惨ー69

2.706  k b p 

。 2 

惨ー

か ら 合 成 さ れ て い る も の と 推 測 さ れ る 。

プ ロ モ ー タ ー 領 域 の 検 索 第

4

節

両 読 み 枠

O R F 4 5 0

の 上 流 に は

O R F 1 8 3

が 逆 向 き に 存 在 し て い る こ と か ら 、

2 . ， 7   kbp 

。 2  S D C ‑ G E N E T Y X  

の 聞 に プ ロ モ ー タ ー が 存 在 し て い る の で は な い か と 推 測 さ れ る 。

P 

戸 ﹂

H 

t 

1  d E

遺 伝 子

B 

プ ロ モ ー タ ー 検 索 を 行 っ た と こ ろ 、 ソ フ ト ウ ェ ア

H A I R P

げを用いて

こ の 領

l

カ 所 の 候 補 配 列

( ‑ 8 3 ‑ ‑ 5 1 )

が見いだされた。

の プ ロ モ ー タ ー と し て

一 連 の 欠 域 が プ ロ モ ー タ ー と し て 働 い て い る か ど う か を 明 ら か に す る た め に 、

ど の 領 域 ま で 欠 失 さ せ た 場 合 プ ロ モ ー タ ー 活 性 が 消 失 失プラスミドを作成し、

pKP1797 

制 限 酵 素 を

プ ラ ス ミ ド の 構 築 は するかを、斗止̲Q相補活性を指標に検討した。

pKP2020 

そ れ ぞ れ

利 用 す る こ と に よ り 行 っ た 。 作 成 し た プ ラ ス ミ ド の 構 造 を 図

6 ‑ 1 0

に、

t 

1  d E 3

変 異 相 補 活 性 を 表 こ れ ら 欠 失 プ ラ ス ミ ド の

図

6‑ 1 1

に、 の 持 つ

D N A

領 域 を

pKP2021 

6 ‑ 2

に示した。

2

つ の 候 補 が あ 開始コドン!と開始コドン

2

の

O R F 4 5 0

の開始コドンは、

‑ 4 9

塩 基 ま で を 持 つ

‑ 1 1 9

、 開 始 コ ド ン

l

の ア デ ニ ン 残 基 の 位 置 を +

1

として、

る。

図 6‑10 t / d E遺伝子プロモーターの検索に用いた欠失プラスミドが 持つ染色体領域

黒塗の領域は、プラスミドが持つ染色体領域を示している。~は

、 SDC‑GENETYX ソフトウェア HAIRPIN により予測されたプロモー ター領域を、珍は、 t l d E遺伝子の読み枠と読まれる方向を示して いる。制限酵素部位の略号は、それぞれ、 s ，Bam  H I ;  E ，  Eco  R I ;  H ，  H

的

d l l l ;P ，  P s t   I を示す。

こ の 結

p K P 2 0 2 1

は何れも

t 1  d  E 3

変 異 を 相 補 し た ( 表

6 ‑ 2 )

。 フ。ラスミド

p K P 2 0 2 0

、

下 流 に プ ロ モ ー

‑ 4 9

塩基より プ ロ モ ー タ ー 検 索 に 基 づ く 予 惣 と 異 な り 、

果は、

こ の 領 域 に プ ロ モ ー タ 一 様 配 列 (‑

2 6   ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ ‑

タ ー が 存 在 す る こ と を 示 唆 し て い る 。

開 始 コ ド ン

2

と 考 え て も 開 始 コ ド ン

l

にかかっており、

は見られるが、

+  1

塩 基 )

こ れ ら の 開 始 コ ド ン よ り 下 流 の 開 近すぎる。

T l d E

蛋白質の分子量から考えて、

σ 7 0  

‑ 4 9

塩 基 よ り 下 流 に 始 コ ド ン が 使 用 さ れ て い る と は考 え に く いことから、

‑ 6 7 ‑

以 外 の

σ

因 子 に よ り 認 識 さ れ る プ ロ モ ー タ ー が 存 在 す る の で は な し = か と 考 え て

いる。

:日〈 IM~勿-b 口

:REP  21  K  t / d E   ERIC 

‑ 6 6 ‑

120  GGATCCATCAGAAACTGCTGGATGGGCTGGCGAAGAAGGCGGAAGCCGCGCAGTAATTCGGCCTTAGCCAGATATAGTATGCGTAGGCCGGATAAGGCGTTCACGCCGCATCCGGCATTT 

BamHI 

240 

大 会 決GlyGluAsnGluAlaLeuGluArg工Jeu

GAGCATAGTGCCTGATGCGACGCTTGATGCGTCTTATCAGGCCTACAGGTGCACCGTATCCGGCAAACCATACTCACATCAACAACGAAAATTACCCTTCGTTCTCCGCTAACTCGCGCA 

360 

TyrGlnPhe

工

leGl

nA

rgAlaSerLysProProLysAsnGlyGluLysGluLysLysAlaAsnAr9

工

leLeuThrArgLeuGlnGlnArgAspAlaAspProTrpLeuAsnLeuValGlu GATACTGGAAAATCTGGCGTGCGGATTTCGGCGGCTTATTCCCTTCTTTCTCTTTCTTCGCGTTGCGGATCAGAGTACGCAGTTGCTGACGATCGGCATCGGGCCACAGATTTAATACCT 

480 

Ala

工

leAlaAspAspGlyGlnAsp

工

leLeuArgAspArgLe

uA

snGluLeuLysHisPheLeuValValGlnGlnAsnHisArgAsnLysLeuLysAspLeuAlaGlnArg

工

leproGlu CAGCGATGGCGTCATCACCTTGATCGATCAGACGATCGCGCAGGTTTTCCAGTTTATGGAACAGCACCACCTGCTGGTTGTGACGGTTTTTCAGCTTATCCAGCGCCTGACGAATAGGCT 

600 

ValAspArgGlnArgLe

uM

etLysGly

工

leLeuGlnLeuGl

nA

rgArgArgGlyGl

uM

etLys

工

leArgGlnAla

工

JeuGlu

工

leAlaAlaArgLeuAspAlaAspLeuPro

工

leLysAsp CTACGTCGCGCTGGCGCAGCATCTTACCGATGAGCTGCAACTGGCGGCGGCGACCTTCCATCTTAATACGCTGGGCGAGCTCAATAGCCGCGCGCAGATCCGCATCTAACGGGATCTTAT 

720 

LeuAlaAsnLysGlyLeuAspVal工leGluAlaGlyLeuArgLysLeuGluGluAlaAspArgLys工leGluSerLysSerValTrp工le工leGluAspAspGluAspGlu工leAspAsp

CCAGCGCGTTTTTCCCCAGATCAACAATTTCCGCGCCAAGGCGTTTTAGCTCCTCGGCATCACGTTTAATTTCACTTTTACTGACCCAGATAATTTCATCGTCTTCGTCTTCGATGTCAT 

Cフコ C氾

‑119 

GlyProValAspAspLeuTrpAspGluProGlnLysThrMet 

‑49  840 

CACCGGGAACGTCGTCGAGCCAGTCTTCGGGCTGCTTAGTCATCTCAGGCTCCTTAAAAAAAGAGGCTAATGTTACCAGTTAAGATGCGCACTGAAAAACGGTTCTCTGTTAGACTTCAG 

」 + p l

く

P2020 I  . . .   pKP2021 

~ ^I  960 

AGAAACTCTCTACATTATGGCACTTGCAATGAAAGTAATCTCTCAAGTTGAAGCGCAGCGCAAGATTCTGGAAGAAGCAGTTTCCACTGCGCTGGAGTTGGCCTCAGGCAAATCGGACGG 

M~tAlaLeuAlaM~tLysVal 工 leSerGlnValGluAlaGlnArgLys 工 leLeuGluGl uA laValSerThrAla 工JeuGluLeuAlaSerGlyLysSerAspGly

‑

+ 1   t l d E  

21K 

鮒∞

1∞

に比 四い 師

︑

町ボ

δ

け司

︑口

市

lwl

郵 第

δ

薄 潟 昨

有 国

¥ 

‑ C

時C

翰 国 時翰 岡崎

な朴 布図

鵡川附

リ リ 河 川 T︐

一

( h u h匹

︒ 寸 品 (

﹃ } ( 山

l

﹂ )

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炉U

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『

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l

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〆戸、、

〈 ct> 

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N N C  

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O 

口 問 勺 ]

∞ 也

︑

t

H︺同司

M O N O 旬 開 力 NON‑

∞ ] ( )  

N A C   M N G  

C心c.:>，.t.. 

t l d E 遺伝子プロモータ‑検索のための欠失プラスミドの持つ領域

三巴隣町ポ

δ

︐U

︒口

市

lw

可

l

瀦 銘 打

l

脳

δ

流沿州内湘州事

! u

u

_︒

JW

河 川 て 伸 縮

︑/ ヤ汁 わ広 岡い 山州 問湘 非同 勺ミ

}

刈即時翰園什ヤパ迫N

τ '

制印

l

二

円 民

λ

汁社路打︒汁占滞 砂 市

44J

汁 ︒

図 6 ‑ 1 1

CY> 

巴ζ〉

第

l

節

μ

以

1 1 : : T n

l.Q挿入変異

示 す よ う に な っ た も の と 推 測 さ れ た の で 、 ま ず 大 腸 菌 染 色 体 上 で の

T n

辺 挿 入 位 置の決定を行うこととした。

マ ッ ピ ン グ の 方 法 と し て は 、 小 原 ら の 大 腸 薗 染 色 体 整 列 ク ロ ー ン と の プラークハイブリダイゼーション法を用いた。斗込よ立:: 

T  ⁿ

l.Qのテトラサイクリ ン耐性遺伝子を指標として、

T n 1

立に隣接した染色体領域を

m i n i ‑ f

プ ラ ス ミ ド 上 にクローン化した。得られたプラスミド、

p K P 1 8 5 6

(図

3 ‑ 1 8 )

よ り 染 色 体 断 片 を 高 コ ピ ー 数 プ ラ ス ミ ド

p H G 3 2 9

へ再クローン化し、

p K P 1 8 5 9

を得た。

p K P 1 8 5 9

を フ。ローフ参としてハイブリダイゼ、ーションを行ったところ

# 4 4 6

フ ァ ー ジ (

2 3 8 7 )  

に の み ハ イ ブ リ タ イ ズ し た ( 図

7 ‑ 1 A )

。この結果より、主よじよ̲a:

: T n L Q

は 、 染 色 体 上

5 8

分近傍に位置していると推測された。さらに、

p K P 1 8 5 9 D N A

の 染 色 体 領 域 の 制 限 酵 素 地 図 ( 図

3‑ 1  8 )

を、

5 8 . 2

分 近 傍 の 大 腸 菌 染 色 体 制 限 酵 素 地 図 と 比 較 することにより、

T n 1 0

の 挿 入 位 置 は 染 色 体 上

5 8 . 2

分の主弘

S

遺 伝 子

( a l a n y l t ‑ R N A

合 成 酵 素 構 造 遺 伝 子 ) の ご く 近 傍 に 位 置 す る こ と が 明 か と な っ た 。

第

7

章 斗且

E

、斗止

E

遺 伝 子 と 措 抗 的 作 用 を 持 つ と 考 え ら れ る

z ^f  i  A

遺 伝 子

第

3

章第

3

節で述べたように、 斗

A

変 異 と 遺 伝 的 に 連 関 し た (

P  1

フア ー ジ で 同 時 形 質 導 入 可 能 な )

T n

盟 挿 入 変 異 を ラ イ ブ ラ リ ー か ら 検 索 し た 際 、 斗丘ヰ立変異と斗

d ‑ 3

変異の両者と

1 0 0 %

の連関￨全を示す様に一見見える

T n

辺 挿 入 変異、

4

とよ..3.:

: T n

l.Qを分離した(表

3 ‑ 1 )

。斗上辺変異(札止

D

遺 伝 子 ) は 大 腸 菌 染 色 体 上

7 0 . 5

分に、

ι

昼二

2

変異(斗丘

E

遺伝子)は

9 4

分 に 位 置 す る ( 第

4

章 第

4

節 ) 。 こ の 様 に 異 な る 染 色 体 領 域 に マ ッ プ さ れ る ( 約

1 1 0

万 塩 基 対 離 れ て い る)

2

つの遺伝子が、

l

つの

T n 1 0

挿入変異と

1 0 0 %

連関することは考えられず、

こ の 斗

i ニリ:

: 

T n

旦変異は、 2つの弘止遺伝子、斗盟、 tI d E遺 伝 子 の 変 異 の ど ち ら も抑圧可能なサプレッサ一変異であると考えられる。

z f i ‑ 1 3 : : T n 1 0

は 何 等 か の 遺 伝 子 内 に

T n

l.Qが挿入され、その遺伝子が不活性化したためにサプレッサー 活 性 を 示 す 様 に な っ た と 考 え ら れ た の で 、 こ の 遺 伝 子 を

z f 

i 

A

と 命 名 し 、 変 異 を

4

込 斗 :: 

T n

盟と呼ぶこととした。

実際に

ι 2

^企

1 1 : : T n

l.Q変異が、

t l d D

変異、

t I  d  E

変 異 の サ プ レ ッ サ 一 変 異 であるならば、

i l i

企遺伝子産物と、

T I  d D

蛋白質、

T l d E

蛋 白 質 の 問 に 互 い に 括 抗 的な何等かの相互作用があることになる。従って、

t l d D

、

t I  d E

遺 伝 子 機 能 、 特 に

L e t D

蛋 白 質 に よ る 宿 主 大 腸 菌 染 色 体 分 配 阻 害 に お け る

t 1  d  D

、

t I  d  E

遺 伝 子 の 果 たす役割を解明する上で、

z f i A

遺 伝 子 と そ の 機 能 の 解 析 は 重 要 な 鍵 に な る も の と考えられる。この様な観点から、

z f i A

変異の解析を行うこととした。

第

3

節 三斗

A 1 3 : : T n l . Q

変異を相補する

D N A

断 片 の ク ロ ー ニ ン グ

第

2

節

z f i A 1 3 :  : T n 1 0

変 異 の マ ッ ピ ン グ

T n

l.Qはヰ

i

主 遺 伝 子 を 不 活 性 化 し て サ プ レ ッ サ ー 表 現 型 を 発 現 し て い る も の と 推 測 さ れ た ( 本 章 第

l

節 ) の で 、 サ プ レ ッ サ ー 表 現 型 を 相 補 す る (t 

I  d

、

4

込

2

重 変 異 株 は

F

因 子 江 込

( a m )

変 異 株 に 感 受 性 と な っ て い る が 、 こ れ を 再 び 耐 性 に す る ) 活 性 を 指 標 に し て 、 小 原 ラ イ ブ ラ リ ー の

# 4 4 6

フ ァ ー ジ か ら ク ロ ー ン化することとした。

フ ァ ー ジ ク ロ ー ン

# 4 4 6

か ら フ ァ ー ジ

D N A

を 調 製 し 、 こ れ よ り

a I  a S

遺 伝 子から立旦

d

、主日

1

遺 伝 子 ( セ リ ン お よ び ア ル ギ ニ ン

t R N A

の 榊 造 遺 伝 子 ) 領 域 を 含 む

5 . 7 k b

の

8 a m H I ‑ h l ̲ 旦 R I

断片、および斗必遺伝子の途中から立旦

u

、生

i l l

遺 伝 子 の途中までを含む1.

1  k b

の 註

l I ‑ f f i I

断片を

m i n i R

ベクタ

‑ p K P 1 6 7 3

ヘ ク ロ ー ニ ン グ し 、 そ れ ぞ れ プ ラ ス ミ ド

p K P 1 8 8 3

、

p K P 1 8 8 4

を得た(図

7 ‑ 1 8 )

。

これらのプラスミドが、以とよ̲a

: : T n 1

立 変 異 を 相 補 す る 活 性 を 持 つ か 否 か を 検 討 し た 。 以

4

並立変異株は

F

因子江l̲A

( a m )

に耐性であるが、

l

斗主」立:

: T n 1

立 変 異 と の

2

重変異株は、

F

因 子 比 且

( a m )

変 異 株 に 感 受 性 と な る 。 こ の

2

重 変 異 株

z f i A 1 3 :   : T n 1 0

挿 入 変 異 が 生 じ た 遺 伝 子 を 見 い だ し 、 そ の 構 造 を 知 る た めに、 tI d遺 伝 子 に 用 い た の と 同 様 の 方 法 ( 第3章第2節 ) を 採 用 す る こ と と した。

z f i A 1 3 :: T n 1 0

挿入変異は、

z f  i  A

と命名した遺伝子の中(構造遺伝子領域、

プ ロ モ ー タ ー 領 域 を 含 め て ) に ト ラ ン ス ポ ゾ ン

T n

止 が 挿 入 さ れ て 変 異 表 現 型 を

ー

7 0 ‑

^{‑ a}a EA  

司I

'

9  10  8  7  6  4  5 

3  2 

再 びF因子江1A(am)変異株に耐性になれば、 導 にプラスミドを導入したとき、

(A) 

400 

入したプラスミドにより互己二段:

: T n

lQ挿入変異が相補されたということになる。

410 

pKP1884

を 導 入 し た 株

pKP1883

、

平 板 接 合 法 に よ る 相 補 性 試 験 を 行 っ た と こ ろ 、

420 

(結果は示していない)、 従 は共に

F

因 子 江 込

( a

皿)変異株に耐性になっており

430 

って1.

1  k b

の主主

1

‑註

1 1

断片上に、野生型互斗

A

遺 伝 子 が 存 在 し て い る も の と 結 論 された。

440  450 

以上生遺伝子領域の塩基配列の決定 第

4

節

460  470 

こ の 領 域 全 体 狭い領域に限定されたため、

五

ι

^{企遺伝子領域が1.}

^{1  k b}

^と

( 8 )  

斗

l l l i

遺 伝 子の塩基配列決定法と同様、

t 

1  d D

、

の塩基配列を決定した。 方法は、

( k b p )   2900 

1 9 7 7 )

によ り 行 っ た 。 塩 基 配 列 決定 の 蛍 光 標 識 法 を 用 い た

S a n g e r

法

(Sanger

，

図

7 ‑ 3

に示した。 得 決定した1，

1 0 9

塩 基 の 塩 基 配 列 を

ス ト ラ テ ジ ー を 図

7 ‑ 2

に、

ら れ た 塩 基 配 列 か ら 予 測 さ れ る 読 み 枠 を 図

7 ‑ 4

に示した。

z  f  i  A  主上はよ]: : T n

lQ変異において

Tn1

立が挿入された位置を決定すれば、

h 

遺 伝 子 の 読 み 枠 を 決 定 で き る と 考 え、挿入位置の決定を行った。 まず

z f i A 1 3 : : 

ロ

「とコ

」ム

1

宅

CIl  E 

弓

2850 

テ ト ラ サ イ ク リ ン 耐 性 を 指 標 に

T n

lQと染色体

D NA

の

Tn1

立変異株染色体

D N A

から、

i  r 丹

L

寸

ロ

凸 ロ ロ

・ !

E 工 コ

フ。ラスミド

pKP1856

を得=た。 このフ 境 界 領 域 を 含 むBamHI断片をクローン化し、

#446(2387) 

‑ _• pKP1883 

ラ ス ミ ド の 制 限 酵 素 地 図 を 作 製 し た と こ ろ 、

T n 1

立と の 境 界 の ご く 近 く の 染 色 体 上に

E

斗

I

部 位 が 見 い だ さ れ た の で 、 境 界 領 域 の 含 む

Pstl‑Hindlll

断 片 を

M 1 3 べ

pKP1884 

そ の 結 果 、 配 列 中 に

1 9 8 1  )  Putney己 主1 .

， 

その塩基配列の決定を行った。

1 9 8 0   ; 

ドキュメント内 九州大学薬学研究科薬学専攻 (ページ 36-40)