挙隊側
( ε
伺)ぜ
4 2
件図比寸ぃ∞図
t l d D t l d E t l d D
斗止t 2
重変異株、z
f iA 変異株、
図 9 ‑ 4 ' こ 、 野生株、
F 因子江主主 ( a m ) 変 異 株 を 導 入 し た 細 胞 を D A P I を 用 い て 核 染
z
f iA 3 重変異株に、
z
f iA 変 異 株 ( C )
、斗Jill野 生 株 (A) 、
色 を 行 っ た 光 学 顕 微 鏡 写 真 像 を 示 し た 。
フィラ 染 色 体 も 不 規 則 中 央 部 に 集 ま っ て 分 配 が 阻 害 さ れ て い る こ と
大 腸 菌 の 細 胞 分 裂 が 阻 害 さ れ て 斗
Q l z ̲
ム主3
重 変 異 株 (0 )
においては、メ ン ト 状 に な り 、
野 生 株 に 比 べ 細 胞 の 長 さ が が観察される。斗Jill斗 M zfiA3 重変異株の場合、
こ れ は 斗 込 変 異 に よ る 斗 A 変 異 の 抑 圧 が 完 全 そ れ ほ ど 長 く な い も の も 混 じ る 。
t l d D t l d E 変 異 に よ ( B )に示したように、
な も の で は な い た め で あ ろ う 。 なお、
細 胞 分 裂 阻 害 は 完 全 に 抑 圧 さ れ る 。 って F 因 子 l e t A ( a m ) 変 異 に よ る D N A 分配、
ιoES 変 異
F 因 子 l e t A ( a 皿)変異を抑圧する t 1 d D
、t1 d E 変異と同様に、
z
f i A変 異 と の
2重変異株は斗Jill、斗且 E 変 異 と
1 9 8 8 ) の場合、
( M i k i
弘 主1 .
，(結果は示し z f i A 変 異 に よ り 再 び F 因 子
江 且( a m )
変 異 株 感 受 性 と なった
問機、
2 8 ‑ C に て い な い )
0Z̲ム企斗::
TnlQ_紅旦~2 重変異株は、理由は不明であるが、お い て も か な り 強 い 増 殖 阻
害を 受 け る と い う 非 常 に 興 味 深 い 性 質 を 示 す 。 また、
1 9 9 2 ) に 変 異 ( M a k i e t a l .
，L e t D 蛋 白 質 の 直 接 の 標 的 で あ る D N A
ジャイレースe t ( M
ik
iやはり F 因 子 比 込 ( a m ) 変 異 株 に 耐 性 と な る
を 生 じ た 立 込 変 異 株 も 、
z
f i A変 異 と の
2重 変 異 に な っ て も こ の 変 異 の 場 合 に は
︑ノ︑E︐
︒ しかし、
円ノ白
nu u nu u
・0hEA
a 1 .
，(結果は示していない)。
F
因 子 江 民 ( a m ) 変 異 株 に 感 受 性 と な る こ と は な か っ た
紅旦~変異によ
t
1 d E、t l d D
、z
f iA 変異は、
以 上 の 結 果 を 要 約 す る と 、
細 胞 を L et 0 蛋 白 質 に よ る D N A 分 配 ・ 細 胞 分 裂 阻 害 に 感 受 る T l d 表 現 型 を 抑 圧 し 、
且江主変異による T l d 表 現 型 は 抑 圧 し な い と い う こ と に な る 。 こ の 性にするが、
G r o E 蛋 白 質 が な く T l d E
、T 1 d D
、結 果 は 、 以上 A
遺 伝 子に 変 異 が 生 じ た 場 合 に は 、
てもし e t D 蛋 白 質 に よ る 大 腸 菌 染 色 体 分 配 阻 害 が 起 こ る が 、 以 上 五 遺 伝 子 が 野 生 型 G r o E 蛋 白 T l d E
、で あ る 場 合 に は し e t D 蛋 白 質 に よ る 染 色 体 D N A 分 配 阻 害 に T l d D 、
野 生 型 Z f i A 蛋 白 質 は L e t D 蛋 白 質 に よ る 染 色 体 分 配 質 が 必 要 で あ る こ と を 示 す 。
T l d E
、こ れ を 抑 え る 機 能 を 野 生 型 T l d D 、 阻 害 活 性 を 「 阻
害Jす る 活 性 を 持 ち 、
T l d 変異の一種である立工主と μ11 変 異 の
Gr o E 蛋 白 質 が 持 つ も の と 推 測 さ れ る 。
L e t D 蛋 白 質 が G y r A 蛋 白 質 2 重 変 異 株 が L e t D 耐 性 の ま ま で あ っ た と い う 結 果 は 、
に 直 接 作 用 す る と 考 え る と よ く 説 明 で き る 。
‑ 9 9 ‑
‑ 9 8 ‑
第
10
章 総 括 お よ び 考 察第
l
節t 1 d D
、t 1 d E
遺 伝 子 に つ い てF
因子の1 e
tA
遺伝子、1 e
t0
遺 伝 子 に よ る 大 腸 菌 染 色 体 分 配 ・ 細 胞 分 裂 調 節 の 分 子 機 構 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 に 、 足 並 遺 伝 子 産 物 に よ る 増 殖 阻 害 を 受 け な く な っ た 大 腸 菌 変 異 株 を 分 離 し 、 そ の 解 析 を 行 う こ と に よ っ て 、 こ の 過 程 に 関 与 す る 遺 伝 子 、 蛋 白 質 を 明 ら か に す る こ と を 試 み た 。我 々 の 研 究 室 で は 、 ク ロ ー ニ ン グ と 遺 伝 解 析 が 容 易 で あ っ た た め に 、 ひ と つ の 変 異 に よ っ て 辻 迫 遺 伝 子 産 物 に 耐 性 に な る と 同 時 に 増 殖 が 高 温 感 受 性 に な る よ う な 変 異 株 、 即 ち 、 許 容 温 度
( 2 8
0C )
において、L e t D
蛋 白 質 の 作 用 点 と し て の 活 性 は 失 っ て い る が 、 そ の 遺 伝 子 本 来 の 分 配 ・ 分 裂 蛋 白 質 と し て の 機 能 は 保 持 し て い る 織 な 変 異 株 を 分 離 し 解 析 し て き た 。 既 に 、 こ の よ う な 変 異 として、3
つ の 遺 伝 子 が 明 ら か に さ れ て い る 。 そ の う ち2
つ は 蛋 白 質 の 折 り 畳 み や 高 次 構 造 体 形 成 に 関 与 す る 分 子 シ ャ ペ ロ ン を コ ー ド す るιoES
、ι
旦弘遺伝子 (図1 0 ‑ 1 )
である( M i k i t l
叫.，1 9 8 8 ; i b i d
，1 9 9 2 )
。 も う 一 つ は 、 大 腸 菌 の ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ1 1
であるD N A
ジャイレースのA
サ ブ ユ ニ ッ ト を コ ー ド す る 孟Z
r A
遺 伝 子 ( 図1 0 ‑
1)であった( M i k i 弘 主 1 .
，1 9 9 2 )
。 このうち、G y r A
蛋 白 質 がL e t 0
蛋 白 質 の 標 的 で あ る こ と は 、 遺 伝 学 的 に も( M i k i t l
斗.
，1 9 9 2 )
、 生 化 学 的 に も( M a k i
弘 主1 .
，1 9 9 2 ;
真 木 私 信 ) 証 明 さ れ て いる。本 研 究 に お い て は 、 こ れ ま で 遺 伝 解 析 や ク ロ ー ン 化 が 困 難 で あ っ た た め 解 析 さ れ ず に 残 さ れ て い た
、 l e t D
遺 伝 子 産 物 に 耐 性 と な っ て も 細 胞 の 増 殖 に 影 響 を 及 ぼ さ な い 型 の 変 異 株 、 増 殖 が 温 度 非 感 受 性 の 斗 止( l o 1 e r a n c e t o 1 e t D p r o d u c t g r o w t h i n h i b i t i o n )
変 異 株 の 解 析 を 行 っ た 。 こ れ ら はL e t D
耐 性 変 異 株の内、99.5%
と大部分を占めるもので、L e t D
蛋 白 質 に よ る 染 色 体 分 配 ・ 細 胞 分 裂 阻 害 の 過 程 に 於 て 最 も 主 要 な 位 置 を 占 め て い る 遺 伝 子 の 変 異 株 と 考 え ら れ る。この群の叫J!変異株は遺伝的な選択に使用可能な表現型がなかったために 解 析 さ れ ず に 残 さ れ て い た の で あ る が 、 本 研 究 に お い てT n l
立を用いたトランス ポ ゾ ン ・ タ ギ ン グ 法 を 開 発 ・ 適 用 す る こ と に よ り 、 解 析 に 成 功 し た も の で あ る 。‑ 1 0 0 ‑
mreDCB t 7 1
t l d O
argR
70
serVargV
groES&EL
σ
寸3
ぱσ 3
3E . c o l i Chromosome
t l d E
<0
σ 3
ヒー一一
ト、 (j)
rscBC
図 1 0 ‑ 1 I
θtO 遺伝子による染色体分配及び細胞分裂阻害に関与する宿主遺伝子 黒い線は、大腸菌染色体を示している。 l e t O 遺伝子による染色体分配及び細胞 分裂阻害に関与する遺伝子は太文字で示した。円の中に示した遺伝子は、染色体 分配に関与する遺伝子である。
‑ 1 0 1 ‑
そ の 結 果 、 足 旦 遺 伝 子 産 物 に よ る 増 殖 阻 害 に 、 そ れ ぞ れ
i l l
旦、L
はE
と 命 名 し た2
つ の 新 し い 遺 伝 子 を 見 い だ す こ と が で き た 。 調 べ た3 1
株 の 温 度 非 感 受 性 のi l l
変 異 株 は 、 す べ て こ の ど ち ら か の 遺 伝 子 に 変 異 を 持 っ て い た の で 、
T l d
表 現 型 を持つL e t D
蛋 白 質 に よ る 増 殖 阻 害 に 関 与 す る 遺 伝 子 は 本 研 究 に よ り す べ て 明 ら かにすることができたと考えている。t
1 d
遺伝子は、T n
l Q の テ ト ラ サ イ ク リ ン 耐 性 遺 伝 子 を 指 標 に ク ロ ー ン 化 し 、 ク ロ ー ン 化 し たD N A
断 片 を プ ロ ー プ に 小 原 ら の 大 腸 菌 整 列 ク ロ ー ン と の 雑 種 形 成 に よ り 大 腸 菌 染 色 体 上 に マ ッ ピ ン グ を 行 っ た 。 斗d D
遺 伝 子 は 、 染 色 体 上7 0 . 5
分 に 位 置 す る 新 し い 遺 伝 子 ( 図1 0 ‑ 1 )
で、塩基配列より4 8 1
ア ミ ノ 酸 残 基 か ら な る 分 子 量5 ， 1 0 0 0
の蛋白質をコードすることがわかった。T l d D
蛋 白 質 は 等 電 点7 . 6
の 疎 水 性 、 中 性 ア ミ ノ 酸 に 富 む 蛋 白 質 で 、 膜 蛋 白 質 と し て の 特 徴 は 持 た な い の で 細 胞 質 に 存 在 し て い る も の と 推 測 さ れ る 。 斗 且E
遺 伝 子 は 、 染 色 体 上9 6
分 に 位 置 し ( 図1 0 ‑ 1 )
、 小 原 ら の 大 腸 菌 染 色 体 の 制 限 酵 素 地 図 の ギ ャ ッ プ 領 域 に か か っ て い る 点 が 特 徴 的 で あ る 。 塩 基 配 列 よ り4 5 0
ア ミ ノ 酸 か ら な る 分 子 量4 8 ， 0 0 0
の蛋白質をコードしていると推定された。T l d E
蛋 白 質 は 、 等 電 点7
. 6
の 蛋 白 質 で 一 次 構 造 か ら 推 測 さ れ る 性 質 はT l d D
蛋白質によく似ている。T l d D
、T l d E
両 蛋 白 質 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 比 較 し た と こ ろ 、 両 者 の 聞 に ホ モ ロ ジ ー が 見 ら れ 、 同 一 ア ミ ノ 酸 レ ベ ル で20%
、 近 縁 の ア ミ ノ 酸 を 含 め た 場 合 に は69%
という 高 い 値 を 示 し た 。 こ れ ら2つ の 遺 伝 子 は 共 通 の 祖 先 か ら 進 化 し た 遺 伝 子 で あ る 可能性が考えられる。 蛋 白 質 デ ー タ ベ ー スS W I S S ‑ P R O TR e l . 2 2
を 用 い て 類 縁 蛋 白 質 を 検 索 し た が 、 特 に 有 意 に 高 い ホ モ ロ ジ ー を 示 す 蛋 白 質 は 見 い だ さ れ な か っ た の で 、 こ の 面 か ら こ れ ら 蛋 白 質 の 機 能 を 推 測 す る こ と は で き な か っ た 。t 1 d D
遺伝子、斗Ji1遺伝子を単独に遺伝子破壊を行っても、また、両遺 伝 子 を 共 に 破 壊 し て も 、 増 殖 、 構 造 等 特 に 変 化 が 見 ら れ る こ と は な か っ た 。 こ れ ら 遺 伝 子 は 大 腸 菌 の 増 殖 に と っ て 必 須 な 遺 伝 子 で は な い 様 に 見 受 け ら れ る 。し か し 、 予 備 的 な 実 験 結 果 で あ る の で 本 文 に は 述 べ な か っ た が 、 低 コ ピ ー 数 の
皿
i n i ‑ R
プ ラ ス ミ ド を 使 っ て 斗d D
遺伝子を2
倍 程 度 に 増 加 さ せ た 場 合 に は 、 細 胞 がF
因 子l e t A ( a r n )
変 異 株 (L e t 0
蛋 白 質 ) に か な り 強 く 感 受 性 に な る こ と 、 ま たt 1 d D
遺 伝 子 はp B R 3 2 2
な ど 高 コ ピ ー 数 の プ ラ ス ミ ド に は ク ロ ー ン 化 で き な い こ と‑ 1 0 2 ‑
などを考えると、少なくとも斗旦
E
遺 伝 子 は コ ー ド す る 蛋 白 質 の 量 を 変 化 さ せ る こ と に よ っ て 、 染 色 体D N A
の 分 配 や 細 胞 増 殖 の 調 節 を 行 っ て い る 可 能 性 が あ る ように思われる。この点からも、以下に述べる以̲Q̲̲Q遺伝子の発現調節は興味深 し=。t 1 d D
遺 伝 子 の 読 み 枠 と プ ロ モ ー タ ー 領 域 の 聞 に は 、 各2
個のR E P
配 列( R e p e t i t i v e E x t r a g e n i c P a l i n d r o r n i c S e q u e n c e )
配列( S t e r ne t a l .
，1 9 8 4 ; G i l s o n e t a l .
，1 9 8 4 )
を 含 む 非 常 に よ く 保 存 さ れ た9 1
塩 基 対 の 繰 り 返 し 配 列( d i r e c t r e p e a t s )
が3 . 5
個 存 在 し て い た 。 こ れ ま で 報 告 さ れ て い るR E P
配 列 は す べ て オ ペ ロ ン 聞 か 、 シ ス ト ロ ン 聞 に 位 置 し て お り 、 プ ロ モ ー タ ー と シ ス ト ロ ンの聞に見いだされた例は初めてである。R E P
配 列 に はD N A
ジ ヤ イ レ ー ス のA
サ ブ ユ ニ ッ ト が 特 異 的 に 結 合 す る こ と が 知 ら れ て い る( Y a n g & A r n e s ， 1 9 8 8 )
の で 、 こ の 繰 り 返 し 配 列 はt 1 d D
遺伝子のオペレーターとしての働きをもち、D N A
ジ ヤ イ レ ー ス の
A
サ ブ ユ ニ ッ ト が こ の 遺 伝 子 の 発 現 を 調 節 し て い る 可 能 性 が 考 えられる。D N A
ジ ャ イ レ ー ス がt 1 d D
遺伝子の発現を調節し、ιdD
蛋 白 質 はL e t D
蛋 白 質 の
D N A
ジ ャ イ レ ー ス 活 性 調 節 をr n o d u l a t e
す る と い う 形 の 調 節 の ネ ッ ト ワ ーク機構があるように思われる。第
2
節 互主̲A遺伝子について斗
d D
、 斗 姐 変 異 株 解 析 の 際 、 こ れ ら の 変 異 を 抑 圧 す る 活 性 を 持 つT n l 0
挿 入 変 異 が 分 離 さ れ 、 こ れ を 解 析 す る こ と に よ り 新 し い 遺 伝 子 五 以
A
を 見 い だ す こ と が で き たoz f i A
遺 伝 子 は 染 色 体 上5 8 . 2
分、Uι2
遺伝子と立且I
遺 伝 子 の 問 に 位 置 す る 遺 伝 子 で 、 塩 基 配 列 よ り6 1
ア ミ ノ 酸 残 基 よ り な る 分 子 量6
，8 5 6
の蛋白 質をコードする。Z f i A
蛋 白 質 は 、 分 子 量 が6
，8 0 0
と 非 常 に 小 さ い こ と 、 塩 基 性 ア ミ ノ 酸 が 比 較 的 多 く 等 電 点 が8 . 0
と 塩 基 性 蛋 白 質 で あ る こ と な ど が 特 徴 で あ る 。 蛋 白 質 デ ー タ ベ ー ス か ら は ホ モ ロ ジ ー の あ る 蛋 白 質 は 見 い だ さ れ ず 、 こ の 面 か ら の 機 能 を 推 測 す る こ と は で き な か っ た 。 分 子 量 が 非 常 に 小 さ い 蛋 白 質 に は 、 大 腸 菌 の ヒ ス ト ン 様 蛋 白 質 と 言 わ れ るH U
蛋白質、H ‑ N S
蛋 白 質 、 コ リ シ ンE
1 の 複 製 の プ ラ イ マ‑RNA
とR N A I I
との相互作用に関与するR o p
蛋白質など、 核 酸‑ 1 0 3 ‑
と相互作用を持つ蛋白質が見られるので、
Z f i A
蛋 白 質 も あ る い は 該 酸 と 相 互 作 用 を 持 つ 蛋 白 質 か も 知 れ な い 。 な お 、 斗 込 遺 伝 子 はT n
lQ挿入変異として分離さ れ た の で 、 大 腸 菌 の 増 殖 に と っ て 必 須 で は な い と 推 測 さ れ る が 、z よ i
Aι立~の2
重 変 異 は か な り 強 い 増 殖 阻 害 を 示 す の で 、 こ の 点 に つ い て は 今 後 さ ら に 研 究 を進めることが必要であろう。斗Jill、斗SlL、
ι
旦E
変異は、L e t D
蛋 白 質 に よ る 染 色 体DNA
の 分 配 、 細 胞 分裂の阻害を抑圧する(これら変異株細胞中では、LetD
蛋 白 質 に よ る 染 色 体 分 配・細胞分裂阻害が見られない)が、 t1 d D
、斗益、ι
旦E
変異と玉上凶変異の2
重 変 異 株 で は 、 再 びLetD
蛋 白 質 に よ る 染 色 体 分 配 ・ 細 胞 分 裂 阻 害 に 感 受 性 に な る 。 従 っ て 、 図1 0 ‑ 2
のモデルに示したように、4
込遺伝子が野生型である場合には、LetD
蛋 白 質 の 大 腸 菌 染 色 体 分 配 阻 害 にTldD
、TldE
、GroE
蛋白質が必要であるが、zfiA
遺伝子 が 変異 し た 場 合に はこれらの蛋白質がなくても、LetD
蛋 白 質 に よ る 染 色 体 分 配 阻 害 が 起 こ る と 推 測 さ れ る 。 こ の こ と か ら 、 私 は 、 野 生 型ZfiA
蛋白 質はLetD
蛋 白 質 の 染 色 体 分 配 阻 害 を 「 阻 害J
す る 活 性 を 持 ち 、 こ れ を 抑 え る 機 能 を 野 生 型TldD
、TldE
、GroE
蛋白質が持つものと考えている。即ち、五己主遺伝 子 と 、 以J L Q
、斗姐、む立E
遺伝子は互いに逆方向に働くLetD
蛋 白 質 の 調 節 因 子 で あるという考えである。L e t D
蛋 白 質 がGyrA
蛋 白 質 に 直 接 作 用 す る と い うMaki
ら( 1 9 9 2 )
の結果を考え併せると、zfiA
、t 1 d D
、t 1 d E
、紅旦E
遺伝子は、LetD
蛋白 質とDNA
ジ ャ イ レ ー ス の 問 の 相 互 作 用 に 関 与 し て 、 こ れ をr n o d u l a t e
す る 因 子 と 考 え る こ と も 出 来よう。 斗A
変 異 の 一つ で あ る 立且変異は、μjl
変 異 と2
重 変 異 になってもしetD
耐 性 の ま ま で あ っ た と い う 結 果 は 、 こ の 考 え を 支 持 す る も の と 思 わ れる。本研究により、
F
因 子 の 江 民 遺 伝 子 、 江 民 遺 伝 子 に よ る 大 腸 菌 染 色 体 分 配 ・ 細 胞 分 裂 調 節 に 大 腸 菌 の 斗 丘E
、叫且E
、i l l
企 と い う 新 し い 遺 伝 子 が 関 与 す る こ と を 見 い だ し た が 、 そ れ ら 遺 伝 子 が コ ー ド す る 蛋 白 質 の 分 子 レ ベ ル に お け る 機 能 の 解 析 に は 至 ら な か っ た 。 こ れ ら の 遺 伝 子 が しetD
に よ る 細 胞 増 殖 阻 害 の 過 程 で ど の 織 な 役 割 を 果 た し て い る の か 、 さ ら に 、 こ れ ら の 遺 伝 子 がF
因子を 持 た な い 細 胞 の 中 で ど の よ う な 役 割 を 果 た し て い る の か を 明 ら か に す る こ と が‑ 1 0 4 ‑
LetD 機 能
の中和⑪
A
J @
‑
活性型 ジャイレース
不活性型 ジャイレース
図
10
・2 LetD
蛋白質によるDNA
ジャイレース活性調節の分子機構に関するモデルLetD
蛋白質は、LetA
蛋白質により作用が抑えられる。LetD
蛋白質は、LetA
蛋白 質が存在しない状態では、DNA
ジャイレースに作用するが、この作用には丁I d D
、TldE
、GroE
蛋白質がZ f i A
蛋白質の機能を抑えることが必要である。TldD
、TldE
，GroE
蛋白質が働かない状態では、LetD
蛋白質の作用はZ f i A
蛋白質により妨害され る。‑ 1 0 5 ‑
ドキュメント内
九州大学薬学研究科薬学専攻
(ページ 53-65)