1 . 0  EcoRI

KmR 

2 . 0  H i n d l l l  

己 ::  :  :  : : :  : : :  :   :  :   :  : : : : :  : : :  : : :  : : :  :  : : C ミ

t d i O  

CmR 

( K b )  

( Kb ) 

P s t l 

図 9

・

1( A )   t l d O 遺伝子の遺伝子破壊に用いたプラスミド pKP2045 が持つ t l d O 遺 伝子領域の構造

( 8 )   t l d E 遺伝子の遺伝子破壊に用いたプラスミ ド pKP1832 が持つ t l d E 遺 伝子領域の構造

‑ 9 1 ‑

換 体 は す べ て

p K P 1 8 3 2

が 染 色 体 に 組 み 込 ま れ た も の で あ る 。 こ の 中 か ら 、 組 み 換 え に よ り プ ラ ス ミ ド と 共 に 野 生 型 斗

s l l i

遺 伝 子 が 切 り 出 さ れ 、 遺 伝 子 破 壊 さ れ た

t1  d E

遺伝子(0.斗且1.:

:ç_~_U が残った菌を得、 KP5672 と命名し、

^{以 後 の 実 験}

に 用 い た 。 受 容 菌 に

p K P 1 8 3 4

を導入しておいたのは、もし、

t1  d  E

遺 伝 子 が 細 胞 の増殖に必須な遺伝子である場合にも、

p K P 1 8 3 4

プラスミドの斗止

E

遺 伝 子 か ら

T l d E

蛋 白 質 が 供 給 さ れ 遺 伝 子 破 壊 株 が 増 殖 で き る よ う に す る た め で あ る 。

t  1  d D

遺 伝 子 の 場 合 に は 、 そ の 遺 伝 子 破 壊 に 直 鎖 状

( l i n e a r )

プラスミ ド

D N A

を 大 腸 菌 旦

d

変 異 株 に 導 入 す る

R us  s  e  I  1

ら

( 1 9 8 9 )

の 方 法 (

r  e  c  0

変 異 株 中 へ は 直 鎖 状

D N A

を 形 質 転 換 が 可 能 で 、 プ ラ ス ミ ド

D N A

は 宿 主 染 色 体

D N A

ヘ 組 み 込 ま れ る ) を 用 い た 。 プ ラ ス ミ ド

p K P 2 0 4 5

は ク ロ ー ン 化 し た 斗

d D

遺 伝 子 内 の

l l i I

部 位 と 遺 伝 子

3

・末端に構築した

( s i t e d i r e c t e d   m u t a g e n e s i s

法 に よ り ) 位 以 部 位 の 問 に 、 カ ナ マ イ シ ン 耐 性

( k a

旦 ) 遺 伝 子 の カ セ ッ ト を 組 み 込 ま せ て 構 築 した(図

9 ‑ 1 A )

。 受 容 菌 と し て は 、 旦 辿 変 異 株

F S 1 5 7 6

に 、 予 め 野 生 型 斗 位 遺 伝 子 を ク ロ ー ン 化 し た

mi  n  i ‑ R

プ ラ ス ミ ド

p K P 1 9 8 6

を 導 入 し て 斗

d D

遺 伝 子 を 相 補 さ せた

K P 5 6 8 8

を 用 い た 。 こ の 株 に 、 直 鎖 状 の

p K P 2 0 4 5 D N A

を 導 入 し 遺 伝 子 破 壊 さ れた

l

上位遺伝子(0.斗姐也旦)を持つカナマイシン耐性形質転換体

K P 5 6 9 1

を 得た。

第

2

節 遺 伝 子 破 壊 株 の 性 質

t 

1  d  E

遺 伝 子 が 大 腸 菌 細 胞 の 増 殖 に と っ て 必 須 な 遺 伝 子 で あ る か 否 か を 検討した。 まず、

p K P 1 8 3 4( m i n i ‑ R

斗且

1 + )

を持つ

K P 4 7 1 1

株(斗五二

1 5 :: T n

lQ  t 

1  d  0 +  

)に遺伝子破壊した斗止

E

遺伝子(ふ

ι ̲M :

:旦よ)を形質導入により導入、

KP6229 株 (ill斗~: ^{: T n}

^lQム斗

^{M::  ill/  m  i  n  i  ‑ R}

^斗...d.E̲+) を 作 製 し た 。 こ の 株 で 増 殖 さ せ た

P 1

ファージを用い、

K P 2 4 5

(斗止1.+) および

KP245/pKP1834 (ι

̲Q1+ 

/mini‑R t l d E + )

を受容菌として形質導入を行った。

K P 2 4 5

を 受 容 菌 に 用 い た 場合にも、

KP245/pKP1834

を 用 い た 場 合 問 機 、 テ ト ラ サ イ ク リ ン 耐 性 形 質 導 入 体 の 約

20%

は ク ロ ラ ム フ エ ニ コ ー ル 耐 性 形 質 導 入 体 で あ っ た 。 野 生 型

t1  d E

遺 伝 子 で 相 補 さ せ な い 条 件 下

( K P 2 4 5

を 用 い て も ) で も 遺 伝 子 破 壊 株 が 得 ら れ た と

‑ 9 2 ‑

いうこの結果は、斗昼

E

遺 伝 子 は 大 腸 菌 の 増 殖 に と っ て 必 須 で は な い こ と を 示 す ものである。

斗

d D

遺 伝 子 が 大 腸 菌 細 胞 増 殖 に と っ て 必 須 で は な い こ と は 、 斗

s l l i

遺 伝 子 に 用 い た の と 問 機 の 方 法 に よ っ て 示 さ れ た 。 ま ず 、

K P 5 6 9 1

株 か ら 遺 伝 子 破 壊 された

t 1  d D

遺伝子(0.斗姐包旦)を移して、

K P 6 2 2 8

株(辿主斗土

: : T n

lQ 0.

1 比E :  :kan/mini‑R  t l d D

つ を 構 築 し た 。 こ の 株 で 増 殖 さ せ た

P 1

ファージを用い、

K P 2 4 5  

(斗

d D

づ 、 お よ び

KP245/pKP1986

(斗止

l t/

^皿

i n i ‑ R

斗盟+) を 受 容 菌 と して形質導入を行った。

K P 2 4 5

を受容菌に用いた場合にも、

KP245/pKP1986

を 用 い た 場 合 同 様 、 テ ト ラ サ イ ク リ ン 耐 性 形 質 導 入 体 の 約

60%

は カ ナ マ イ シ ン 耐 性 形 質 導 入 体 で あ っ た 。 こ の 結 果 は 、 斗 且

E

遺伝子同様、 t

1  d D

遺 伝 子 も 大 腸 菌 の 増 殖 に と っ て 必 須 で は な い 遺 伝 子 で あ る こ と を 示 す も の で あ る 。

上述の実験では、斗昼

E

遺 伝 子 、 斗

M

遺 伝 子 が 互 い に 類 似 し た 機 能 を 持 つ た め 、 一 方 を 破 壊 し て も 、 他 方 が そ の 機 能 を 補 う た め 一 見 増 殖 に 必 須 で は な

く見えるという可能性を否定することはできない。そこで、

K P 6 2 2 9

株(む五二

I I

:  : T n

lQ 0.斗...Q1:弓

ι/mini‑R

斗些+)で集積した

P 1

ファージを、

KP 2   4 5  

(μ

̲ Q   + 

)、 お よ び

K P 4 6 8 8

(斗盟日)に形質導入し、斗位̲Q̲Qム斗

M::ill2

重 変 異 株 の 構 築 が可能か否かを検討した。 表

9 ‑1

に示すように、いずれの受容菌に対しても、

テ ト ラ サ イ ク リ ン 耐 性 形 質 導 入 株 の

20%

はクロラムフェニコー/レ耐性であった。

この結果は、斗昼

2

斗Jlli

2

重 変 異 株 が 増 殖 可 能 、 即 ち 両 者 を 同 時 に 変 異 さ せ て も大腸菌は増殖できることを示している。

遺 伝 子 破 壊 に よ っ て 作 製 し た

A

斗必也旦変異、0.斗...d.E̲::旦

i

変異が、

第

2

章 に 述 べ た 変 異 誘 起 剤j処 理 し て 分 離 し た 斗

A

変異株同様、

F

因 子 江 民

( a m )

変 異 株 に よ る 増 殖 阻 害 を 受 け な く な っ て い る か 否 か を 検 討 し た 。

F

因子

I e  t A   ( a m )

変 異 株 に 対 す る 感 受 性 は 、 ラ ク ト ー ス を 唯 一 の 炭 素 源 と す る 合 成 培 地 の 上 に 対 数 増 殖 期 の 供 与 菌 を 広 げ 、 こ の 上 に 受 容 菌 を レ プ リ カ し 、 平 板 培 地 上 で の 接 合

( p l a t em a t i n g )

行わせ、

L a

ド 接 合 体 の 形 成 の 有 無 に よ り 判 定 し た 。 図

9 ‑ 2 8

に 示 し た よ う に 、 野 生 型

F

斗旦因子

f 1 3 ‑ 1

と の 接 合 の 場 合 、 用 い た 全 て の 受 容 菌は

L a c +

接合体を形成する。これに対し、

F

因子

l e t A ( a m )

変 異 株 と の 接 合 に お い て は 、 野 生 株

K P 2 4 5

(斗

s r )

は

L a c +

接 合 体 を 形 成 し な い ( 図

9 ‑ 2 A 1

段目)が、

‑ 9 3 ‑

表

9 ‑ 1 t l d D

、

t 1  d E  2

重変異株の構築

受 容 菌

T c

^R形 質 導 入 体 同 時 形 質 導 入 頻 度

ム t l d E : : c a t

数

変異

C r n

^R 

C r n

^{S  計} /日五斗互 ::

T n

lQ数 (A) 

( 8 )  

K P 2 4 5   t l d +   2 2 . 5   8 5 . 5   1 0 8   2 1   %  KP4688

斗且目立

^{21 .5  8 6 . 5   1 0 8   2 0}  

供 与 菌

KP6229 

KP6229

株(ム斗̲̲dl:: 

l l i

斗五斗立:

: T n l 立 /mini‑R t l d E + )

を供与菌として、

S i l v e r y

ら

(1984)

の方法に形質転換を行った。 得 ら れ た テ ト ラ サ イ ク リ ン 耐 性 形 質 導 入 体 中 、 ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル 耐 性 株 の 頻 度 よ り 同 時 形 質 導 入 体 の 頻 度 を

計算した。

2 

3  4 

5  6 

7 

図

9

・

2 z

似変異によるtld変異の抑圧

平板接合法により、各種変異株のF因子letA(am)変異に対する 感受性を調べた結果を示した。 (A)では KP75(KPF14)を、

( 8 )

では KP75(F13^・1)を供与菌として用いた。受容菌は、それぞれ、 1， KP245(tld +

) ;  2

， KP5727(zfiA 13 ::Tn 10 );  3， KP5726(ムtldE::cat);  4， KP5725(ムtldO::kan ); 5， KP5738 ム(tldE::cat  z打A13::Tn10);  6， KP5737(ムtldO::kan  zfiA 13 ::Tn 10 );  7， KP5735(ムtldO::kan  ムtldE::cat) 

‑94‑

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ドキュメント内 九州大学薬学研究科薬学専攻 (ページ 49-52)