経皮吸収促進剤の促進機構とペプチド性医薬品の経皮吸収に関する研究
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(2) 博 士学 位 論 文. 経 皮吸収 促進剤 の促 進機 構 と ペ プ チ ド性 医薬 品 の 経 皮 吸 収 に 関 す る研 究. 平成11年9月. ト 才. 剛.
(3) 目. 次. 1. 緒論. 第1章. イ ン ドメタ シ ンと尿 素 の皮 膚透過 におけ る経 皮 吸収促 進剤 の促進 機構 お よ び透過 パ ラ メーター と促進 因子 との関係. 第1節. 緒言. 4. 第2節. 実験 材料 お よび操 作方法. 4. 第3節. 実験結果. 9. 第4節. 考察. 18. 第5節. 小括. 20. 第2章. 細 胞 間ル ー トにおけ る高分子水溶 性物質 の経 皮 透過機 構 と経皮 吸収促 進剤 に よ る促 進効 果. 第1節. 緒言. 21. 第2節. 実験 材料 お よび操 作方法. 21. 第3節. 実験結果. 23. 第4節. 考察. 27. 第5節. 小括. 28. 第3章. 高分 子 水 溶 性 モ デ ル 物 質 の 皮膚 透 過 に お け る几octyl一 β一D-thioglucoside の 促 進 機 構 と角 質 層 除 去 皮膚 に お け る水 溶 性 薬 物 の 分 子 量 依 存 性. 第1節. 緒言. 29. 第2節. 実験材料および操作方法. 29. 第3節. 実験結果. 32. 第4節. 考察. 38. 第5節. 小括. 39.
(4) 生 理 活 性 ペ プ チ ドの エ ビラチ ドお よ び エ ル カ トニ ンの ラ ッ トに お け る経 皮. 第4章. 吸 収 性 に 関 す る検 討. 第1節. 緒言. 40. 第2節. 実験材料お よび操作方法. 41. 第3節. 実験結果. 45. 第4節. 考察. 50. 第5節. 小括. 51. 第5章. エ ルカ トニ ン経 皮吸収 剤 の実験 的骨粗 霧症 に対す る有効性. 第1節. 緒言. 52. 第2節. 実験材料お よび操作方法. 53. 第3節. 実験結果. 55. 第4節. 考察. 58. 第5節. 小括. 59. 総括 お よび結論. 60. 参考文 献. 63. 略語一 覧. 68. 研究業績一覧. 69. 謝辞.
(5) 緒. 論. 薬 物 は通 常 適 用 に 便 利 で、 目的 とす る 効 果 が 効 率 良 く発 現 す る よ うに特 定 の 形 状 い わ ゆ る剤 型 に加 工 され た後 、 様 々な 経 路 か ら生 体 に投 与 され る 。 この剤 型 は薬 物 の 吸 収 や分 布 に 大 きな 影 響 を及 ぼ し、 作 用 発 現 部 位 へ の 薬 物 分 子 の 到 達 性 を支 配 す る重 要 な 因子 と な っ て い る。 す な わ ち、 投 与 後 吸 収 され た薬 物 は、 血 流 に の っ て 各 臓 器 に分 布 し、 や が て 肝 臓 で の 代 謝 や尿 中排 泄 に よ っ て 生体 か ら消 失 す る 。治 療 効 果 は、 生 体 内 の作 用 部 位 に 到 達 し た薬 物 分 子 に よ り発 現 す る が 、 他 の 部 位 へ 移 行 した過 剰 の薬 物 分 子 は 、 しば しば 副 作 用 の 原 因 とな る。 よ っ て、 望 ま し い治 療 効 果 を得 るた め に は 、 薬 物 を で き る だ け 選 択 的 か つ 適 切 な 濃度 で 、 作 用 部 位 に送 達 させ る こ とが 不 可 欠 で あ る 。 この よ う な観 点 か ら、 投 与 部 位 か ら作 用 発 現 部 位 に 至 る ま で の薬 物 の 動 き を トー タ ル シ ステ ム と して と らえ、 各 種 技 術 を利 用 す る こ とに よ っ て 最 高 の 治 療 効 果 を得 る こ とを 目的 と した 投 与 形 態 が ドラ ッ グデ リバ リー シ ステ ム(DDS)で. あ り、 近 年 の 創 剤. 学 の発 展 と も相 ま っ て 、 医 薬 品 開 発 の成 果 を に ぎ るカ ギ と して 、 大 いに 注 目 され て い る1 3)。 DDSは 、1)作 リー ス,2)薬. 用 部 位 で の 濃 度 一時間 パ タ ー ンを最 適 化 し よ う とす る コ ン トロー ル リ 物 の 生 体 膜 透 過 時 の障 壁 を減 少 させ る こ とに よ る吸 収 の 改 善,3)分. 布. の 過 程 を制 御 す る こ とに よ って 薬 物 を特 定 の部 位 に送 達 させ る タ ー ゲ ッテ ィン グの3 つ に大 き く分 類 可 能 で あ る4>。 この 中 で もコ ン トロ ー ル リ リー ス は 既 存 の 薬 物 を そ の ま ま利 用 で き る た め 、 技 術 的 、 コ ス ト的 そ して 時 間 的 に 優 位 で あ り、 ま た 様 々 な 製 剤 に 応 用 が 可 能 な た め 、 盛 ん に 開発 が 行 わ れ て い る。 特 に 全 身 作 用 を 目的 と した薬 物 の 皮 膚 か らの 投 与 、 す なわ ち経 皮 吸 収 治療 シ ステ ム(TTS)を. 用 い た手 法 は、 体 内 の薬 物. 濃 度 を長 時 間 定 常 状 態 に保 て る こと よ り早 くか ら開 発 が進 み、 現 在 臨 床 の場 で も応 用 され て い る。 そ の一 例 と して狭 心 症 治療 薬 で あ るニ トロ グ リセ リ ンお よ び 硝 酸 イ ソ ソ ル ビ ドの製 剤 、 喘 息 治 療 を 目的 と し たツ ロブ テ ロー ル の 製 剤 等 が あ る。 この よ うな 製 剤 の 開 発 が 進 ん だ理 由 と して は、 従 来 よ り皮 膚 を対 象 に し た局 所 適 用 製 剤 が 多 く存 在 し、 技 術 的 に優 位 だ っ た こ と、 表 面積 が 他 の 部 位 に 比 べ 格 段 に 広 く適 用 が容 易 で あ る こ と等 もあ げ られ る 。 経 口投 与 剤 や注 射 剤 と比較 したTTS製 剤 の 長 所 と し て次 の よ うな もの が あ げ られ る。. 1.
(6) ① 適 用 面 積 の変 化 に よ り、 投 与 量 を容 易 に 調 節 す る こ とが 可 能 で あ る 。② 制 御 膜 の 併 用 等 に よ る薬 物 の放 出 制 御 が 可 能 で あ る。③ 皮 膚 か ら吸 収 され た 薬 物 は直 接 体 循 環 に移 行 す る た め、 肝 臓 で の 初 回通 過 効 果 を回 避 で き る。 ④ 経 口投 与 時 の食 事 の 影 響 を 回避 で き る。⑤ 消 化 管 障 害 や注 射 剤 に よ る痺 痛 を 回避 で き る。⑥. 長 時 間 の連 続. 投 与 が 可 能 で あ る。 ⑦ 投 与 回 数 を軽 減 で き る等 で あ り、 患 者 の コ ン プ ラ イ ア ンス 改 善 に も有 用 で あ る。 一 方TTS製 剤 の 欠 点 と して 、 皮 膚 の かぶ れ や損 傷 、 長 期 連 用 に よ る耐 薬 性 の 発 現 等 が あ げ られ る が 、 最 大 の 問題 に、 薬 物 の 吸収 率 の 悪 さが あ る 。 つ ま り皮 膚 は 元 来 、 薬 物 を は じめ とす る物 質 の 透 過 性 が低 い と い う特 徴 が あ る。 この透 過 性 の低 さの 原 因 に、 皮 膚 の最 外 部 に 位 置 す る角 質 層 のバ リア 機能 が あ げ られ る。 この 角 質 層 は ケ ラチ ンや 繊 維 状 タ ンパ ク 質 で満 た され た核 の な い偏平 な 死 細 胞 で あ り、 疎 水 性 の た め本 来 は 体 内 水 分 の蒸 発 を 防 ぐな どの 役 割 を有 して い る。 そ の た め、 特 に親 水 性 薬 物 の透 過 性 が 低 い。 しか し この 透 過 性 、 特 にバ リア で あ る角 質 層 の薬 物 透 過 性 を 高 め れ ば 、DDSの も う一 つ の 目的 で あ る吸 収 の 改 善 につ な が る こと に な る5'6)。 と ころ でDDSに 用 い る薬 物 の 選 定 に は 、 そ の 利 点 を活 用 し、 長 期 投 与 が必 要 な もの 、 す な わ ち慢 性 疾 患 の治 療 薬 が 望 ま しい と され て い る。 これ にTTSの 利 点 を加 え、 薬 物 を 考 え た場 合 、 ペ プ チ ド性 医 薬 品 が一 つ の 候 補 に挙 げ られ る7)。 我 々 の 体 内 を支 配 す る 微 量 活 性 物 質 の 一 種 で あ る、 ホ ル モ ンな どの ペ プチ ドは生 理 活 性 が き わ め て高 く、 比 較 的 安 全 性 に も優 れ て い る た め、 薬 物 と して 有 用 で あ る。 た だ し、 生 理 活 性 ペ プチ ド は初 回通 過 効 果 の た め、 経 口投 与 で は ほ とん ど効 果 が な く、 現 在 、 ほ ぼ 全 てが 注 射 剤 とし て用 い られ て い る。 しか し、 ペ プ チ ド性 医 薬 品 は一 般 に 長期 投 与 が 必 要 な た め 、 注 射 剤 で は コ ンプ ラ イ ア ン ス の 面 で 問題 が あ る。 そ の た め 初 回通 過 効 果 を 回避 で き、 連 続 適 用 の 容 易 な ペ プ チ ド性 医薬 品 のTTS製 剤 を開 発 す る こ とは 将 来 的 に 重 要 視 され る と考 え られ た8)。 そ こで 本 研 究 に お い て著 者 は 、 フ ラ ンッ型 拡 散 セ ル を用 いinvitroに. お け る薬 物 の. ラ ッ ト皮 膚 透 過 性 お よ び経 皮 吸 収 促 進 剤 使 用 時 の促 進 機構 の解 明 を企 図 した。 更 に、 ラ ッ トに ペ プ チ ド性 医 薬 品 を 含 有 す るTTS製 剤 を適 用 し た と きの 、 体 内動 態 、 薬 理 効 果 等 に関 す る検 討 を行 い、TTS製 剤 の有 用 性 お よ び開 発 の 可 能 性 を以 下5章 した 。 本 論 文 の 第1章. に わ た り論 述. で は 脂 溶 性 モデ ル 薬 物 の イ ン ドメ タ シ ンお よ び水 溶 性 低 分 子 モ. 2.
(7) デ ル 薬 物 の 尿 素 を、 第2章. で は 高 分 子 水 溶 性 物 質 のfluoresceinisothiocyanate-. labeleddextransを. 用 い た と きの 代 表 的 な経 皮 吸 収 促 進 剤 の促 進 機 構 解 明 に 関 す る検. 討 を行 っ た。 第3章. で は ペ プ チ ド性 医 薬 品等 の皮 膚 透 過 を 向 上 させ る水 溶 性 の 経 皮 吸. 収 促 進 剤 πoctyl一 β一D-thio91ucosideの. 促 進 機 構 を詳 細 に解 明 す る た め、 高 分 子 を 含. め た水 溶 性 物 質 の 透 過 性 を、 角 質 層 除 去 皮 膚 との比 較 を含 め検 討 した 。 第4章. では ペ. プ チ ド性 の ア ル ツハ イ マ ー 治 療 薬 で あ るエ ビ ラチ ドの 体 内動 態 、 皮 膚 透 過 性 そ して 組 織 移 行 性 を検 討 し、 更 に は脂 溶 性 の経 皮 吸 収 促 進 剤 を用 い た際 の エ ル カ トニ ンの 皮 膚 透 過 性 に 関 す る検 討 を 行 っ た 。第5章. で は ペ プ チ ド性 医 薬 品 で あ る エ ル カ トニ ンの. TTS製 剤 を ラ ッ トに適 用 した と き の骨 粗 嶺 症 に対 す る治 療 効 果 を活 性 型 ビタ ミ ンD3等 の 併 用 効 果 を含 め 検 討 した 。 以下 そ の 結 果 を詳 述 す る。. 3.
(8) 第1章. イ ン ドメタシ ン と尿素 の皮 膚透 過にお ける経 皮 吸収 促進 剤 の促進機 構 および 透 過 パ ラメー ター と促進 因 子 との関係. 第1節. 緒言. 現 在 、 全 身 作 用 を 目的 と したTTS製 剤 が 多 数 開発 され 、 臨 床 の 場 で 用 い られ て い る。 しか し皮 膚 か らの薬 物 透 過 性 が低 い ため 、 使 用 され る薬 物 は 、 ニ トロ グ リセ リンの よ う に微 量 で そ の 効 果 を発 現 す る も の に限 られ て い る4)。TTSの. 臨 床 応 用 を さ らに拡 大. す る た め に は 、 皮 膚 か らの 薬 物 吸 収 性 を高 め る こ とが 不 可 欠 で あ り、 薬 物 の透 過 性 を 改 善 す る方 法 と して プ ロ ドラ ッグ化9)お よ び イオ ン トフ ォ レ シ ス等 の 検 討 が 行 わ れ て い る1°'11)。 そ の 中 で も経 皮 吸 収 促 進 剤 は、 使 用 の簡 便 さ と、 様 々 な 薬 物 へ の 応 用 性 と い う点 か ら盛 ん に研 究 が 行 な わ れ 、 製 品へ の実 用化 もな さ れ て い る12)。 しか し そ の作 用 機 構1につ い て は 、1aurocapra皿 や 脂 肪 酸 お よ びア ル コ ー ル類 で角 質 層 細 胞 の 構 造 変 化 、 薬 物 の熱 力 学 活 動 度 の上 昇 、 ま た角 質 層 脂 質 との 相 互 作 用 等 が 一 部 解 明 され て い る もの の 、 詳 細 は不 明 な点 が 多 い13'14)。. 一 方、作 用が一 一部 解 明 さ. れ て い る促 進 剤 で あ って も、 透 過 ル ー トが異 な る と され て い る脂 溶 性 と水 溶 性 薬 物 の 両 方 に つ い て の 比 較 検 討 は ほ とん ど行 わ れ て いな い15 17)。 そ こで 本 章 で は、 ヒ トの 皮 膚 に 構 造 的 に比 較 的類 似 す る と され て い る ヘ ァ レス ラ ッ トの 皮 膚 を用 い、 脂 溶 性 モ デ ル 薬 物 の イ ン ドメ タ シ ン、 水 溶 性 モ デ ル 薬 物 の尿 素 に お け る、 両 薬 物 の 皮 膚 透 過 性 をinvitroで. 検 討 した 。 ま た 皮 膚 透 過 の 要 因 と され る薬 物. の熱 力学 活 動 度 、 皮 膚 へ の 分 配 量 、 角 質 層脂 質 の 流 動 性 お よび 角 質 層 細 胞 間 脂 質 の 抽 出 量 等 を測 定 し、 これ らの 特 性 値 の変 化 お よ び各パ ラ メ ー タ ー との 相 関 か ら、 経 皮 吸 収 促 進 剤 の促 進 機構 につ いて 考 察 した 。. 第2節. 実験材料および操作方法. 2-1報. 材料 お よび動 物. イ ン ドメ タ シ ン(IND)は 住友製 薬株 式会社 か らの提供 品 を使 用 した。尿素 はキ シダ. 4.
(9) 化 学 株 式 会 社 よ り 購 入 し た 。HPLCの hydantoin(methylphenytoin)お はAldrich株. 内 標 準 物 質 で あ る5-(4-methylpheny1)-5-pheny1-. よ びESRのspinlabelで. あ る16-doxyl-stearicacid. 式 会 社 、 ヒ ト血 清 ア ル ブ ミ ン(fractionV,fattyacidfree)は. シグマ株. 式 会 社 よ り購 入 し た 。 他 の 試 薬 は す べ て 試 薬 特 級 品 を 使 用 し た 。 経 皮 吸 収 促 進 剤 と し て 次 の 化 合 物 を使 用 し た 。. 1.1aurocapram(Azone):NelsonResearch株 2.かoctyl一. 式 会 社(提. β 一D-thioglucoside(OTG):和. 3.dimethylsulfoxide(DMSO):ナ. 光 純 薬 工 業 株 式 会 社 カ ラ イ テ ス ク株 式 会 社. 4.1Fmethyl-2-pyrrolidone(NMP):ナ. カ ラ イ テ ス ク 株 式 会 社. 5.〃,準diethyl溜. 一toluamide(DEET):東. 6.πoctano1:関. 東 化 学 株 式 会 社. 京 化 成 工 業 株 式 会 社. 7.isopropyl町ristate(IPM):Sigma株 8.oleicacid:東. 供 品). 式 会 社. 京 化 成 工 業 株 式 会 社. 9.sodiumoleate:東. 京 化 成 工 業 株 式 会 社. 10.里onoOlein:ナ. カ ラ イテ ス ク 株 式 会 社. 11.oleyloleate二Sig皿a株 12.cineol:ナ. 式 会 社. カ ラ イテ ス ク株 式 会 社. 13.D-li贋onene:ナ. カ ラ イテ ス ク株 式 会 社. 実 験 動 物 は清 水 実 験 材 料 株 式 会 社 よ り購 入 し た雄 性 ヘ ア レス ラ ッ トに 固 形 飼 料 お よ び 水 道 水 を 自由 に与 え、 体 重 が180-2009に. な る ま で適 正 な環 境 下 で 馴 化 飼 育 し た後 使. 用 し た。. 2-2イ. ン だメ タ シ ン お よ び 尿 素 の 加. 透 過 実 験 の2日. γノケo皮 膚 透 過 実 験. 前 に 、 あ ら か じ め 電 気 カ ミソ リ を 用 い て 除 毛 し た ヘ ア レ ス ラ ッ トの. 腹 部 皮 膚 を 、 実 験 前 日に 摘 出 し た 。 摘 出 に 際 し て は 、 皮 膚 表 面 へ の 損 傷 を 避 け る こ と 、 そ し て 真 皮 側 の 血 管 、 筋 肉 、 脂 肪 等 を完 全 に 取 り除 く こ と に 特 に 注 意 を払 っ た 。 摘 出 し た 皮 膚 を ろ 紙 を ひ い た シ ャ ー レ 中 に 真 皮 側 を 下 に し て 拡 げ 、 そ こ に0.85%NaCl-10 mMphosphatebuffer,pH7.4(pH7.4buffer,防. 腐 剤 と し てgentamicinsolution. 5.
(10) 10皿g/mLを1/100v/v添. 加)を7.OmL加. え 、5℃. で12時. 間 水 和 さ せ た 。 透 過 実 験 当 日、. 水 和 に よ り平 衡 化 し た 皮 膚 を 、 フ ラ ン ッ 型 拡 散 セ ル(透 容 量10.5mL)に. 装 着 し た 。 ドナ ー 部 に 、 促 進 剤(濃. 懸 濁 さ せ たIND(o.8%)も. し く は 尿 素(o.5%)の55%エ. 過 面 積2.01cm2,レ. 度 はTablel参. セ プター. 照)を. 溶解 または. タ ノ ー ル(EtoH)溶. 液 を1.o皿L加. え 、 セ ル の 上 部 を パ ラ フ ィ ル ム を 用 い 密 閉 し た 。 レセ プ タ ー 溶 液 に は 防 腐 剤 を 添 加 し たpH7.4bufferを. 使 用 し た 。 実 験 中 は 、 レ セ プ タ ー 部 を 恒 温 槽 中 で37℃. に保 ち 、 内部. 溶 液 を マ グ ネ チ ッ ク ス タ ー ラ ー を 用 い 撹 搾 し た 。 経 時 的 に セ ル の サ イ ドア ー ム 部 よ り レ セ プ タ ー 溶 液 を 採 取 し 、 定 量 時 ま で40℃. 2-3Zハ. で凍 結 保 存 した 。. のの皮 膚1夕分 配 量 齪. 皮 膚 透 過 実 験 と 同様 の 方 法 で処 理 した ヘア レス ラ ッ トの 腹 部 摘 出 皮 膚 を フ ラ ンッ型 拡 散 セ ル に 装 着 し た。 ドナ ー 部 に、 促 進 剤 を溶 解 も し くは 懸 濁 させ た55%EtOH溶. 液. を1.0皿L加 え、 セ ル の上 部 をパ ラ フ ィル ム を用 い密 閉 した 。 レセ プ タ ー溶 液 は 皮 膚 透 過 実 験 と同 様 の もの を使 用 し た。 実 験 中 は、 レセ プ ター 部 を恒 温 槽 中 で37℃ に 保 ち、 内部 溶 液 をマ グ ネ チ ッ ク ス タ ー ラ ー を用 い撹 拝 した 。12時 間 上 記 の 方 法 で促 進 剤 に よ る処 理 を実 施 後 、 ドナ ー 溶 液 を ろ紙 を用 い て取 り除 い た。 代 わ りに ドナ ー部 に プ ロ ピ レ ング リコ ー ル に溶 解 させ た0.2%IND溶. 液 を1.0吐 加 え、3時 間 薬 物 を負 荷 させ た 。. 薬 物 を負 荷 した 部 位 の 皮 膚 を取 り出 し、 直 ち に 冷pH7.4buffer10mLで3回. 洗 浄 し、. ろ 紙 を用 い よ くふ き取 っ た 後 、 細 切 した 。細 切 した皮 膚 を10mLの メ タ ノ ー ル(MeOm中 でPhyscotoron(NS-10,日. 音 医理 科 器 械 製 作 所)を. 用 い2分 間 ホ モ ジ ナ イ ズ し た。 得. られ た ホ モ ジ ネ ー トを12000rp皿 で10分 間遠 心 分 離 し、 上 清 中 のINDを 定 量 した 。. 2-4角. 質 層 の調製 法. 角 質 層 の 調 製 法 はKIigmanら. の 方 法 に 準 じ て 行 な っ た18)。. す な わ ち 、 除 毛後 摘 出 し. た ヘ ア レ ス ラ ッ トの 腹 部 皮 膚 を ろ 紙 を ひ い た シ ャ ー レ 中 に 拡 げ た 。 そ こ に0.25%ト プ シ ン ー0.5%炭 を1/100v/v添. 酸 水 素 ナ ト リ ウ ム 溶 液(防 加)を7.OmL加. え 、37°cで22時. リ. 腐 剤 と し てgentamicinsolution10mg/mL 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 冷 水 で4回 洗 浄. し た 後 、 角 質 層 を ス パ ー テ ル を 用 い て 剥 離 し た 。 得 られ た 角 質 層 を シ リカ ゲ ル を入 れ たデ シ ケ ー ター 中 で 減 圧 乾 燥 させ 、 実 験 時 ま で 減 圧 下 で 遮 光 し て保 存 した 。. 一6.
(11) 2-5角. 質 層 細 胞1醐 讃. 2-4の. の」 助認 お よ び 痴掟. 方 法 に よ り得 られ た角 質 層25mgに 、 促 進 剤 を溶 解 ま た は 懸 濁 させ た55%. EtOH溶 液 を3.OmL加. え て 密 栓 後 、37℃ で2時 間 振 と う した 。 そ の 混 液 を3000rpmで10分. 間 遠 心 分 離 した 。得 られ た上 清2mLにCHC13:MeOH=2:1(v/v)混. 液 を7.OmL加. え 、振 と. う後 ろ過 した 。 ろ 液 を0.8皿Lの 生 理 食 塩 水 で 洗 浄 し、4℃ で12時 間 放 置 した 後 、 分 離 し た 有 機 層 用 い、 角 質 層 細 胞 間 脂 質 の セ ラ ミ ドを定 量 した 。. 2-6角. 質鰯. 2-4の. 旨質 の 瀬. 盤 痴掟. 方 法 に よ り 得 ら れ た 角 質 層280mgに. pH7.4を8.OmL加 1.omLに. え 、Physcotoronを. 、0.85%NaCl-40mMTris-HCIbuffer,. 用 い ホ モ ジ ナ イ ズ し た ・ 得 られ た ホ モ ジ ネ ー ト. 促 進 剤 を 溶 解 ま た は 懸 濁 さ せ た55%EtOH溶. 液 を1.o皿L加. え て 、37℃. で2時 間 イ. ン キ ュ ベ ー ト し た 。 室 温 で 遠 心 分 離 し 、 沈 殿 物 で あ る 角 質 層 をTris-HCIbufferで 1回 洗 浄 し た 。 こ の 角 質 層 にTris-HCIbufferO.3皿Lお acidを. 溶 解 さ せ た5%ヒ. トア ル ブ ミ ン 溶 液0.2mLを. し た 。 イ ン キ ュ ベ ー ト の 後 、Tris-HCIbufferで 50μLを. ヘ マ ト ク リ ッ トキ ャ ピ ラ リ ー(テ. キ ャ ピ ラ リ ー 中 の サ ン プ ル のESRス 電 気 株 式 会 社)お (τC)は. よ び0.28皿gの16-doxyl-stearic 加 え 、0℃. で1.5時. 間 イ ンキ ュ ベ ー ト. 角 質 層 を3回 洗 浄 し 、 こ の 懸 濁 液. ル モ 株 式 会 社 、 直 径1.1田 面. 中 に封 入 し た 。. ペ ク トル を 、ESRspectrometer(JES-RE2X,日. 本. よ び そ の 付 属 機 器 を用 い て 測 定 し た 。 流 動 性 の 指 標 で あ る 相 関 時 問. 次 式 に よ り 算 出 し た19)。. τc=6.5x10-10Wo[(ho/h_、)1/2-1コ. こ こ でh。 とW。は そ れ ぞ れ 中 磁 場 側 ス ペ ク トル ラ イ ン の ピ ー ク 高 さ と 半 値 幅 を 、h-・ は高 磁 場 側 ラ イ ンの ピー ク高 さ を示 す。. 2-7イ IND20mgを. ン ドメ タ シ ンの 落解 度 と.雑カ ー 学活動 度 の測 定 秤 量 し、 これ に 促 進 剤 を溶 解 ま た は 懸 濁 させ た55%EtOH溶. えて 密 栓 後 、37℃ の水 浴 中 で24時 間振 と う した 。 この 混 液 を3000rpm、15分 離 し、55%EtOH層. 液 を2.OmL加 間遠 心分. 中 に溶 解 したINDの 量 を定 量 した。 溶 解 度(Cs)に 対 す る薬 物 濃 度. (Co)の 比 は 熱 力 学 活 動 度 に近 似 す るの で2°)、 この 比 を熱 力 学 活 動 度 と した 。. 7.
(12) 2-8定. 量法. 1ン"メ. シ ンの. 旦. INDの 定 量 は 、Kwongら ち 、 試 料50μLに 100μLを. の 方 法21)を. 一 部 改 良 し たHPLC法. 、 内 部 標 準 溶 液(methylphenytoinの. に よ り 実 施 し た15)。. すな わ. ア セ ト ニ ト リ ル 溶 液50μg/mL). 添 加 し 、 撹 拝 後 遠 心 分 離 し た 。 遠 心 後 の 上 清 を 孔 径0.45μ. 皿の メ ン ブ ラ ン フ. ィル タ ー で ろ 過 し 、 ろ 液 中 の 薬 物 濃 度 を 定 量 し た 。 HPLC(LC-3A,島. 津 製 作 所)の. 55:45:0.1v/v.2)測. 定 波 長:254nm.3)分. 150mm,GLscience株. 2)尿. 測 定 条 件 は1)移. 式 会 社).4)分. 動 相:ア. 酸=. 離 カ ラ ム:Inertsi10DSC、8(4.6x. 離 温 度:35℃.5)流. 速:1。OmL/min.で. 行 な っ た。. 素 の定 量. 尿 素 はdiacetylmonoxime法. に よ り定 量 し た 。 す な わ ち 、 実 験 の 直 前 に 、diacety1-. monoxi皿e(DAM)6.Ogとthiose血carbazide(TSC)0.3gを1Lの TSC試 薬 と 、34%リ. ン 酸 と を1:5の. に 呈 色 試 薬 を2.4mL加 光 度 計(UV-100-02,島. 3)セ. 精 製 水 に 溶 解 さ せ たDAM-. 割 合 で 混 和 し た 呈 色 試 薬 を 調 製 し た 後 、 試 料50μL. え 、 密 栓 し 沸 騰 水 浴 中 に20分. 間浸 した 。 流 水 で冷 却 した後 、 分 光. 津 製 作 所)を 用 い 、540n組 で 比 色 定 量 し た 。. ラ ミ ドの 定 量. セ ラ ミ ドは ス フ ィ ン ゴ シ ン に 加 水 分 解 し た 後 、Lauterら す な わ ち 、2-5で 0.4凪. セ トニ ト リ ル/水/酢. 得 た 有 機 層2.OmLを. 加 え 、 密 栓 後100℃. ル7.OmLで. の 方 法 に 準 じ て 定 量 し た22)。. 蒸 発 乾 固 さ せ た 後 、MeOHで. 希 釈 し た4N塩 酸 を. で2時 間 加 水 分 解 し た 。 得 ら れ た ス フ ィ ン ゴ シ ン を 酢 酸 エ チ. 抽 出 し た 。 こ れ に 精 製 水 を2.0皿L加. ら れ た 酢 酸 エ チ ル 層 に0.01M酢. え振 と う し、 洗 浄 した 。 遠 心 分 離 後 、 得. 酸 緩 衝 液(pH3.65)2.OmLお. よ び メ チ ル オ レ ン ジ0.1凪. を 加 え た 。 こ の 液 を 振 と う 後 、 遠 心 分 離 し 、 酢 酸 エ チ ル 層 を415nmで. 2-9、. 経 皮 透 遍 ノ、 ° ラ メ ー タ ー の,算 出 法 お'よ び 》 旛 解. 1、'渦 Invitro透. 祈. パ ーメ ー ター 過 実 験 で 用 い た パ ラ メ ー タ ー は 次 式 に よ り算 出 し た 。. 8. 比 色 定 量 した 。.
(13) D・. ㎞. D1. ・Cs =Kp・Cs. Js= δ. δ26τ. こ こでJsは 単 位 時 間 お よ び単 位 面 積 あ た りの 薬 物 透 過 量(透. 過 速 度)、Kpは. 薬物 透. 過 係 数 、Dは 皮 膚 内 の薬 物 拡 散 係 数 、 ㎞ は ドナ ー溶 液 か ら皮 膚 へ の薬 物 分 配 係 数 、Cs は ドナ ー部 の 薬 物 濃 度 、 δは 角質 層 の厚 さ(平. 均0.002cm)、. そ して τは ラ グ タ イ ム. で あ る。 な お、Jsお よ び τはINDも し くは 尿 素 の 透 過 グ ラ フ に お け る見 か け 上 の 直 線 部 分 を最 小 二 乗 法 で 直 線 回帰 す る こ とに よ り算 出 し た 。. 2)統. 計解 析. す べ て の デ ー タ ー は 平 均 値 ± 標 準 偏 差 で 表 し た 。 各 群 問 の 検 定 に はStudentのttest(対. 応 な し)を. られ た 危 険 率 が5%未. 第3節. 3-1Zハ. 使 用 し、 相 関 係 数 は最 小 二 乗 法 直 線 回帰 分 析 法 に よ り求 め た。 得 満 の時、有意 な差が ある とした。. 実験結 果. のお ・ よ び 尿 素 の1刀 γノむ、rOl皮 膚 透 遍美 毅. INDの 皮 膚 透 過 グ ラ フ をFigure1に れ ら の 透 過 パ ラ メ ー タ ー をTable1に. 、 尿 素 の 皮 膚 透 過 グ ラ フ をFigure2に 示 し た。. INDの 透 過 速 度(Js)はcontro1(55%EtOH)に す る こ と で 約10倍. 、更 に こ. 比 べ 、IPM,cineol,D-1imoneneを. 、 πoctanol,1aurocapram,sodiumoleate,01eicacidな. 添 加 ど で約. 5倍 上 昇 し た 。 こ れ ら の 促 進 剤 を 使 用 す る こ と に よ り 、 ラ グ タ イ ム も 有 意 に 減 少 し 、 特 にD-1imoneneで. は ゼ ロ 時 間 か ら 吸 収 が 始 ま っ た 。 つ ま り、D-limoneneに. は薬 物 の初. 期 透 過 を 顕 著 に 高 め る 効 果 が あ る と 考 え ら れ る 。 比 較 的 親 水 性 の 促 進 剤 で あ るOTG, NMP,DEET,DMSOで. は 大 き な 促 進 効 果 は 認 め ら れ な か っ た 。 これ よ り基 剤 の 脂 溶 性 と. 促 進 効 果 と の 相 関 が 推 測 さ れ た が 、 脂 溶 性 の 高 いoleyloleateで. も 促 進 効 果 が 余 り認. め ら れ な か っ た こ と よ り 、 直 接 の 関 係 は な い も の と 考 え ら れ た23'24)。. 9.
(14) ( 四 § 瓦δ ヨ 盛 箋 & oz宏 彗 。εく. (周暮 、。。5 ヨ 巴歪 & 自 ご e 当 。ε<. Figure1。PenetrationProfilesoflND throughHairlessRatSkin.. s・lidline・. 〈○)55鑑EtOH;(●)1・5零OTG;(×)5%DMSO;(△) 2%NMP;(▲)10%NMP;([])2%DEET;(■)10器 DE露T;(▽>2%laurocapra皿;(▼)10%1aurocapra田; (◇)5鬼IPM;(◆)20%IPM.. dottedline:(())3鬼sodiumoleate;〈 20%π. ●)5%`01eicacid;(x). 一 〇ctano1;(△)5%凪onoolein;(▲)10毘. 皿onoolein;〈. 口)2男01eyloleate;(■)10%. Gleyloleate;(▽)2箔c玉neol;(▼>5%cineo1; (◇)2%D-1i皿onene;(◆)5%D∼1三. 皿onene,. Po三ntsandverticalbarsrepresentthe皿ean±SD(n=3-4).. ノ. T. の. ー. ' 〃' " " , 9 塞 頓キ ◇引,ー. 益牙 , ー み ーー. ノ. ー牽. ー 巳. 墜.. モ. 幽口争r ー ム. 400. 2 ち 琶 o 宏 く. . 7⊥. 600. i 騨. 霊 コも 蓄 。目 く. 巴. 800. , " . 声潔 汐 疏. 昭 義葦. ノ、 " , 甲 堂. (四§ 、 。。δ 零 奮 。琶. べ 忌 蕩. 200. 1. o 0. 2. 4. 6. 8. 乳0. Time(h) ( 漫 9、 。。δ 峯 鐸 。駐. Figure2・PenetrationProfilesofUrea throughHairlessRatSkin.. solid1孟ne:(○)55%EtOH;(●)1.5%OTG;(×)5%DMSO;(△) 2%疑. 粧P;(▲)10%NMP;(〔. コ)2%DEET;(■)10%. 軽 ξ 2 目ヨ鶏 く. DEET;(▽)2罵1aurocapra皿;(▼)10%1aurocapra田; (〈〉)5%IPH;(◆)20%耳PM. dottedline:(○)3%sodiumoleate;(●)5%01eicacid;(×) 20器. 〃-octano1;(△)5%monooleln;(▲)10%. 皿6noQlein;(口)2%oleyloleate;(瓠)・10% 01eyloleate;(▽>2毘cineo1;(▼>5%c三neol; (◇)2%D-1i皿onene;(◆)5%D-li皿onene. Po三ntsandvert量calbarsrepresentthemean±SD(n冨3-4>.. 尿 素 のJsは. πoctanol,cineo1で. oleicacid,mnooleinで10倍. 約20倍 以 上 と 、INDの. 一10一. 、1aurocapram,IPM,sodiu田 約2倍. の促 進 作 用 を示 し た。 こ. oleate,. れ らの結.
(15) 果 か ら、 上 記 の 経 皮 吸 収 促 進 剤 は、 水 溶 性 薬 物 の透 過 促 進 に よ り強 く働 く こ と、 ま た 薬 物 の透 過 機 構 も脂 溶 性、 水 溶 性薬 物 で 異 な る もの と考 え られ た。OTG,NMP,DEET, DMSO,oleyloleateで. はINDの 場 合 と 同様 、 大 き な促 進 効 果 は認 め られ な か っ た 。 更. に、 尿 素 透 過 で は 、 ラ グ タ イ ム が ゼ ロ(マ. イ ナ ス)に. な るバ ー ス ト現 象 が 観 察 され た. こ とよ り、 初 期 透 過 に お け る皮 膚 付 属 器 官 の 関 与 も示 唆 され た 。. Table1.EffectofVariousEnhancersonPercutaneousPenetrationPara皿etersof Indo皿ethacin(IND)andUrea. IND. Enhancer. __一______. %JS(μg/Cm2/h)a>τ(h)b)DxlO-7(Cm2/h)のJS(μg/C皿2/h)a)τ(h)b). EtOH. 55. 6.0±1.4. 2.15±0.11. 3.08±0.27. 14.2±1,10. OτG. 1.5. 9.7±1,3. 1.15±0.54の. 9.59±5.18. 24。1±4.7e)O. DMSO. 5. 6.2±1.4. 1.89±0.30. 3.90±0.86. l4.8±1.30. NMP. 2. 7.5±0.3. 2.22±0.13. 3.13±0.02. 13.9-←1.20. NMP. 10. DEET. 2. 5.4±1.9. 2.21±0.08. 3。07±1.24. 21.5±2.2e)0. 10.2±1.le). 2,25±0.12. 2.91±0.22. 38.9±5.1f>0. DEET. 10. 7.6±1.4. 2.40±0.06. 2.83±0.02. 41.1±3.2f)0. 五卜OctanGl. 20. 22.8±2,30. 1.12±0.lge). 5.53±0.90. 290.6±25.2f)0. 31.9±2.of}. 0.39±0.ユof}. 19.99±9.30f). 212。4±32.7f)0. 17。9±1.8f>. 0.15±0.02f♪. 44.38±9.20f). 202.5±36,1f)0. 60.3±7.8f>. 0.86±0.ogf). 58.9±1.7f>. 0.62±0.12n. Laurocapram. 2. Laurocapra皿. 三. IPM. 21. IPM SodiumoIeate. :. Oleicacid 逝onoolein. 、1. 塾 旺or1001ein Oleyloleate. 、1. Oleyloleate Cineol. :. Cineol D-Limonene. 、1. D-Li醗onene. 8.49±1.27f>. 42,9±5.of)O. 11.48±2.36f). l58.6±7.8f>0. 38.8±3.gf〕. 1.03±0.08e). 21.5±0.4均. 0.26±0.06f). 25.28±8.51f). 201.4±28。4f)0. 25.0±1.3n. 0.65±0.27f). 13.24±6.ogf). 208.8±23.1f)0.21±0.16. 24.5±2.4P. 0.55±0.16f). 10.43±1.94f). 184.7±16.4f)0. l2.0±1.3e). 2.20±0。09. 3.07±0.22. 19.2±2.50. 13.9±0,7f}. 2,33±0.05. 2.90±0.06. 20.7±1.6e>0. 61.6±8.8f). 0.67±0.22f>. 11.81±6.58f). 271,6±28.gf;0. 47,4±6.2f). 0.84±0.53f). 41.92±5.16f). 263.0±30.7f)0. 48.9±1.8f). 0±0。06f). 101.2±14.gf)0. 52.3±7.2f). 0±0.25f). 115.5±17.7f》0. 6.59±0、goe). 153,0±10.3f>0.61±0.25. Valuesareexpressedasthemean±SD(n=3-5). a)Flux・b)Lagtime.c)Diffusionconstant.e)ρ(0.05compare(iwith55%EtOH. f)ρ<0.01comparedwith55%EtOH.. 3-2イ. ン ドメ タ シ ンの、 皮膚 内 分配 量 と.角質 層 紐鞄 鰯 皆質 の;磁出 量 測 定. 薬 物 の 皮 内 で の拡 散 と溶 解 性 は、 皮膚 透 過 速 度 を決 定 す る因 子 で あ る25)。 す な わ ち、 特 にINDの. よ う な脂 溶 性薬 物 が透 過 す る 際 には 、 薬 物 が一 旦 皮 膚 内 に 分 配 し、 更. 11.
(16) に そ れ が 皮 下 に移 行 す る こ とが 必 要 とな る26-28)。. ま た、 角 質 層 の 細 胞 間 に 含 まれ る. 脂 質 は 、 多 くの薬 物 の経 皮 透 過 性 に重 要 な役 割 を果 た す こ と、 つ ま り、 細 胞 間 脂 質 の ス フ ィ ンゴ脂 質 と コ レステ ロ ール の 除 去 は 角 質 層 のバ リア機 能 を低 下 させ る こ とが 知 られ て い る2973°)。 そ の た め 、 脂 溶 性 薬 物 の み な らず 、 水 溶 性薬 物 も脂 溶 性 の角 質 層 が 除去 され る こ と で移 動 が 容 易 とな り、 透 過 促 進 が期 待 され る 。 実 際 、 水 溶 性 お よ び 脂 溶 性 の両 薬 物 の 透 過 促 進 に 関 与 し て い るlaurocapramが. 角質 層細 胞 間脂質 の除去 に. 大 き な役 割 を演 じ て い る こ と が 明 らか に され て い る15)。 そ こで促 進 剤 存 在下 で のIND の皮 膚 内分 配 量 と、 角 質 層 か らの ス フ ィ ンゴ脂 質 で あ るセ ラ ミ ドの 抽 出 量 を測 定 した 。 そ の 結 果 をTable2に. 示 し た。. Table2.SkinPartitioningofINDandRe皿ovalofCera阻ides fromtheStratu皿Corneum. SkinPartitioningRemovalofCera田ides Treat田ent. %of互ND(μ9/c皿2)(%ofStratumCorneum). 55. EtOH. 4.03±0.32. 0.036±0.034 _a}. OTG. 1.5. DMSO. 5. 2.71」:0.16. 0,122±0.056. N睡P. 2. 4.14±0.51. 0.115±0.064. 39.10±2.23b). 10. 3.95±0.34. 0.217ゴ:0.107. DEET. 2. 5,94±0.30. 0.170±0.094. DEET. 10. η一〇ctanol. NMP. 11.62±1.60b). 0.271±0.097c). 20. 95.11±3.53b). 0.599±0.20gb). Laurocapram. 2. 109.33±10.11b). 0.559±0.066b). Laurocapram. 5. 128.06±13.73b). 0.706±0.043b). IPM. 5. 36.73±2.39). 0.116±0.022c). IPM. 20. 58.90±3.82). 0.326±0.148c). SodiumoIeate. 3. 24.42±2.56). 0.305±0.064b). Oleicacid. 5. 56.72±4.47). 0.353±0.124b>. Monoolein. 5. 51.62±6.58). 0.123±0.010b). Monoolein. 10. 53.39±6.39). 0.392±0.ogob). Oleyloleate. 2. Oleyloleate. 10. 4.72:ヒ0.63. 0.147:±. 二〇.088. 6.14±0.77. 0.198±0,071c). Cineol. 2. 41.29±3.45b). 0.175±0.035c). Clneol. 5. 66.39±7.lob). 0.308:虻0.126c). D-Li皿onene. 2. 22.50±0.76b). 0.228±0.032b). 10. 63.02±7.22b). 0.552±0.04gb). D-Limonene. Valuesareexpressedasthemean±SD(n=3-5).a)Thea皿ountwas notdeterminedbecauseoftheextensiveinterferencewithassay. b)ρ. く0.01co皿paredwith55%EtOH.c)P(0.05co皿paredwith55%EtOH、. 12.
(17) 皮 膚 内 分 配 量 は 、 πoctano1,1aurocapram,1田,monoolein,oleicacid,cineol, D-1imoneneな. ど で 顕 著 に 増 大 し 、DMSO,棚P,DEET,01eyloleateで. は ほ と ん ど増 加. し な か っ た 。 セ ラ ミ ド抽 出 量 は πoctano1,laurocapramで monoolein,cineo1等. 顕 著 に 、 ま たoleicacid,. で も若 干 増 加 し た 。 組 織 や 膜 脂 質 中 の 脂 質 抽 出 剤 と し て 広 く用. い ら れ 、 脂 質 を 全 抽 出 す る と さ れ て い るCHC13嚇eOH=2:1(v/v)で (24h,37℃)が0.733±0.108%で (5%)で. の セ ラ ミ ド抽 出 量. あ っ た こ と よ り 、 特 に 、1aurocapramは. 比較 的低濃 度. 、 皮 膚 中 の セ ラ ミ ドを ほ ぼ 全 て 除 去 す る 効 果 が あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。. な お 、 コ レ ス テ ロ ー ル の 抽 出 に つ い て は 、 セ ラ ミ ドの 抽 出 と 同 様 の 傾 向 を 示 す こ と が 既 に 確 認 さ れ て い る15)。. 3-3角. 質 鰯 寄質 の 流 動 盤. 膜 脂 質 の 流 動 性 は 膜 の 透 過 特 性 を決 定 す る重 要 な 因 子 と され て い る31'32)。. すなわ. ち 、 膜 脂 質 の 流 動 性 が 高 ま る と、 脂 質 中 に溶 解 した 脂 溶 性 薬 物 の 拡 散 が 高 ま る こ と に よ り透 過 の 促 進 が 期 待 され る。 そ こで促 進 剤 に よ る、 角 質 層 脂 質 の 流 動 性(τc)の 化 を測 定 し た結 果 をTable3に. 示 した。. Table3.Freedo皿ofHotionofLipidSpinLabelinthe Stratu皿Corneu皿TreatedwithEnhancers. τc(ns). Treatment. %. 55. 903±02. DMSO. 5. 001±03. NMP. 1. 195±03. NMP. 2. 194±03. DEET. 2. 935±02. 10. 124±03. Laurocapra皿. 1. 928±00. Laurocapram. 2. 864±00. IPM. 5. 939±00. EtOH(Control). D￡ET. 495 283 144 029 139 169 331 059 075 123 086 123 126. 349±03. Sod童u皿oleate. 3. 374±01. Ole重cacid. 1. 207±01. Oleicacid. 5. 084±01. Monoolein. 5. :L 223±0.159. Oleyloleate. 2. 2.329:ヒ0.024. Cineol. 2. 1.254±0.112a>(7). VaIuesareexpressedasthe皿ean±SD(n=3-11). a)Pく0.01comparedwithcontrol。. 13. (9) (5) (6) (3) (3) (4) (4) )(4) )(4) )(7) )(6) )(3) )(4) )(5) (4). 2 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1. Buffer(Blank). 37℃. 25°C. 059±0. 213. (11). 807±0. 221. (6). 981±0. 103. (5). 834±0. 067. (3). 853±0. 067. (3). 722±0. 095. (5). 781±0. 138. 654±0. 112. (5) )(5). 549±0. 095. 826±0. 114. 033±0. 084. 917±0. 141. 800±0. 107. 853±0.061 499±0.062 039±0.062. }(4) )(7) )(6) )(3) }(4) 〉(5) )(4) )(7). 変.
(18) Laurocapram,IPM,sodiumoleate,oleicacid,mnoolein,cineolで. 顕 著 に τc. 値 が 低 下 、 つ ま り脂 質 の 流 動 性 が 高 ま る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た 、25℃. と37℃. で. の τc値 の 比 較 よ り 、 温 度 の 上 昇 と 共 に 、 脂 質 の 流 動 性 が 高 ま る こ と も 確 認 さ れ た 。. 3-4∫. 初 の溶 解捜 と燕 力 学 活 動 度 の痴掟 巳. 経 皮 吸 収 速 度 は溶 媒 中 の 薬 物 の 熱 力 学 活 動 度 に直 接 依 存 す る の で2°)、 促 進 剤 に よ るINDの 溶 解 度 上 昇 に起 因 す る熱 力学 活 動 度 の 変 化 を求 め た 。 促 進 剤 を添 加 した と き の、INDの 溶 解 度 とCo/Cs比. をTable4に. 示 した。. Table4.SolubilityofINDinEnhancer-55%Ethanol andtheSolubil三tyEnhance皿e1ltRatio. SaturatedSolubility. Treatment. Solubility(%)EnhancementRat童oa). 55. EtOH. '. %. 0.192±0.003. 1.00. OTG. 1.5. 0.223±0.008. 1.16. DMSO. 5. 0.255±0.006b). 1.33. NMP. 2. 0.230±0.009. 1.20. NMP. 10. 0.351±01040b>. L83. 0.203±0.009. 1.06. DEET. 2. DEET. 10. 0,346±0.004b}. L80. η旨Octanol. 20. 0.873±0.102b). 4.55. Laurocapraln. 2. 0.235±0.008. 1.22. Laurocapram. 5. 0.269±0.Olob). 1.40. 5. 0.265±0.Ol5b》. 1.38. 20. 0.443±0.016b). 2.31. Sodiumoleate. 3. 0.795±0.071b). 4.14. Oleicacid. 5. 0.178±0.003. 0.93. Monoolein. 5. 0.382±0.007b). L99. Monoolein. 10. 0.499±0.012b>. 2.60. OIeyloleate. 2. 0.289±0.003b). 1.51. Oleyloleate. 10. 0.454±0.017b). 2.36. Cineol. 2. 0.271±0.024b). 1.41. Cineol. 5. 0.486±0.013b). 2.53. D-Li皿onene. 2. 0.515±0.004b). 2。68. D-Li皿onene. 10. 0.434±0.007b). 2.26. IP垣 IPM. EtOH. 2.422±0.032b). 100. Valuesareexpressedasthemean±SD(n=3-5). a)CalculatedbyCo/Cs,whereCoistheINI)concentrationin enhancer-55%EtOHandCsisthesaturationsGlubility ofINDin55%EtOH. b)P(0.01comparedwith55覧EtOH.. 14一. 12.61.
(19) 丘Octano1とsodiumoleateで. 顕 著 にCo/Cs比. 、す なわち熱 力学活 動度 が上昇 した。. ま た ほ とん どの 促 進 剤 で熱 力 学 活 動 度 の 上 昇 が認 め られ た 。 しか し01eicacidで. は、. 遠 心 分 離 後 促 進 剤 が 上 層 に分 離 し、 そ の層 にINDが 多 量 に溶 解(1.118±0.241%)し. た. た め、EtOH層. で の 溶 解 度 が小 さ い値 とな り、 結 果 的 に熱 力 学 活 動 度 は 見 か け 上 低 い値. とな っ た 。 ま た 、 促 進 剤 が上 層 に分 離 す る現 象 は、IPM,oleyloleate,D-limonene で も若 干 認 め られ た 。 す な わ ち 、 一 部 の 促 進 剤 で は 、 薬 物 が 促 進 剤 中 に取 り込 ま れ 、 見 か け 上 熱 力 学 活 動 度 が 減 少 す る可 能性 が あ る もの の 、 大 部 分 の 場 合 は 、 促 進 剤 を添 加 す る こ と に よ り、 ドナ ー溶 液 全 体 で の 脂 溶 性 薬 物 の 溶 解 度 の増 加 、 つ ま り熱 力 学 活 動 度 の 上 昇 が 確 認 され た。. 3-5各. パ ラ メ ー タ ー潤 の祖 博. 経 皮 吸 収 の 促 進 因子 を明 らか に す るた め 、Table1∼4に. 示 した経 皮 透 過 パ ラ メ ー タ. ー 間 の相 関 を求 め 、 グ ラフ に示 し た。 エNDでは、 皮 膚 内 分 配 量 と角 質 層 脂 質 の 流 動 性 τcと の 問 に(Figure3)、 め られ た(Figure4>。. ま た透 過 速 度Jsと τcと の 間 に も低flu文 側 で 有 意 な相 関 が 認 更 に 、 皮 膚 透 過 時 の ラ グ タ イ ム の減 少 と、 薬 物 の 皮 膚 内分 配 量. お よ びJsの 問 に も相 関 が認 め られ た(Figure5)。. O( )騎 員 。ド)魯 でヨ 匡. U°鶉 三 9 ド)智 ℃三 ﹂. Figure3・Relatio腱shipbet▼eenIncreaseinFluidityandPartitioning ofINDintoSkin.. (A)fluldity(τ. 。)at25℃. 〔r=0.896(ρ<0.001>inthelowpartitioningregionand. O.585inthehighreglon];(B>fluidity(τc)at37℃[」rヒ0.924(pく0.001)inthe lowpartit孟oningregionandO.903(ρ. く0.02)intheh量ghregion].. 15.
(20) ⇔°卜曽 邸( OP)倉 コ 三﹂. 9 0いN 柑蝿 (9P)わ 唄 ℃煽= 00 0正0203040506070010203040506070 Flux(Js)oHNDFI. ux(Js)ofIND Figure4・Relationshipbet▽ee穐IncreaseinFluid皇tya艮dFlux(Js)of IND.. (A)fluidity(・. ・)・t25℃. ⊂ 炉0・962(〆0・OG1)i・th・1・. thehighregion];(B)fluidity(τ. ・fl・x・. こ)at37℃. ⊂」 臨0. re&ionandO・426(ρ(0.02)inthehighregion]. ・gl。,a・dO. .045i。. .978(pく0、0011intllelowflux. .. Q乙 ち ( 邑 釜匡. OZこ o。◎三屋 莞 紙 .1. 012. 3 Lagtime(τ). 一1. 012. 3 Lagt孟me(τ). Figure5・Relationshipbet實eenLagTi皿eandPartition藍ngorFlux(Js) ofIND.. (A)lagtimeandpartiti・ning・HND玉nt・skin[声O.706(μ0.001)〕;(B)lagtime andflux(Js)of玉. 湘D[ド0.698(Pく0。001)].. 以 上 よ り脂 溶性 薬物 では角質 層脂質 の流動 性 が上 昇す る ことで、薬 物 の皮膚 内への 分 配が高 ま り、透過 が 促進 され る と考 え られ た。 また脂 質 の流動性 の上 昇 と角質層細 胞 間脂質 の抽 出 によ り、角質 層 のバ リア機能 が低下 す るため、 ラ グタイ ムが減 少す る. 一16一.
(21) と推 測 され た 。 尿 素 で は、 透 過 速 度 とセ ラ ミ ド抽 出量 との 間 に相 関 が 認 め られ た(Figure6)。. つ ま. り水 溶 性 薬 物 で は 脂 溶 性 薬 物 と異 な り、 薬 物 は 皮 膚 細 胞 内へ は分 配 せ ず 、 促 進 剤 に よ り細 胞 間 脂 質 が 抽 出 され る こ とで 細 胞 間 隙 が 拡 大 し、 水 分 の透 過 性 お よ び水 含 量 が 増 加 す るた め、 水 に 溶 解 した薬 物 の透 過 が 促 進 さ れ る と考 え られ た32'33)。. ●りO℃ 順 賃h郎﹂OQ 悩O 剛 邸>O=﹄Oに Figure6.Relationshipbet▼eenRe皿ova葺ofCera皿ides aadFlux(Js)ofUrea(PO。598ρ. 3-6∫. くO.05).. バリの 促 進 図 表. 促 進 剤 の 能 力 を 順 位 付 け る た め 、 脂 溶 性 薬 物 の 透 過 に 関 与 す る4っ の パ ラ メ ー タ ー (角 質 層 脂 質 の 流 動 性 、 皮 内 分 配 量 、 セ ラ ミ ドの 除 去 量 、 熱 力 学 活 動 度)を 成 し た 図 表 をFigure7に. 示 し た 。 こ こ で 各 パ ラ メ ー タ ー の 最 大 値 は 、1.角. の 流 動 性 に つ い て は 、37℃. で の リ ボ ソ ー ム の τc値(τc=0.50)34)、2.INDの. に つ い て は5%1aurocapram中 て はCHCI3:MeOH=2:1混 EtOHを. の 分 配 量(130μ9/cm2)、3.セ. 図 表 よ り、laurocapramは. 質 層脂 質 分配量. ラ ミ ドの 除 去 量 に 関 し. 液 に よ る 抽 出 率(0.733%)、4.INDの. 用 い て 求 め た 値(12.61)を. 用 い、 作. 熱 力 学 活 動 度 は100%. それ ぞれ 使 用 した 。. 脂 質 の 流 動 性 、 皮 内 分 配 量 お よ び セ ラ ミ ド除 去 量 が 最 大. で あ っ た 。 こ れ よ り 図 表 で 判 断 し たn① の 促 進 能 力 は1aurocapramが oleicacid>皿onoolein>sodiumoleate>cineol,IPMの. 最 も強 く、 次 い で. 順 で あ る こ と が確 認 され た 。. 17.
(22) 3333 5%Monoolein5%IPM2%Cineo110%DEET. FiZure7.SquareP駐aseDiagramforEahancementFactorsto▼ardIHD.. (1)fluid量singeffectofstratumcorneumlipids; (2)abilityofINDpartit三. 〇ningintoskin;. (3)re皿ovalofintercellularlipids(ceram孟des); (4)increase童nthethermodyna皿icactivityofI層Dinvehicle. AIIpara皿etersweremeasuredat37℃.. 第4節. 考察. 薬 物 の経 皮 吸 収 に影 響 す る因 子 は 多数 あ る が、 中 で も、 水 和 、 温 度 上 昇 そ して脱 脂 質 が 重 要 と され て い る。 水 和 は 細 胞 間 隙 の増 大 と脂 質 構造 の 乱 れ を 、温 度 上 昇 は薬 物 の溶 解 度 上 昇 と脂 質 の 流 動 性 の増 加 を、 脱 脂 質 は 細 胞 間 隙 の 増 大 を も た ら し、 そ れ ら に よ り透 過 が 促 進 され る と考 え られ る15'35)。 今 回 報 告 し た丘octanol,1aurocapram IPM,oleicacid,cineo1,D-1imonene等. の 促 進 剤 が上 記 の 促 進 要 因 の 全 て も し くは. そ の一 部 を集 中 的 に 向上 させ る こ とが 確 認 され た。 脂 溶 性 薬 物 は 角 質 細 胞 内 を透 過 す る経 表 皮 ル ー トで あ る こ と が、 角 質 層 脂 質 の流 動 性 お よ び薬 物 分 配 量 と透 過 速 度 間 の 良 好 な相 関 よ り明 らか に な っ た。 この 経 路 で は 皮 膚 へ の 分 配 に 時 間 を要 す る た め 、 透 過 の 前 に は ラ グ タイ ム が 必 要 と考 え られ る 。 しか しな が ら、Table1でD-limoneneを. 使 用 した と きのIND透 過 の ラ グ タ イ ム が ゼ ロに な っ. た 。 この理 由 に つ い て は ま だ 明 らか で な いが、 永 井 ら も同様 に、 テ ル ペ ン類 の 中 で も. 18.
(23) D-1imoneneは. ゼ ロ時 間 か ら吸 収 カ ー ブ を描 く、 新 規 性 の 高 い促 進 剤 で あ る こ と を報 告. して い る36)。 つ ま りD-limoneneは. 従 来 の 促 進 剤 が もつ 透 過 機 構 の 他 に も、 何 か 別 の. 機 構 を並 行 して 所 持 し て い る可 能 性 が あ る。DMSO,NMP,DEET等. の 極 性 溶 媒 で は促 進. 作 用 が ほ とん ど認 め られ な か っ た 。 この 理 由 と して 、DMSOで. は、 そ の 促 進 作 用 は ブ リ. ー のDMsoが 皮 膚 に直 接 作 用 す る こ と に よ り起 こ るが 、DMsoは. 水 やEtoHと モ ル 比 で2:1. の 割 合 で 複 合 体 を形 成 す るた め、 作 用発 現 に は60%以. 上 の 濃 度 が必 要 とな る37)。 た. だ 、 この よ うな 高 濃 度 で は悪 臭 や発 赤 等 の副 作 用 を発 現 す る た め現 実 的 で は な い 。 よ っ て 、 今 回用 い た通 常 使 用 され る濃 度 で は促 進 作 用 が ほ と ん ど認 め られ な か っ た と思 わ れ る 。 ま たNMPやDEETも. 薬 物 の溶 解 度 上 昇 や角 質 層 の 水 分 保 持 機 能 、 更 に は ケ ラ チ. ンを溶 解 す る こ とに よ り薬 物 の透 過 を促 進 す る と言 わ れ る が38'39)、 INDの 脂 溶 性 が 非 常 に高 い た め 、controlと. 今 回 の実 」 験 では、. 比 較 して溶 解 度 の 上 昇 が 少 な い等 の理 宙 に. よ りそ の 効 果 を ほ とん ど示 さな か った と考 え られ る 。 水 溶 性 薬 物 で あ る尿 素 は、 角 質 層 細胞 間 脂 質 を抽 出 す る こ と に よ り、 促進 効 果 を示 し た。 つ ま り、 水 溶 性 薬 物 は 脂 溶 性 薬物 と異 な り、 角 質 層 細 胞 間 隙 の 水 性 ポ ァ ー を透 過 す る こ と が 明 らか に な っ た 。 しか し透 過 時 に ほ とん どの 促 進 剤 で ラ グ タ イ ム が ゼ ロ に な るバ ー ス ト現 象 を 示 し た こ と よ り、 細 胞 間 隙 の み で な く、 毛 嚢 等 の付 属 器 官 も初 期 の 透 過 に一・ 部 関 与 して い る も の と推 測 され た 。 な お 、 この細 胞 間 隙 は通 常 の 状 態 で は 、 一般 に 分子 量4000程 度 の 薬 物 ま で しか 透 過 しな い と され て い るた め4°)、 分 子 量 の 大 き いペ プ チ ドな どの 水 溶 性 薬 物 で は 、 付 属 器 官 な ど別 の経 路 か ら透 過 す る と考 え られ るが 、 促 進 剤 添 加 時 の透 過 機 構 は 非 添 加 時 と異 な る 可 能 性 が あ る。 本 検 討 結 果 よ り、 代 表 的 な 経 皮 吸 収促 進 剤 で あ るlaurocapramは. 水溶 性 、脂溶性 の. 両 薬 物 の 透 過 促 進 に 最 も効 果 が あ る促進 剤 の一 つ で あ る こ とが 再 確 認 され た。 現 在 の と ころ 皮 膚 刺 激 性 な ど が 問題 とな り、 医 薬 品 へ の 使 用 の 承 認 は な され て い な い が 、 角 質 層 脂 質 の流 動 性 上 昇 、 薬 物 分配 量増 加 、 角 質 層 細 胞 間 脂 質 の 抽 出能 力 な ど 多種 の 促 進 因子 を兼 ね備 えて い るた め15・41)、 促 進 剤 の モ デ ル と し て役 立 つ も の と考 え られ る。 今 後 、TTSの 実 用 化 を さ らに拡 大 す るた め に は 、 新 規 促 進 剤 の 開 発 は 不 可 避 で あ り、 そ の た め に は 既 存 の 促 進 剤 に よ る促進 機 構 の解 明 、 皮 膚 へ の影 響 の測 定 な ど、 生 理 学 的 研 究 の 他 に 、 促 進 剤 の構 造 活 性 相 関 な どの研 究 を 同 時 に進 め る必 要 が あ る と考 え る。 そ の意 味 か らも、 今 回 の経 皮 吸 収 促 進 剤 の 促 進 機 構 解 明 は 有 用 で あ っ た と判 断 す る 。. 19.
(24) 第5節. 小括. 経 皮 吸 収 促 進 剤 は 促 進 機 構 か らつ ぎ の よ う に 分 類 す る こ と が で き る 。. 1.脂. 溶 性 薬 物 の 透 過 促 進. 1)脂. 溶 性 薬 物 の 皮 膚 へ の 分 配 量 の 増 加 に よ る皮 内薬 物 濃 度 の 増 加. laurocapram,1770ctanol,IPM,oleicacid,皿onoolein,cineol,D-limonene. 2)角. 質 層 脂 質 の 流 動 性 の 上 昇 に よ る拡 散 速 度 の 増 加. 1aurocapram,IPM,sodiumoleate,01eicacid,monoolein,cineol, D-limonene. 3)薬. 物 の溶 解 度 の 増 加 す な わ ち 熱 力学 活 動 度 の 上 昇 に よ る皮 膚 透 過 速 度 の 増 加. π一 〇ctanol,IPM,sodiumoleate,皿onoolein,oleyloleate,cineol, D-1imonene. 2.水. 溶 性 薬 物 の透 過 促 進 角 質 層 細 胞 間 脂 質 の 抽 出 に よ る 細 胞 間 隙 の 拡 大 に 基 づ く皮 膚 透 過 速 度 の 増 加 かoctanol,laurocapram,01eicacid,cineo1,D-li釦onene. 一20.
(25) 第2章. 細 胞 間 ルー トにおけ る高 分 子水溶性物 質の経 皮透過 機構 と経 皮吸収促 進剤 に よ る促進効 果. 第1節. 緒言. 近 年 科 学 技 術 の発 達 に よ り、 様 々な化 合 物 が 容 易 に そ して 大 量 に合 成 され る よ う に な っ た 。 以 前 よ り、 微 量 で 生 理 活 性 を持 つ と し て有 用 性 は認 識 され な が ら も、 恒 常 的 な 物 質 供 給 の 困 難 さ か ら医 薬 品 と して の 使 用 は 制 限 され て き た ペ プ チ ドも、 バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー技 術 等 の 発 展 に よ り医療 に供 され る よ うに な っ て き た 。 た だ、 一 般 に ペ プ チ ド性 医 薬 品 は酵 素 分 解 され 、 作 用 時 間 が短 い た め 、 そ の投 与 方 法 は 注 射 が 主 で 、 頻 回 投 与 が 必 要 な た め コ ンプ ラ イ ア ンスが 非 常 に悪 い 。 そ の 問 題 を解 決 す る方 法 と し て 経 皮 投 与 が 考 え られ る。 しか しな が ら、 皮 膚 か らの薬 物 、 特 に ペ プ チ ドの よ う な水 溶 性 で分 子 量 の 大 き な も のの 透 過 性 は一 般 に低 く、 薬 効 を発 揮 させ る た め に は 何 らか の 改 善 策 が 必 要 で あ る 。現 在 、 イ オ ン トフ ォ レシ ス を 用 い た経 皮 投 与 が 一 部 で 行 わ れ 、 若 干 の 有 用 性 が 認 め られ て い る もの の1°'42)、 装 置 の 携 帯 性 等 を考 え る と実 用 的 と は い えな い 。 そ の 点 、 経 皮 吸 収 促 進 剤 は特 別 な 装 置 も不 要 で あ り、 経 済 性 そ して 利 便 性 に 関 して も優 位 で あ る。 第1章. で 低 分 子 の モ デ ル 薬 物 を用 いて 経 皮 吸 収 促 進 剤 の 促 進 機 構 とそ の有 用 性 を 明. らか に した 。 そ こで 本 章 で は 、 ペ プチ ドに 代 表 され る高 分 子 水 溶 性 薬 物 の透 過 性 と経 皮 吸収 促 進 剤 を用 い た 場 合 の促 進 機 構 を 明 らか にす る た め に、 モ デ ル 物 質 と し て分 子 量 の 異 な るfluoresceinlsothiocyanate-labeleddextrans(FITC-dextrans;FD)を. 用. い、 そ の透 過 性 を経 皮 吸収 促 進 剤 を用 い た 場 合 の促 進 機 構 を含 め比 較 検 討 した 。 ま た、 ヘ ァ レス ラ ッ トの皮 膚 とWistarラ. ッ トの皮 膚 を用 い た場 合 のFITC-dextransの. つ い て も比 較 検 討 し た 。. 第2節. 2-1報. 実験 材料 お よび操作 方法. 材料および懇. 動物. 21. 透過 性 に.
(26) 水 溶 性 の 高 分 子 モデ ル 物 質 で あ るFITC-dextransは. 平 均 分 子 量 が4400(FD-4),9600. (FD-10),69000(FD-70)の. も の を いず れ も シ グマ 株 式 会 社 よ り購 入 し使 用 した 。 そ の. 他 の 試 薬 は い ず れ も第1章. に記 載 した もの を使 用 した 。. 実 験 動 物 は清 水 実 験 材 料 株 式 会 社 よ り購 入 した雄 性 ヘ ア レ ス ラ ッ トお よびWistar系 雄 性 ラ ッ トに 固 形 飼 料 と水 道 水 を 自 由 に与 え、 体 重 が そ れ ぞ れ180-220gお. よ び200-. 220gに な る ま で 適 正 な 環 境 下 で馴 化 飼 育 した 後 使 用 した 。. 2-2F17ぴd欲. ぴ 即 ∫のfη γ∫ぴo皮 膚 透週 実 験. ヘ ァ レ ス ラ ッ トそ してW圭starラ ッ トの いず れ の場 合 も第1章 膚 を除 毛 し、 摘 出 し た後 、 水 和 し た(5℃,12h)。 ンッ 型 拡 散 セ ル(透 に は 、 促 進 剤(濃. 過 面 積2.01cm2,レ. 度 はTable5を. 水 和 に よ り平 衡 化 した 皮 膚 を、 フ ラ. セ プ タ ー容 量10.5mL)に. 参 照)を. と同 様 の 方 法 で 腹部 皮. 装 着 した 。 ドナ ー 部. 溶 解 ま た は懸 濁 させ た55%EtOH溶. 液 を1.0. 凪 加 え、 セ ル の 上 部 をパ ラ フ ィル ム を用 い密 閉 した 。 レセ プ タ ー 溶 液 に は 防 腐 剤 を添 加 し たpH7.4のbufferを. 使 用 した 。 レセ プ タ ー部 を恒 温 槽 中 で37℃ に 保 ち 、 内部 溶 液. をマ グ ネ チ ック ス タ ー ラ ー を用 い撹 拝 し た。12時 間 上 記 の 方 法 で処 理 し た後 、 ドナ ー 溶 液 を ろ紙 を用 い て 取 り除 い た 。 ま た 、 レセ プ タ ー溶 液 も取 り除 き、 新 た に あ らか じ め37℃ で 加 温 して い たpH7.4のbuffer(防 7.4のbufferに. 腐 剤 添 加)を. 溶 解 させ た0.5%のFITC-dextrans溶. 加 え た 。 次 に ドナ ー 部 にpH. 液1.OmLを. 加 え、 セ ル の 上 部 をパ ラ. フ ィル ム を用 い密 閉 した 。 実 験 中 は 、 レセ プ タ ー部 を恒 温 槽 中 で37℃ に 保 ち、 内部 溶 液 を マ グ ネ チ ック ス タ ー ラ ー を用 い撹 絆 した。 経 時 的 に セ ル の サ イ ドア ー ム部 よ り レ セ プ タ ー 溶 液 を採 取 し、 定 量 時 ま で一40°Cで保 存 した 。. 2-3.角 第1章. 貿層 雛. 蹴 旨質の抽 出 とセ ラミ ドの定量. と同様 の方法 で角質 層 を調製 した後、脂質 を抽 出 し、 セ ラ ミ ドを定量 した。. 2-4ア. ノπ 一(メ αr鉱3刀3の 定 量. FITC-dextransの (HitachiF-4010)を 励 起485nm、. 定 量 は 、 レ セ プ タ ー 溶 液50μLを. 精 製 水 で 希 釈 し、 蛍 光 光 度 計. 用 い 、 そ の 蛍 光 強 度 を測 定 す る こ と に よ り実 施 し た 。 測 定 波 長 は. 発 光515nmを. 用 い 、 得 ら れ た 値 を あ らか じ め 作 成 し た 検 量 線 に あ て は め る. 22.
(27) こ と に よ り 透 過 し たFITC-dextransの. 2-5経. 量 を算 出 した 。. 皮 透 週 パ ラメ ー タ ーの葦 出 法 お よ び繍)鰯. 第1章. と同様 にFITC-dextransの. 透 過 グ ラ フ に お け る見 か け 上 の直 線 部 分 を最 小 二. 乗 法 で直 線 回 帰 す る こ と に よ り、透 過 速 度Jsと ラグ タ イ ム を算 出 し た。 ま た、 統 計 解 析 お よび 各 デ ー タ の 表 示 も第1章. 第3節. 3一. と同様 と し た。. 実験結果. ヱ. ヘ ア レ ス ラ ッ み に お げ るFZπLO駄. ぴ 副 ∫の 加y1ひo皮. 促 進 剤 を 前 処 理 し た 後 にFITC-dextransを 皮 膚 透 過 グ ラ フ をFigure8に. 庫 透1週%鹸. 負 荷 し た 際 の 、 ヘ ア レ ス ラ ッ トに お け る. 、 透 過 パ ラ メ ー タ ー をTable5に. Figure8.PenetrationProfiIesofFITC-DextransthroughHairlessRatSkin PretreatedwithVariousE!1hancers. (A)pretreatedwith55%EtOH;(B)with2%laurocapram;(C)with20%ノ70ctanol;(D)with CHCI3:嫉eOH(2:1,v/v).PenetrationsofFD-4(●),FD-10(○)andFD-70(■). Po主ntsandverticalbarsrepresenttheπlean±SD(n=3),. 23. 示 した 。.
(28) Table5.EffectofPretreat皿entofHairlessRatSkinwithVarious EnhancersonPercutaneousPenetrationParametersofFITC-1)extrans. FD-4. FD-10. FD-70. JsLagtimeJsLagtimeJsLagtime 〈芦g/c皿2/h)〈h)(辞g/cm2/h)(h)(μg/cm2/h)(h). 55%EtOH (Contro1) 1.5%OTG. 0.119. 1.037. 0.086. 1.531. 0.015. 1.470. (0.037). (0。489). (0,016). (0、429). (0.003). (L646). 0.094. 1.858. (0.009). (0.178). 0.143 (0.038). 5%DMSO. 0.054b). 2%N凱P. 20%刀. 犀Octanol. 0.127b〕 (0.231) 0.166. (0.014). (0.738). 0.093. 0.749. (0.023). (0。265). 1.640a》. 0.466a) (0.186). 20%IPM. 1.345a) (0.262). 5器01eicacid. 0.688a; (0.178). 2%Cineo1. 0.443a) (0.095). CHC13:MeOH (2:1,v/v). 1.856a). 0. 0.02gb). 0。042b) (0。Ol1). 0. (0.892) 0.087. 0.289. (0.348). (0.004). (0.610). 0.712a). (0.101) 0、338a). (0.193). (0.117). 0. 0.148a). (0.568) 0. (0.Ol2). 0.096b, (0.033). 1.533. 0.155a}. (0.217) 0. 1.226b) (0.460). (0.282). 0.346a}. 0. 0.968a). (0.Ol4). 0. (0、190). (O.160). (0.257) 1.041. 0.834 (0。608). 0. 1.781a). (0.642) 0.356. (0.836). 0.OlO. 0.015. (0.191). 0,832. (0.018). (0.002)'. 0. 1.363a). 1.894. 0.400. (0.012). (0.434). 2%Laurocapram. 0.057b). 0.ogga) (0.Ol2) 0.702a). 0.031 (0.541) 1.100 (0.162) 1.297 (0.416) 0.644 (0.389) 0. (0.Q78). NumbersinparenthesesdenoteSD(n=3). a)P〈0,01andb)ρ(0.05co皿paredwiththecontrol.. FITC-dextransの. 透 過 速 度Jsは. cineol,oIeicacidで. 脂 溶 性 の 促 進 剤 で あ るlaurocapram,πoctano1,IPM,. 前 処 理 す る こ と に よ り大 幅 に 増 大 し た 。 ま た 、 ラ グ タ イ ム の 減. 少 も 多 く の 促 進 剤 で 確 認 さ れ た 。 特 に 、 η一〇ctanolで と 比 較 し 、 約15倍. はFD-4,FD-10に. お い てcontrol. の 促 進 効 果 が 認 め ら れ 、 こ の 値 はCHCI3:MeOH=2;1(v/v>混. 処 理 し た 場 合 と 同 等 で あ っ た 。 一 方 、 比 較 的 親 水 性 の 促 進 剤 で あ るNMP,DMSO等 効 果 は 認 め ら れ な か っ た 。 な お 、3種. のFITC-dextransを. 液 で で は. 比 較 す る と、 いず れ の促 進 剤. を 用 い て 前 処 理 し た 場 合 も、 分 子 量 の 増 大 と 共 に 透 過 は 減 少 す る傾 向 を 示 し た もの の 、 1aurocapramで. 処 理 し た 場 合 の み 、FD-10とFD-4の. 一24一. 透 過 とが 逆 転 す る結 果 とな っ た。.
(29) 3-2角 第1章. 質 層 紹 胞 鰯 旨質 の抽 脇 と皮)霞透 翅 と の祖 欝 に お いて 、 低 分 子 の 水 溶 性 薬 物(尿. 素)の. 皮 膚透過 性 が角質 層細胞 間脂 質 の. セ ラ ミ ド抽 出 量 と相 関 関 係 が あ る と報 告 し た 。 そ こ で 今 回 、 高 分 子 水 溶 性 物 質 の FITC-dextransに. お け る セ ラ ミ ド抽 出 量 と皮 膚 透 過 性 と の 関 係 を検 討 し た 。. まず 、 角 質 層 細 胞 間 脂 質 セ ラ ミ ドの抽 出 は第1章 1aurocapramで. で も報 告 した とお り、 丑octanol,. 顕 著 に高 く、 全脂 質 の約8割 が抽 出 され 、IPM,01eicacidで. もcontrol. の 約10倍 の 抽 出が 認 め られ た(Table6)。 次 に、 この セ ラ ミ ド抽 出量 と各FITC-dextransの こ ろ(Figure9)、. いず れ のFITC-dextransも. 透 過 速 度Jsと の 相 関 を確 認 した と. セ ラ ミ ド抽 出量 と透 過 速 度Jsと の 問 に 有. 意 な相 関 が 確 認 され た(井0.828∼0.920)。. つ ま り高 分 子 水 溶 性 物 質 のFITC-dextrans. も尿 素 同 様 、 皮 膚 を透 過 す る際 は主 に細 胞 間 隙 を通 過 す る と判 断 され た。. Tabie6.Re皿ovalofCera皿idesfromtheStratu皿 Corneu皿byVariousEnhancers. Re皿ovalofCerainides. Enhancer. %ofStratu皿 Corneu皿a). 55%EtOH. 0.036±0.034. 4.9. _c). l.5%OTG 5%DMSO 2%N湿P 20%η. %oftotal lipidextractb). 一〇ctanol. 2%Laurocapraln 20%IPM. 0.122±0.056d). 16.6. 0.ll5±0.064d}. 15.7. 0.599±0。209). 81。7. 0.559±0.066). 76.3. 0.326±0.148). 44.5. 5%01eicacid. 0.353±0.124). 48.2. 2%CilleGl. 0.175±0.035). 23.9. CHC13:MeOH(2:1,v/v). 0.733±0.108). 100.0. a)A皿ountafterincubationfor3hwithenhancersolution; eachvaluerepresentsthe皿ean±SD(n=4). b)PercentageoftotallipidsextractedbyCHCl3:MeOH. c)Theamountwasnotdeter皿inedbytheextens量veinterference w童thassay. d)、 ρく0.05ande)、. ρ〈0、01colnparedwith55%EtOH.. 25.
(30) Figure9.Relationshipbet冨eenRe皿oval ofCera塾. 玉desandFlux(Js). ofFITC-DextransinHairless RatSkin. (A)removalofceramdesandfIuxofFD-4 〔z旨0.828(p<0.01)コ (B)re皿ovalofceramdesandfluxofFD-10 [∫ヒ0.863(ρ(0.005):}; (C)removalofceramidesandfluxofFD-70 [ノと0.920(ρ. 3-3班3加rラ. ッ み に お ゲ るF/π. 促 進 剤 前 処 理 後 にFITC-dextransを パ ラ メ ー タ ー をTable7に Wistarラ 4.9倍. 一db蛇r￡ η∫の 加. く0.001)]、. ガ ぴo皮 膚 透 週 実 験. 負 荷 し た 際 の 、Wistarラ. ッ トに お け る 皮 膚 透 過. 示 し た。. ッ トに お け るFITGdextransの. 透 過 速 度Jsは. 、 ヘ ア レ ス ラ ッ ト に 比 べ1.2∼. 高 く な る 傾 向 を 示 し た 。 別 に 、 ヘ ア レ ス ラ ッ ト とwistarラ. 微 鏡 で 観 察 し た と こ ろ 、 ヘ ア レ ス ラ ッ ト が1視 Wistarラ. ッ ト は212±18と. 約3倍. ッ トの 毛 嚢 の 数 を 顕. 野 あ た り68±7で. あ る の に 対 し、. の 数 を示 し た。 そ れ故 、 毛 嚢 す な わ ち 皮 膚 付 属 器 官. が 高 分 子 水 溶 性 薬 物 の 透 過 に 一 部 関 与 し て い る も の と推 測 さ れ た 。. 一26一.
(31) Table7.EffectofPretreat皿entofWistarRatSkinwithVariousEnhancers o!1PercutaneousPenetrationParametersofFITC-Dextrans. FD-4. FD-10. JsLagti皿eFactora). Enhancer. (μ9/cm2/h)(h). (μ9/cm2/h)(h). 0.3450.252. 55%EtOH. 20%η. JsLagtimeFactora). 2.90. (0.094)(0.542) 3.455b)0.194 (0.513)(0.058) 2.063b)0.373 (0.181)(0.301) 2.622b)0.201. 一〇ctanol. 2%Laurocapra皿. 20%IP麺. 2.11. 5%01eicacid 2%Cineol. 1.16. (Ol17) 0758c). (0.047). 3.40. (0188). (0.ユ56). 1,95. (0.142)(0.403). 0.455 (0.261) 0.268 (0.269) 0. (0.607) 1.418b) (0.157) 1.695b) (0153) 0588b). 4.42. (0.435)(0.204) 0.796c)0.448 (0.087)(0.131) 1.507b)0.404'. 0.194 (0.073) 2.805b). 0.066. 2.26. 2.06. 0.80. 1.75. (0,324) 0.500. 0.382. 3.97. 4.90. Nu皿bersinparenthesesdenoteSD(n=3). a)FactorwascalculatedbyJsviaWistarratsk孟n/Jsviahairlessratskin. b)、 ρ〈0.Olandc)Pく0.05comparedwiththe55%EtOH.. 第4節. 考察. ペ プチ ド性 医 薬 晶 に 代 表 され る高 分 子 水 溶 性 物 質 の 皮 膚 か らの透 過 は 一 般 的 に低 い た め 、 全 身 へ の 効 果 を期 待 す るな ら、 経 皮 吸 収 促 進 剤 の 使 用 は 不 可 欠 と い え る。 今 回 第1章. の 結 果 を基 に、 経 皮 吸収 促 進 剤 を選 定 し、透 過 実 験 を行 っ た と こ ろ、 尿 素 の 場. 合 と 同様 、FITC-dextransは す な わ ち 、Table5,6お. 主 に 細胞 間 隙 を通 過 す る こ とが 明 らか と な っ た 。 よびFigure8に. 示 した よ うに 、 角 質 層 の 細 胞 間 脂 質 で あ る. セ ラ ミ ドの 抽 出量 と透 過 速 度 との 間 に良 好 な 相 関 が 得 られ た 。 これ よ り、細 胞 間 脂 質 が 抽 出 され る こ とで 、 細 胞 間 が分 離 し、 生 じ た水 性 の ポ ァ を経 て 、FITC-dextransが 過 し た こ とが 推 測 で き た25)。Scheupleinも. 極 性 物 質 は水 溶 液 と共 にshuntル. 透. ー トを、. ラ グ タ イ ム を ほ とん どな しで透 過 す る と報 告 して い る が43>、 今 回 のFITC-dextransが 短 い ラ グ タ イ ム で透 過 し た こ とは そ れ を実 証 す る もの と考 え られ る 。 更 に、Figure9に で は0.598で. 示 した セ ラ ミ ドの抽 出 量 と透 過 速 度 と の相 関 係 数 も第1章. あ っ た が 、 分 子 量 が 大 き くな る ご とに0.828,0.863,0.920(FD-4,FD一. 27. の尿 素.
(32) 10,FD-70)と. 高 くな っ て い る。 つ ま り、 分子 量 が 大 き くな る ほ ど細 胞 間 隙透 過 が律 速. とな る こ とが 示 唆 され た 。 但 し、 透 過 速 度 は 分 子 量 の増 大 と共 に減 少 し、細 胞 間 隙 の 大 き さ(ボ. ア サ イ ズ)に. (stokes半 径,23.3A)に. 限 界 が あ る こ とが 推 測 さ れ た44-46)。 比 べ 、FD-70(58A)の. 今 回 、FD-4,FD-10. 透 過 は 明 らか に 低 い 結 果 とな っ た 。 稲. 森 ら もエ タ ノ ー ル 処 理 し た ヒ ト表 皮 の 有 効 ボ アサ イ ズ が22-54Aで に 畑 中 ら も通 常 の ラ ッ ト皮 膚 に お け る有 効 ボ アサ イ ズ が3.8-15.8Aと. あ る こ と を47)、 更 推 測 され る と報. 告 して い る こ と を考 慮 す る と4°)、 促 進 剤 を用 い た際 の ラ ッ ト皮 膚 に お け る透 過 可能 な 分 子 の 大 き さはFD-10(分 ま た 、Table7に. 子 量10000)と. お い て 、Wistarラ. 同程 度 のサ イ ズ ま で と判 断 され る 。 ッ トか らの 透 過 が ヘ ア レス ラ ッ トと比 べ1.2∼. 4.9倍 高 くな っ た。 この 理 由 と して 、 両 ラ ッ トの 皮 脂 構 成 成 分 の相 違 や 角 質 層 の 厚 さ、 更 に は 脂 質 成 分 の 差 異 も考 慮 され る が、 最 も大 きい理 由 と し て皮 膚 付 属 器 官 、 特 に毛 嚢 数 の 違 いが 考 え られ た。 実 際Scheupleinは. 皮 膚 付 属 器 官 か らの透 過 が 、 水 溶 性 薬 物. の み で な くス テ ロイ ドの よ う な 脂:溶性 薬 物 に お い て も重 要 な 役 割 を示 す こ と43)、 Illelら お よ びLauerら. も毛 嚢 が経 皮 吸収 に大 き く関 与 す る こ と を報 告 して い る48・49)。. よ っ て 、 今 回 の 結 果 は 、 毛 嚢 経 路 の重 要 性 に つ い て も改 め て 実 証 す る結 果 と な った 。. 第5節. 1.高. 小括. 2.刀. 分 子水 溶性物 質 は主 に皮 膚透過 の際、角質層 の細胞 間隙 を通過 した。. 一〇ctano1,laurocapram,01eicacid,cineol,IPMは. 角質層 の細 胞間脂質 を. 抽 出 す る こ と に よ り細 胞 間 隙 を拡 大 し 、 高 分 子 水 溶 性 物 質 の 透 過 速 度 の 増 加 を もた ら し た。. 3.経. 皮 吸 収 促 進 剤 を使 用 す る こ とに よ り、 分 子 量10000程. 度 までの水溶性 薬物 を. 経 皮 的 に 透 過 させ る こ とが 可 能 で あ る と判 断 され た 。. 4.薬. 物 の経 皮 吸 収 に お い て毛 嚢 等 の 皮膚 付 属 器 官 も、 重 要 な 役 割 の 一 部 を担 っ て い る こ とが 確 認 され た。. 一28.
(33) 第3章. 高 分 子 水 溶 性 モ デ ル物 質 の 皮 膚 透 過 に お け る 〃-octyl一β+thioglucosideの 促 進 機 構 と角 質 層 除去 皮 膚 に お け る水 溶 性 薬 物 の分 子 量 依 存 性. 第1節. 緒言. 前 章 ま で に 、 経 皮 吸 収 に お け る水 溶 性 薬 物 の透 過 機 構 は毛 嚢 等 の皮 膚 付 属 器 官 も 一 部 関 与 す る も の の 、 角 質 層 細 胞 間 隙 を主 に経 由 す る こ と、 そ して そ の 透 過 を促 進 す る た め の経 皮 吸 収 促 進 剤 と して は、 角 質 層 細 胞 間 脂 質 を抽 出 す る能 力 の あ る脂 溶 性 の 促 進 剤(laurocapra皿,IPM等)が. 有 用 で あ る こ と を 明 らか に した 。 ま た、 経 皮 吸 収 促 進 剤. を使 用 す る こ と に よ り、 これ ま で 困 難 と され て きた 高 分 子 水 溶 性 物 質 を透 過 させ る こ と が可 能 で あ る こ と を解 明 した 。 た だ、 水 溶 性 薬 物 と脂 溶 性 の経 皮 吸 収 促 進 剤 で は そ の溶 解 性 が 相 反 す る た あ 、 実 際 の 製 剤 を調 製 す る際 、 基 剤 の 選 択 に 困難 が予 測 され る。 珪Octyl一 β一D-thioglucoside(OTG)は. 糖 鎖 を 有 す る非 イ オ ン性 の 界 面 活 性 剤 で あ り、. 膜 タ ンパ ク 質 の溶 解 剤 と して も使 用 され て い る5G)。OTGが. ペ プ チ ド性 医 薬 品 で あ る エ. ル カ トニ ンの 経 皮 吸 収 促 進 作 用 を示 す こ とに つ い て は、 若 干 の知 見 が得 られ て い る も の の51)、 皮 膚 、 特 に 角質 層 に対 す る作 用 機 構 は 明 らか と な っ て い な い 。 そ こで 本 章 で はOTGに よ る水 溶 性 物 質 の皮 膚 透 過 促 進 機 構 を 明 らか に す るた め に 、 分 子 量180∼69000ま. で の 水 溶 性 物 質 をモ デ ル化 合 物 に 選 定 し、 ヘ ア レス ラ ッ ト皮 膚 に お. け る これ ら化 合 物 の 透 過 性 を、 角 質 層 の形 態 学 変 化 を 含 め 比 較 検 討 した 。 更 に、 角 質 層 除 去 皮 膚(strippedskin)、. す な わ ち生 き た表 皮 と真 皮 部 分 に お け る水 溶 性 物 質 の 透. 過 性 お よ び そ の透 過 性 と分 子 量 との 関 係 に つ い て も検 討 し た 。. 第2節. 実験 材料 お よび操作 方法. 2-1実. 験 材 料 お よ び莫毅 動 物. D-Fructoseは した 。Dextran(平. ナ カ ラ イテ ス ク株 式会 社 よ り、lactoseは. キ シ ダ化 学 株 式 会 社 よ り購 入. 均 分 子 量 一1000)は 名糖 産 業 株 式 会 社 か らの 提 供 品 を使 用 し た。 そ の. 他 の 試 薬 は いず れ も第1章. お よ び第2章. に記 載 した も の を使 用 し た。. 29.
(34) 実験 動物 は清水 実験 材料株 式会 社 よ り購入 した雄性 ヘ ア レスラ ッ トに 固形飼料 と水 道水 を 自由 に与 え、 体重 が170-2009に な るまで適正 な環境下 で馴 化飼 育 した後使用 し た。. 2-25ぴ1ρ. ρθd誼. 第1章. 加 の調 製 と 加. と 同 様 に 、 透 過 実 験 の2日. γ1ぴo皮 膚 透 週 莫 毅 前 に 、 ヘ ア レ ス ラ ッ トの 腹 部 皮 膚 を 電 気 カ ミ ソ リ. を 用 い て 除 毛 し た 。 そ の 翌 日 、stripPedskin群 transparenttape,ニ. チ バ ン)を. に つ い て は 、 セ ロ ハ ン テ ー プ(Magic. 用 い て20回. 接 着 、 剥 離 を 繰 り返 す こ と に よ り、 角 質. 層 の 除 去 を 行 っ た 。 そ の 後 、 全 群 と も 常 法 に 従 い 、 腹 部 皮 膚 を 摘 出 し 、 水 和(5℃, 12h)後. 、 平 衡 化 し た 皮 膚 を 、 フ ラ ン ッ 型 拡 散 セ ル(透. 量10.5mL)に. 装 着 し た 。 ドナ ー 部 に は 、1.5%のOTGを. FITC-dextransま. た は 糖 のbuffer溶. 液(pH7。4)0.8皿Lを. 過 面 積2.01c皿2,レ. セ プ タ ー容. 添 加 も し く は 非 添 加 の0.5% 加 え、 セ ル の 上 部 をパ ラ フ ィ. ル ム を 用 い 密 閉 し た 。 レ セ プ タ ー 溶 液 に は 防 腐 剤 を 添 加 し たpH7.4のbufferを た 。 実 験 中 は 、 レ セ プ タ ー 部 を 恒 温 槽 中 で37℃. 使用 し. に 保 ち 、 内 部 溶 液 を マ グ ネ チ ック ス タ. ー ラ ー を 用 い 撹 拝 し た 。 経 時 的 に セ ル の サ イ ドア ー ム 部 よ り レ セ プ タ ー 溶 液 を 採 取 し 、 定 量 時 ま で 一40℃ で 凍 結 保 存 し た 。. 2-3皮. 膚 か ら の タ ンパ ク 質 溶 出 量 の 激 ぎ. 常 法 に 従 い 、 ヘ ア レ ス ラ ッ トの 腹 部 皮 膚 を 除 毛 後 、 摘 出 し 、 フ ラ ン ッ 型 拡 散 セ ル に 装 着 し た 。 ドナ ー 部 に は 、pH7.4buffer,55%EtOH,1.5%OTGのpH7.4buffer溶 液 も し く は2%laurocapramの55%EtOH溶 ム を 用 い 密 閉 し 、12時. 液1.OmLを. 加 え 、 セ ル の 上 部 を パ ラ フ ィル. 間 処 理 し た 。 処 理 後 、 ドナ ー 溶 液100μLを. 用 い 、Lowry法. に よ. り52)、 皮 膚 か ら 溶 出 し た タ ン パ ク 質 量 を 測 定 し た 。. 2-4角 第1章. 質 層 謁雛. 鰯 蟹. の瀦. 量 藻掟. に 記 載 し た 方 法 で 得 た 角 質 層15皿gに 、1.5%OTGのpH7.4buffer溶. pH7。4bufferを1.5mL加. え 、 密 栓 後 、37℃. 液 または. で2時 間 振 と う し た 。 そ の 混 液 を3000rpmで. 10分 間 遠 心 分 離 し 、 上 清 を 取 り 除 い た 。 次 に 、 沈 殿 物 にCHCl3:MeOH=2:1(v/v)混 を4.OmL加. え 、37°Cで24時. 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 有 機 層 を0.3mLの. 一30. 液. 生 理 食 塩 水 で洗 浄.
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