関す 研究 病 細胞 細胞 転 急性白

金^{沢 大}学十 全 医学 会 稚 託 第1 01巻 第⁴ 号 6 6 3‑6 75 (1 9 9 2)

急性 白血病細 胞^の細 胞回転に 関す^る研 究

‑ フ ^{ロ ー} サイ トメ ト リ ^ー を用^いた生 体 内^{で の}解析 ^‑

金 沢 大 学 医学 部 内科 学 第^三講座 ( 主 任^: 松田 保 教 授)

神 野 正 敏

( 平 成4 年6月2 6 日受 付)

66 3

生 体 内^における急 性 白血病 細 胞の細 胞^回転を解 析 する 目的^で, チ ミジンの同 族 体^であ^{る ブロ モデ オ キシ}ウ リ ジ^ン (br o mode o xyu ridin e,Brd U) と そ^{の モ ノ クP ‑ ナ ル}抗 体(^{m o n o c}lo n ala ntibody, M oA b) を 恥 ^､て^{, フ ロ ー} サイ トメ ト リ^ー (flo w Cy tO m etry･ F C M) 法^{によ る}検 討^を行^った･ 細 胞 増 殖 動 態^の指 標^{と して}骨 髄 中^の急 性 白血病 細 胞^の, D N A 合 成 期 (^syntheti｡ pha s e, S 期) 比率を表す Brd U 標 識 率( Brd U^‑1abeling inde x,Brd U L I), D N A 合成 期時 間(^the du r ati_{o n o}f synthetic pha s e,

Ts) ^{お よ び}理 論 的 倍 化 時 間 (^the pote ntial do ubling tim e,T_pot) を選び解 析^{し た.} 対 象ほ一 本研 究^の主旨に同 意^の得ら れ た, 急 性白血病 患 者2 2例である^･ Brd U‑^{L I を測 定 する た め}, 化 学療 法 施 行 前^に 2 0 0r ng/^{m2の Brd U} を ^一 度^に静 脈 内 投 与した後, 30分 後^に骨 髄 細 胞を採 取し た･ 細 胞を ^‑ 2 0 ℃の7 0% 冷^エ タ ノ ^ー ル で固 定^し, 2 N 塩 酸で D N A 変 性 処理 を行った軋 抗B,d U MoA b を用^いて免 疫 螢 光抗 体 法 間 接 法によ り染 色し た^･ さ らに _, プ^ロ ビディウム ^･ アイ オ ダ イ ド(pr opidiu m iodide, P I) にて 染色し, F C M (E P I C S^‑C S) を用^いて Brd U の標 識 細 胞^{お よ び その D N A} 量^の分 布を同 時^に測 達し た^. 対 象と し た 2 2例^の Brd u L I ほ2･4% ^{か ら1 8･2}% , 平 均 値^{1 0･4}% ^であり D N A ^ヒス ト グラムか ら計 算さ れ た S 期 細 胞 比率^{よ り}有 意^に低 値^であった.

こ の差は S 期^に相 当 す^{る D N A} 量を有し な が ら D N A 合成を行って いない, いわ ゆ る quie s c e nt( S｡) 細 胞^の存在^に起 因して い る と考え ら れ た･ Brd U 投 与3 0分 後^の標 識 率(B^rd U‑^{L I･}1) に加 え て, 1 回 目の骨 髄 穿刺 後^に再び 20 0m g/^{m 2 の Brd U を1 5 0}分 か け て持 続 点 滴 ^し, 2 回 目^の 骨 髄 穿 刺を行い_, 1 回 目^の Brd U 投 与から 持 続 点 滴 終 了ま で^の 間^に増 加し た標 識 率 (Brd U‑^{L I･2}) を測 定し た^･ Ts と Tpot ほこ の 2 匝】の Brd U‑^L= 臥 すな わ ち B^rd U‑^{L ト1 と Brd U}‑^{L I･}2 を プ^ロ ッ トする^ことに

よって得ら れ た 回帰 直線をもと^に算 出さ れ た^{･ こ}れ らの結 果は, 他^の方 法^によ り算定さ れ た値^{とほぼ 一}致^{して い}た^. B_rd U^‑L I と化学 療 法効 果^{お よ び}再 発との相関^につい て検 討し た と^ころ, 完 全 寛 解 (^{c o m}plete r e mis sio n,C R) 到 達 群^の標 識 率ほ非 寛 解

(failu r e) 群の標 識率^{よ り}有意^に低^{か った･} ま た, 再発(^{r e}lap^{s e})群^の初回治 療 前^の標 識 率ほ, 寛解 維 持 群^の標 識 率^に比^べ高^い傾

向^にあった が^, 有 意^な差は な かっ た^･ F C M によ る Brd U 標 識と D N A 量の同 時測 定^ほ, 生 体 内^における細胞回転^の指標を,

従来^の方法よ りも正確^に簡 便^かつ迅 速^に解 析^でき^る有 用な方 法である^.

Key ^{w o r}ds acute le uke mia･ br om ode o xy^uridin e, C ell cy^cle,flo w cy t^{o m e}try^, S _phas e

腫瘍を特 徴^づける最 大^の性 質ほ細 胞^の異 常 増 殖であり, そ^の 発育速 度や増 殖 動 態の解析は 巨踵 瘍^の基 礎 的 研 究^のみ な らず 臨 床上も治療 法^の決 乱 予後^の推 定な どに極めて有 用^である^. 196 0年 代よ りオ ^ー トラジ オ グラフ ィ ^ーが普及 し, ト リ チ ウムチ

ミジ^ン(^tritiatedthymid in e,

3H l^､d R ) を 軌 ^､た細胞 増 殖 動 態^の研 究が盛^んにな り, 種^{々 の}腫 瘍^に つい て細 胞増 殖動 態の解 析^が試

みられ た^{1 ト 3 )}. し か し, こ の方 法^ほ解 析^に長 時 間を要 する 上^に,

放射性 同位元素を用^いる た めにさ まざま な制 約があり, 個々の

腫瘍に つ い て の検 討 結 果を臨 床^に利 用 す^ること ほ 不 可能^であっ

た･ ま た, 白^血病^におい ては, 各^{々 の}腰 瘍 細 胞が 血液 中^に遊 離 し た状態^にあり, 検 体^の採 取が容 易で, しかも 大 量^の細 胞を解 析できる た め比 較 的 検 討^が進ん で^い る^. し か し, 生 体 内 (ⁱⁿ

Viv o) にお け る白血病 細 胞^の増 殖 動 態を解 析 する た めにほ,

≠T d R など^の放 射 性 同 位 元 素^で標 識^{し た}核 酸 前駆 物 質^を直 接

A b b_{r e v}iatio n s ‥ A L L , a Cute l_y mpho cy tic leuke mia; my^elo m o n o cy tic le ukemi a; A M oL, a C ute m O nOCytic

体 内^に住^人す^ること が 必要であり, 生 体^への影 響を考慮し, 一

部の報告を除いて生体 外(i□ Vitr o) ^で検 討さ れて いたにす ぎな か っ た^{3 ト 7}■^■

1 9 8 1年, Gr atz n e r ら^{8‑ 9 }}によ りチ ミジンの同族 体であ る ブ^ロ モ

手オキシ ウリジン (b^{r o m o}de o xyu rid in e, Brd U ) に対 する^{モ ノ ク}

ロ ^ー ナル 抗 体(m o n o clo n al a ntibody^, MoA b) が開 発さ れ ,

D N A 合成 期(synthe tic pha s e, S 期) に存 在 す^る細胞を容 易^に 同 定^できる よ うになっ た^. B^rd U は取り込まれた細 胞^の放 射 線

に対 する感受 性が高ま る^こと か ら, 臨 床上放 射線 増感 剤^{と し て} 脳腫 瘍, 頭 頸 部腫 瘍^の治 療^に用^いら れ^{て い}る薬 剤^である^刷. 本 剤ほ直接 生 体 内^{へ の}投 与が 可能である^こと か ら, これ を 用い て

白血病を は じ め とす^る各 種 腫瘍^の生 体 内で^の増殖 動態^の解 析が 可能^になった^{‖ ト 1 3 )}

Brd U と そ れ^に対 する M oA b を用いて行う細胞 増 殖 動 態の解

A M L , a C ute my^elog^{en eou s} le uk e mia; A M M oL ; ^{a c u}t^e le uk emi _{a ;} A P L, a Cute prO my^elo cy tic le uke mia; A U L ,

a C ute u n cla s sified le ukemi a; Brd U ･ br o m ode o xy^{u r}idin e; Brd U ^‑L I, Brd U ^‑labelin _g inde x; C R, C O mplete r e mis sio n; C V_, C O efficie nt of v a riatio n; F A B , Fr r e n ch^‑A m e ric a n^‑British cla s sific atio n; F C M ,flo w cy to m etry ;

析 法と し^ては, 免 疫 紅 織 化 学 的 方 法^{1 2)} と螢 光 抗 体 法^に よ る^フ

ロ ^p サイト メ ト リ ^ー (^{flo w c}y to m etry^,F C M) 法^{相 1 5 )}と がある^. 前 者は各^{々 の}細 胞を直 接 顕 徴 鏡 下^で観 察^{し な が ら}計 測 する た め に 日 経瘍 細 胞^{と 正}常 細 胞^の区別が容 易であり, 細 胞 数^の少な^い 検体や, 腫 瘍 細 胞^の占め る割 合^の低^い検 体^にも利 尉^でき^る. 特

に急 性 白血病で は, 正常 骨髄 細 胞^に混じって_, 少 数^の白血病 細 胞し か見ら れ な^い例 ( 低 比 率白^血病), あ^るいほ骨髄^が低 形 成^で ある た め^{に 一} 定 量^の細 胞^の採 取が でき ない例 ( 低 形 成 性 白血 病) ^での解 析^にほ免 疫紅 織 化 学 的 方 法^は極^{め て}有^用であ^{る1 6 ト 1 8)}

これ^に対し後 者は,

‑一

度^に大量^の細 胞に^ついて迅 速^に処 理, 解 析が 可能^であり, 急 性 白^血病^ので充 分な細 胞 数が得られ, 有 核 細胞^の大 部 分^が白血病 細 胞で占め ら れ^{て い}る場 合^の解 析^にほ優 れ た方 法である^.

F C M に用^いる機 器^{ほ 1 9 6 8}年^に開 発さ れ た が, その測 定 速 度 ほ早く, ま た測 定 精 度は高 く∴画 期 的な装 置といえ る^{1 g).} これ ま で^の F C M に関 す^る報 告^ほ, 細 胞 動 態^{の 一}時 点^{のみ を と ら え} たも^のが多かった が, Brd U お よ び^これの M oA b の出 現^によ り 連 続 的^に細 胞 動態^{を と ら え ること が 可}能^{と な った .} 本 研 究で ほ▲ 白血病細 胞^の増 殖 動 態を生 体 内で解 析 する方 法を開 発 する 目的^で, 未 治 療^の急性白^血病 患 者^{に Brd U を}経 静 脈 的^に投 与 し, 骨 髄 中^の白血病 細 胞^の本 剤に よ る標 識 率 (^{Brd U‑1abelim} g inde x,Brd U^‑LI)を F C M を用^いて測 定し た^. さ ら^に, 本 剤を ^‑

定 時 間 持 続 点 滴 静 脈 す^{ることによ り}, D N A 合 成 期 時 間(^the

du r atio n of syⁿthetic pha s e,Ts) お よ び 理論 的 倍 化 時 間 (^the p^ote ntial do uling tim e,T_pot) ^の算 定が 可能^である か否か を検討

し た^･ さ ら^に, 得ら れ た結 果と治 療 効 果と^の関 連 性につ いても 検討^した.

対 象 お よび 方 法

Ⅰ^. 対 象

1 . Brd U によ る標 識 率^を測 定^{し た}症 例

末 治療^の急 性 白血病 患 者^{2 2}例を対 象^{と して}, Brd U によ る標 識 率を求め た. 年 齢は1 6才か ら7 9才で, 男性1 2例, 女性^{1 0}例で ある ^. 病 塾は 急 性 骨 髄 性 白血 病 (^{a c ute} myeloge n e o u s

le ukemi a, A M L) 6 例 (Fr e n ch‑^{A m e ric a n‑British cIa s sific atio n} (^{F A B} 分 類), 全 例 ^{M 2}; うち ^{r e}fr a cto ry a n e mia with e x c e ss Of bla sts,R A E B か らの移 行 例1 例), 急 性 前 骨 髄 球 性 白血病 (^{a c ute} pr o myelo cy tic le uke mia, A P L) (^{F A B} 分 類^{M 3}) 3凧

急 性 骨 髄 単 球 性 白血 病 (^{a c ute m}yelo m o n o cy tic le ukemia.

A M M oL) (F A B 分 類 M 4) 4 例, 急 性 単 球 性 白血病 (^{a c ute}

m o n o cy ticle uke mia, A M oL) (^{F A B} 分煩 ^{M 5a}) 2 例, 急 性ワン パ性 白血病 (a c utelym pho cy ticle uke mia, A L L) 6例 (F A B 分 額 ^{L 1 2} 例, L 2 4 例), 分 類不能^の 急 性 白^血病 (^{a c ute}

u n cla s sified le uke mia,A U L) 1 例であ^った^. 診 断 時^の末梢血中

Tab lel^. Patie nt cha r a cte ristic s, C ell k inetic s a nd clinic al o utc o m e

Diag^{n o s}is % of le ukemi c % of S^‑_pha s e(^{1 0})c e11s Clinical

Patie nt A ge Se x (F A B)⁽⁾⁾ c ellsin B M^(閏 Brd U ^‑L I D N A histogr a m o utc o me

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 12 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2

F M M M F F M F F M M M F M F F M M M M F F

0 0

1 6 5 1 7 3 1 4 9 7 4 6 7 1

∧

U O 6

<

U

O

qV

1 3 5 6 2 6 3 4 2 3 7

史 U

7 4 1 2 2 2

1

⊥

6 7 2 7

A M L ^仔)(^{M 2}) A M L (M 2) A M L (^{M 2}) A M L (M 2) A M L (^{M 2})

7 0.0 6 8^.0 9 2.0 8 8^.0 9 0.0 R A E B^(3)→A M L(^{M 2}) 5 7^.O A P L^【一〉(^{M 3}) ^{9 4.4}

A P L (^{M 3}) 9 6^.4

A P L (^{M 3}) ^{9 9.O}

A M M oL^{@ )}(^{M 4}) ^{1 0 0.0} A M M oL (M 4)

A M M oL (^{M 4}) A M M oL (M 4) A M oL^脚(^{M 5a}) A M oL (M 5a) A L L ^m(^{L l}) A L L (L l) A L L (^{L 2}) A L L (L 2) A L L (^{L 2}) A L L (L 2) A U L^(8I

6 3^.2 8 3.4 6 6^.4 8 6.0 9 9^.5 98.0 9 6^.8 9 6.8 8 3^.6 9 8^.0 9 9^.0 7 4^.0

0 2 4 5

ご U

9 4 7 4 3 2 3 9 3 3 1 5

0 0

2 3 7 8 0 4 1 5 4 7 2 9

0 0

2

ロリ

蔦 U

7 4 8 6 7 5

0 0

2

丘 U

9 1 1 1

1

1 1

1

1

1 1

N D^{(1 1)} C R^{(I 2)}

N D C R

l l.7 F^{(1 3 )}

1 3^.7 C R ^→r elaps e

1 3^.2 F

8.8 C R

5^.9 C R

8.3 C R

l O^.1 C R

32.7 F

1 6^.2 F

8 ^.8 F

l O^.9 C R

1 5^.1 C R

l O^.3 F

1 5^.2 C R ^→r elap^{s e} 2 6.7 C R ^→r elap^{s e}

2 1^.2 F

2 2.2 C R ^一→r elaps e F

二 F 二 F

(¹), Fr e n ch^‑Ae ric a n^‑British cla s sific atio n; (²), a C ute my^eloge n e o u s le uke mia; (³), r efr a cto ry a n e mia with e x c e s s of bla sts;(4), Ac ute pr o m yelo cy tic le ukemi a;(5), a C ute m yelo m o n o cy tic le ukemi a;(⁶), a C ute m O n O Cy tic le ukemi a;(7)･

a c ute lym pho cy tic le uke mia;(⁸), a C ute u n Cla s sified le ukemi a;(⁹)^{, bo n e m a r r o w ;} (1 0), Synthetic pha s e; (1 1)^{･ n Ot} do n e;(1 2), C O mPlete r e mis sio n;(1 3),f ai 1u r e^.

3H ^‑T d R , tri^tiated thy^midi^{n e} ; Go,the z e r o g^{r o w}th _phas e; G ^l, the first g^{r o w}th _pha s e; G², the se c o nd _gr o wth pha s e ; M , mitotic‑pha s e; M oA b, m O n O Clo n al a ntibod_{y ;} P B S, pho sphate^‑buffe r ed s alin e; P I, p^{r O}pidi^{u rn} iodide; R A E B, r efr a cto ry ^{an e m}ia with e x c e s s of bla sts; S, Syⁿthetic pha s e; Tp^ot

, the p^ote ntial do ubling

tim e; Ts_,the d u r ation of syⁿtheti^c pha s e