R  ‑

t 

I  d  0 +   m i n i R ‑ t l d D 5 0   m i n i R ‑ t l d E +   m i n i R ‑ t l d E 3   t l d E 3  

KP4712  /  pKP1673  pKP1839  pKP1840  pKP1796  pKP1819 

nkunuunkuphdnxu 

Q u n u n u

‑

‑ Q U  

2 6 0   3 4 0   2 2 0   3  3 1 0   t l d E 1 7   /  m i n i R  

m  i  n  i  R  ‑

t 

1  d  0 +   m i n i R ‑ t l d D 5 0   m i n i R ‑ t l d E +   m i n i R ‑ t l d E 3   KP4835  /  pKP1673 

pKP1839  pKP1840  pKP1796  pKP1819 

‑ 2 5 ‑

‑ 2 4 ‑