l:雛
100g
2)ゲ ル 軟 膏 の適 用 法
あ らか じめ 前 日に 電 気 カ ミソ リを用 い 、 ラ ッ トの 腹 部 皮 膚 を除 毛 した 。 そ こ に 円 形
に切 り抜 い た シ リコ ン ゴ ム(内 径2.26cm)を 張 り付 け 、 そ の 内側 に ゲ ル 軟 膏0.59を 均 一 に塗 布 した。 上 部 をア ル ミホ イ ル で覆 い、 テ ー ピ ン グテ ー プ で確 実 に 固定 し た 。 な お 、 角 質 層 の 損 傷 に よ る影 響 を避 け るた め、 同 一 場 所 へ の ゲ ル 軟 膏 の 適 用 は、 約10日 間 の 日数 を 開 け た 後 に 行 な っ た 。
2‑3実 験 寵1骨粗 霧 症 ラ ッ みの惹起
ラ ッ トを無 作 為 にA,B,Cの3群 に 分類 し た。 ペ ン トバ ル ビタ ー ル 麻 酔 下(50皿9/
kg,i.pのA群 に は 卵 巣 摘 出 手 術 、B,c群 に は 偽 手 術(両 腹 部 の切 開 の み)を 実 施 し た。 手 術 後 、Aお よ びB群 に は精 製 水 と低 カ ル シ ウ ム食(オ リエ ン タ ル酵 母 株 式 会 社 、 改 変A/N配 合B変 型:Ca含 量0.003%)を 、C群 に は水 道 水 と正 常 食(MF:Ca含 量0.5%) を 自 由 に与 え、2カ 月 間 飼 育 した 。 飼 育 後、 実 験 的 骨 粗 髪 症 の 確 認 の た め 、 無 作 為 に 一 部 の ラ ッ トを抽 出 し、 体 重 測 定 、 血 液 の採 取 お よ び脛 骨 の摘 出 を行 っ た。
2‑4経 皮 吸 攻 渤 に よ る 骨 粗 霧 症 の 治 鋤 栗
前 記 の 方 法 に よ り 骨 粗 籟 症 を 惹 起 さ せ たA群 の ラ ッ ト を6群(EC,EC+V.D3,V.D3,
EST+V.D3,placebo,lowCa群)に 分 類 し た 。 ま たcontro1群 と し てC群 の ラ ッ ト を 使 用 し た 。EC,EC+V.D3,V.D3,EST+V.D3,placebo群 に は 正 常 食 を 自 由 に 与 え 、 そ れ ぞ れ の 群 に 対 応 す る 軟 膏 を 適 用 し た(48h/回,2‑3日 毎 に6回 適 用)。Control群 に は 正 常 食 を 、lowCa群 に は 低 カ ル シ ウ ム 食 を 与 え 、 そ れ ぞ れ にplacebo軟 膏 を 適 用 し た 。 1カ 月 後 、 体 重 測 定 、 血 液 の 採 取 お よ び 脛 骨 の 摘 出 を 行 っ た 。
2‑5狸 骨 の 翅理
ラ ッ トよ り摘 出 した 脛 骨 の 重 量(湿 重 量)を 測 定 した後 、105℃ で3日 間 乾 燥 させ 、 乾 燥 重 量 を測 定 した 。 これ を るつ ぼ 中 で 、600℃ で6時 間 灰 化 し、 灰 分 重 量 を測 定 した。
得 られ た灰 化 物 を6NHCl2.OmLに 溶 解 させ、 精 製 水 で 希 釈 し た後 、 カ ル シ ウ ム お よ び リ ン の 定 量 を 行 っ た 。
2‑6定 量 法
1)カ ル シ ウ ム の 定 量
血 漿 中 お よ び 脛 骨 中 の カ ル シ ウ ム の 定 量 は 第4章 と 同 様 、 カ ル シ ウ ムCテ ス ト ワ コ ー を 用 い
、orthocresolphtaleincomplexone法 で 測 定 し た 。
一
血 漿 中 お よ び 脛 骨 中 の リンの定 量 はAmes法 を一 部 改 良 して 行 な っ た83)。 そ の 方 法 は 、血 漿 ま た は 試 料50μLに10%ト リク ロ ル 酢 酸2mLを 添 加 して 遠 心 分 離 した 後 、 上 清 1.5mLを 分 取 した 。 こ こに0.42%の モ リブデ ン酸 ア ンモ ニ ウ ム を含 有 した1N硫 酸 と10
%の ア ス コ ル ビ ン酸 と を6:1の 割 合 で混 和 させ た発 色 試 薬 を3.5mL加 え 、37℃ で1時 間 イ ンキ ュ ベ ー トした 。10分 間 室 温 で 放置 した 後 、820nmで 比 色 定 量 した 。
3)ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ 活 性(ALP)の 測 定
ALPは ア ル カ リ フ ォ ス フ ァKテ ス ト ワ コ ー(和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社)を 用 い 、Kind‑
King法 で 測 定 し た84)。 す な わ ちo.05Mの 炭 酸 緩 衝 液 中 に 、5.4調 の4一 ア ミ ノ ァ ン チ ピ リ ン と3.7盛 の フ ェ ニ ル リ ン 酸 を 溶 解 さ せ た 基 質 緩 衝 液 を 、 あ ら か じ め37℃ で2分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 そ こ に 、 血 漿50μLを 添 加 し 、37℃ で3分 間 正 確 に イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 更 に36麟 の フ ェ リ シ ア ン 化 カ リ ウ ム2.OmLを 加 え 、 混 和 し 、 反 応 を 停 止 さ せ た 後 、500nmで 比 色 し た 。 ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ 活 性 はKAUで 示 し た 。
2‑7統 計 解 折
す べ て の デ ー ター は 平 均 値 ±標 準 偏 差 で表 わ し た。 各 群 間 の 検 定 は 、Scheffの 多 重 比 較 法 に よ り行 な っ た 。 得 られ た 危 険 率 が5%未 満 の 時 、 有 意 差 が あ る と した 。
第3節 実験結果
3‑1知 鈴的 骨 粗 撰 症 の.惹逡1
2カ 月 間3群 に分 け飼 育 した ラ ッ トの 体 重 、 脛 骨 重 量 そ して脛 骨 お よ び血 漿 中 の 成 分 につ い て の測 定 結 果 をTable14に 示 し た。
Table14・EffectofOvariecto皿yandFeed董ngonLowCalciu皿D三et onTibiaandPlas皿aCo皿ponents
Bodyweight Group(9)
Tlwihm
Wet Dry Ash
ム且DりC
210.0±7.1a)344.6±14.8a》
202.5±5.6a>341.9±6,1a}
207.5±9.0443.3±7.3
227.6±17.3a>93.3±7.2a}
208.7±3.8a}90.4±5.9a>
333.0±13.7203.6±8.7
Ahonentf童
Group
Ca(皿9)
P (mg)
Ca/dryP/dry weight(%)weight(%)
D‑ ノ/ツ刈aくC
A32.2±3.2a)17.0±1.6a)14.2±1.Oa)7.5±0.4a)1.90:ヒ0.07a, B31.1±2.7a)16.1±1。5a)14.9±1.la)7.7±0.6a)1。94±0.02a) C74.7±2.635.5±1.622.4±0.610.7±0.42.11±0.03
Plas皿ac狙nnt
Group Ca(皿9/dL) P(mg/dL)Alkalinephosphatase(KAU)
血nBρし
8。9±0.4 8.7±0.3 8.6±0.4
5.7±0.5 5.2±0.7 5.5±0.5
36.9±3.8a) 35.2±2.5a}
18.6±1.5
A,ovariectomyandIowCadiet;B,sha皿operationandlowCadiet;
C,sha叫operationandnormaldiet。a)ρ<0.01colnparedwithgroupC.
Ratswerefedoneachdietfor2monthsaftertheoperation.
Valuesareexpressedasthemean±SD(n=4),
体 重 に つ い て は 各群 問 に 有 意 な 差 は 認 め られ な か っ た。 脛 骨 重 量 はA,B両 群 がC 群 に 比 べ 、 湿 重 量 、 乾 燥 重 量 、 灰 化 重 量 共 に、 有 意 に減 少 し て い る こ とが確 認 され た 。 灰 化 後 の脛 骨 成 分 も骨 重 量 と 同様 、A,B両 群 で カ ル シ ウ ム 、 リ ン共 に減 少 、 特 に カ ル シ ウ ム が 顕 著 に減 少 す る こ とが 明 らか とな っ た 。血 漿 中 の カ ル シ ウム 、 リン濃 度 に 有 意 な差 は 認 め られ な か っ た 。 しか し骨 代 謝 の指 標 で あ るALPはC群 に 比 べ 、A,B 両 群 が 約2倍 の 高 値 を示 し、 骨 代 謝 に 異 常 を来 して い る こ とが 確 認 され た 。 これ らの 値 は 既 に報 告 され て い る骨 粗 髪 症 ラ ッ トの 特 性値 と一 致 した85)。 以 上 よ り、2カ 月 間 、 低 カ ル シ ウ ム食 を投 与 す る こ と に よ りA,B両 群 に骨 粗 髪 症 を惹 起 させ 得 る こ
と が 明 ら か と な っ た 。 ま た す べ て の 結 果 に お い て 、A群 とB群 の 間 に 有 意 な 差 は 認 め られ な か っ た 。 つ ま り今 回 の 実 験 で は 、 骨 粗 髪 症 の形 成 に対 し、 卵 巣 摘 出手 術 の影 響 は特 に確 認 で きず 、 低 カ ル シ ウ ム食 の摂 取 が 強 い影 響 を与 え る こ とが 判 明 した 。
3‑2経 波 吸 攻 彫 に よ る骨 粗 蓄 症 の治療 効 栗
骨 粗 霧 症 を惹 起 させ た ラ ッ トに 各TTS製 剤 を1カ 月 間 適 用 し た後 の 、 脛 骨 とそ の 成 分 につ いて の 結 果 をFigure23に 、 血 漿 成 分 に つ い て の 結 果 をTablel5に 示 し た。EC, EC+V.D3両 群 で脛 骨 灰 化 重 量 、 脛 骨 中 の カル シ ウ ム含 有 量 がplacebo群 等 と比 較 して 有 意 に増 加 した 。 この他 に、EC+V.D3群 で リン含 有 量 、EC群 で脛 骨 乾 燥 重 量 に対 す る カ ル シ ウ ム 、 リ ン含 有 率 がV.D3単 独 適 用 群 等 と比 較 し、 増 加 す る傾 向 が 確 認 され た 。 す べ て の 群 間 で血 漿 の カル シ ウ ム、 リ ン濃 度 に有 意 な差 は認 め られ な か っ た 。ALPはEC , EC+V.D3両 群 でplacebo群 に 比 べ 減 少 、 す な わ ちcontrol群 の 値 に近 づ い た 。 今 回 、EC 単 独 も し くはECとV.D3の 併 用 に よ り効 果 が 認 め られ た がV.D3やEST単 独 で は 効 果 が 認 め られ な か っ た 。 つ ま り今 回 の ラ ッ トの 実 験 で は 、ECを 含 有 す る経 皮 吸 収 剤 の 適 用 に よ り、 骨 粗 霧 症 の治 療 効 果 を高 め る ことが 可 能 で あ るが 、V.D3やESTの 単 独 適 用 で は 骨 粗 霧 症 の 治 療 に ほ とん ど影 響 しな い ことが 確 認 さ れ た 。
700 ら
豊,。 。
遷 、。。
暮,。 。
葺 、。。
￡ 100
0
a b)
A
ECEC+VDV.DEST+V.DP[aceboControI333 a
CWOL
Figure23.EffectofEIcatonin,1,25(OH)2置)3(V.D3)
￡stradiolandTheirCombinedUseon TibiaWeightandItsCo皿ponents.
A:Ashweight:a)〆0.05inECvs.plcebo,b)凶).01inEC+V.D3 vs.placebo.Wetweight,tibiaweigtandashweight:ρ(0.05
inallgroupsvs,controlorlowCa
B:Calciu皿:a)ρ 《}.05inECvs。placeoorV.D3,b)ρ 〈0。05in
EC+V.D3vs.Placebo,V.D30r硲T+V.3.Phosphorus:c)ρ 〈0.05
inEC+V.D3vs・V.D3.Calciumandphsphorus:ρ 〈0.01inall groupsvs.controlorlowCa.
C:Calci岨/drytibia:a)ρ(0,05二nECvs.V.D30rEST+V.D3.
Phosphorus/drytibia:b>ρ く0.05inECvs.V.D3。Calc三u皿 ノdry tib三a:∫ メ:0.01inallgroupsvs.controlor工owCa.
Phosphorus/dryt孟bia:ρ く0・01inallgroupsvs・controlandin ECorEC+V.D3vs.lowCa.
EachcGlu皿nrepresentsthemea且 ±SD(n=4‑6).
Table15.君ffectofElcatonin,1,25(OH)2D3andEstradioI
orTheirCo皿binedUseonPlas皿aComponents
一
Syste皿 Ca
(mg/dL)
PAIkalinephosphatase (血g/dL)(KAU)
EC EC+V.D3 V.D3 Est+V.D3 Placebo Control LowCa
8.83±0.20 8.80±0.27 8.49±0.53 8.55±0.50 8.74±0.16 8.94±0.17 8.77±0.34
5.32:ヒ0.35 5,22±0.36 5。08±0.38 5,22±0.26 5。20±0.35 5.58±0.55 5.32±0.26
23.69±1.16a) 22。21±4,01 27.89±3.56b) 27.15±3.17b) 26.57±0.99 18.83±0.75 46.27±2.28
a)SignificantlydifferentfrG皿Placebo,Pく0.05.
b)Significantlydifferentfro皿controlandlowCa,、 ρ<0.Ol.
Valuesareexpressedasthemean±SD(n=4‑6).
第4節 考察
骨 形 成 に関 わ る 因子 と し て、 カ ル シ トニ ン、 活 性 型 ビタ ミ ンD386・87)、 性 ス テ ロ イ ド88'89)な どが あ り、 中 で も人 で は、 閉 経後 の 女 性 に 骨 粗 髪 症 の発 症 頻 度 が増 加 す る 点 か ら、 性 ステ ロ イ ドホ ル モ ンが 重 要 視 され て い る9°)。 しか し今 回 の実 験 で は 、 実 験 的 骨 粗 籟 症 の惹 起 に お いて 卵 巣 摘 出 、 つ ま り卵 胞 ホ ル モ ン欠 乏 の 効 果 は 現 わ れ な か っ た 。 この 理 由 と して 、 人 で の骨 粗 霧 症 の発 症 は、10年 以 上 の 長 い年 月 を要 す るの に 対 し、2カ 月 と い う短 期 間 の うち に実 験 的 に 骨 粗 霧 症 を惹 起 させ た た め、 低 カ ル シ ウ ム食 の 影 響 が 大 き く、 卵 巣 摘 出 の 効 果 が 現 わ れ な か っ た と考 え られ る。
骨 代 謝 は 、 骨 吸 収 と骨 形 成 に 分 類 され 、 中 で も骨 吸収 は、 血 液 中 の カ ル シ ウ ム濃 度 を一 定 に維 持 す る た め、 血 液 中 の カ ル シ ウム が 不 足 す る と、 骨 の カ ル シ ウ ム を溶 解 、 移 行 させ 、 そ の 不 足 を補 う とい う作 用 で あ る87'89'91)。 この こ とは 実 験 的 骨 粗 霧 症 の惹 起 お よ びTTS製 剤 適 用 時 の治 療 効 果 の両 実 験 で 、血 漿 中 の カ ル シ ウ ム 、 リン濃 度 に有 意 な差 が 無 か っ た こ とか らも 明 らか で あ る。 つ ま り低 カ ル シ ウ ム食 に よ り不 足 し た カ ル シ ウ ム が 骨 か ら多量 に流 出 した た め、 骨 粗 髪 症 が 惹 起 され た と判 断 され る。
経 皮 吸 収 剤 適 用 に よ る治 療 効 果 で は、ECを 含 む 製 剤 で そ の 効 果 が 認 め られ た も の の 、 ESTやV.D3単 独 お よ び これ らと の併 用 に よ る柑 剰効 果 は確 認 され な か っ た 。ECの 骨 粗 嶺 症 へ の効 果 は 人 に 対 す る臨 床 結 果 か ら も確 認 され て お り、 ま た 既 に ラ ッ トに お い て 、 血 中 カ ル シ ウ ム 濃 度 の 低 下 作 用 か ら見 た、EC経 皮 吸 収 剤 の 生 物 学 的 利 用 率 が 、24時 間
で4.6%と い う結 果 を得 て い る点 か ら も51)、ECを 含 む 経 皮 吸 収 剤 が 骨 粗 籟 症 の 治 療 に 有 用 で あ る こ とが 実 証 され た。V.D3単 独 で の 効 果 が な か っ た 点 に つ い て は 、 飼 料 中 に V.D3を は じ め とす る各 種 ビタ ミン類 が 適 正 量 配 合 され て い た た め に、 そ の 影 響 が現 わ れ な か っ た も の と考 え られ る。ESTに つ い て は 、 今 回、 実 験 終 了 時 で 約18週 令 の 若 年
ラ ッ トを 用 い、 卵 巣 摘 出 に よ り卵 胞 ホル モ ン欠 乏 を引 き起 こ し た が 、 加 齢 に よ る様 な ホ ル モ ン全 体 の バ ラ ンス に は さ ほ ど影 響 しな か っ た た め 、 ま た は実 験 期 間 が短 か っ た た め 、 効 果 が 現 わ れ な か っ たか の い ず れ か に 起 因 す る もの と推 測 され た92)。
以 上 の よ う に、ECを 含 有 す る経 皮 吸収 剤 の 有 用 性 が 明 らか に な っ た 。 ま た、 低 カ ル シ ウ ム食 に よ り骨 粗 髪 症 が惹 起 す る こと、 カ ル シ ウ ム の 摂 取 量 が 骨 粗 籟 症 の発 生 あ る いは 予防 に非 常 に重 要 な要 因 で あ る こと も確 認 され た。 さ らに ペ プ チ ドが 皮 膚 か ら吸 収 され 、 薬 理 効 果 を示 した ことは 、 今 回 の骨 粗 髪 症 だ け で な く、 様 々 な ペ プチ ド性 医 薬 品 のTTS製 剤 が 、 広範 な疾 患 の 治 療 に有 用 で あ る こ と を示 唆 す る も の で あ る 。
第5節 小括
1.ラ ッ トで の 実 験 的骨 粗 霧 症 は、 低 カ ル シ ウ ム食 の長 期 摂 取 の み で発 症 させ 得 た 。
2.カ ル シ ウ ム食 投 与 とエ ル カ トニ ンま た は エ ル カ トニ ン+活 性 型 ビタ ミ ンD3の 経 皮 吸 収 剤 を適 用 す る こと に よ り、 骨 粗 霧 症 の 治 療 効 果 を高 め る こ とが で き た 。
3.エ ル カ トニ ンの 経 皮 吸 収 製 剤 は、 骨 粗 霧 症 や 高 カ ル シ ウム 血 症 ま た はペ ー ジ ェ ッ ト病 等 に も 有 用 で あ る と考 え られ た 。