た。

2‑25ぴ1ρ ρθd誼 加 の 調 製 と 加 γ1ぴo皮 膚 透 週 莫 毅

第1章 と 同 様 に 、 透 過 実 験 の2日 前 に 、 ヘ ア レ ス ラ ッ トの 腹 部 皮 膚 を 電 気 カ ミ ソ リ を 用 い て 除 毛 し た 。 そ の 翌 日 、stripPedskin群 に つ い て は 、 セ ロ ハ ン テ ー プ(Magic transparenttape,ニ チ バ ン)を 用 い て20回 接 着 、 剥 離 を 繰 り 返 す こ と に よ り 、 角 質 層 の 除 去 を 行 っ た 。 そ の 後 、 全 群 と も 常 法 に 従 い 、 腹 部 皮 膚 を 摘 出 し 、 水 和(5℃,

12h)後 、 平 衡 化 し た 皮 膚 を 、 フ ラ ン ッ 型 拡 散 セ ル(透 過 面 積2.01c皿2,レ セ プ タ ー 容 量10.5mL)に 装 着 し た 。 ドナ ー 部 に は 、1.5%のOTGを 添 加 も し く は 非 添 加 の0.5%

FITC‑dextransま た は 糖 のbuffer溶 液(pH7。4)0.8皿Lを 加 え 、 セ ル の 上 部 を パ ラ フ ィ ル ム を 用 い 密 閉 し た 。 レ セ プ タ ー 溶 液 に は 防 腐 剤 を 添 加 し たpH7.4のbufferを 使 用 し た 。 実 験 中 は 、 レ セ プ タ ー 部 を 恒 温 槽 中 で37℃ に 保 ち 、 内 部 溶 液 を マ グ ネ チ ッ ク ス タ ー ラ ー を 用 い 撹 拝 し た 。 経 時 的 に セ ル の サ イ ドア ー ム 部 よ り レ セ プ タ ー 溶 液 を 採 取 し 、 定 量 時 ま で 一40℃ で 凍 結 保 存 し た 。

2‑3皮 膚 か ら の タ ンパ ク 質 溶 出 量 の 激 ぎ

常 法 に 従 い 、 ヘ ア レ ス ラ ッ トの 腹 部 皮 膚 を 除 毛 後 、 摘 出 し 、 フ ラ ン ッ 型 拡 散 セ ル に 装 着 し た 。 ドナ ー 部 に は 、pH7.4buffer,55%EtOH,1.5%OTGのpH7.4buffer溶

液 も し く は2%laurocapramの55%EtOH溶 液1.OmLを 加 え 、 セ ル の 上 部 を パ ラ フ ィ ル ム を 用 い 密 閉 し 、12時 間 処 理 し た 。 処 理 後 、 ドナ ー 溶 液100μLを 用 い 、Lowry法 に よ

り52)、 皮 膚 か ら 溶 出 し た タ ン パ ク 質 量 を 測 定 し た 。

2‑4角 質 層 謁雛 鰯 蟹 の 瀦 量 藻掟

第1章 に 記 載 し た 方 法 で 得 た 角 質 層15皿gに 、1.5%OTGのpH7.4buffer溶 液 ま た は pH7。4bufferを1.5mL加 え 、 密 栓 後 、37℃ で2時 間 振 と う し た 。 そ の 混 液 を3000rpmで

10分 間 遠 心 分 離 し 、 上 清 を 取 り 除 い た 。 次 に 、 沈 殿 物 にCHCl3:MeOH=2:1(v/v)混 液 を4.OmL加 え 、37°Cで24時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 有 機 層 を0.3mLの 生 理 食 塩 水 で 洗 浄

し た 後 静 置 し 、 分 離 し た 有 機 層0.5〜1.OmLを 用 い 、 第1章 に 記 載 し たLauterら の 方 法 に 準 じ セ ラ ミ ド を 定 量 し た 。

2‑5走 査1型 電 テ〜顧 微鏡 に よ る贈 表 面 観 察

常 法 に従 い 、 ヘ ア レ ス ラ ッ トの腹 部 皮 膚 を除 毛 後 、 摘 出 し、 フ ラ ン ツ型 拡 散 セ ル に 装 着 し た。 ドナ ー部 に、1.5%OTGのpH7.4buffer溶 液 を 加 え、 セ ル の 上 部 をパ ラ フ ィル ム を用 い 密 閉 し、1〜7時 間 処 理 した 。 処 理 後 、 皮 膚 を55%EtOHで2回 洗 浄 し、

2%の グ ル タル ア ル デ ヒ ド溶 液 中 で30分 間 固定 した 。 固定 後 、pH7.2の リ ン酸 緩 衝 液 で 洗 浄 し、 更 に ア セ トン溶 液(段 階 的 に60〜100%に 濃 度 上 昇)で 乾 燥 させ た後 、 白 金 蒸 着 を実 施 し た 。 得 られ たサ ンプ ル の 表 面 を走 査 型 電 子 顕 微 鏡(Hitachis‑700)を 用 い観 察 した 。

比 較 の た め、 脂 溶 性 経 皮 吸 収 促 進 剤 の2%laurocapramと2%cineolの55%EtOH溶 液 で 処 理 した 皮 膚 に つ い て も 同様 に電 子 顕 微 鏡 に よ る表 面 観 察 を行 っ た 。

2‑6定 量 法

FITC‑dextransは 第2章 に 準 じ て 定 量 し た 。D‑Fructose,lactose,dextranは ア ン ス ロ ン ー硫 酸 法 に よ り 定 量 し た 。 す な わ ち 、 レ セ プ タ ー 溶 液200μLに0.2%の ア ン ス ロ ン を 溶 解 さ せ た 硫 酸 を2皿L加 え 、 密 栓 し た 後 、20分 間 静 置 し た 。 静 置 後 、620㎜ で 比 色 し 定 量 し た 。

2〜7経 皮 麗 パ ラ メ ー タ ーの算 出 法 お よ び 統 計解 汐デ

第1章 と同 様 にFITC‑dextransの 透 過 グ ラ フ に お け る見 か け 上 の直 線 部 分 を最 小 二 乗 法 で 直 線 回 帰 す る こ と に よ り、 透 過 速 度Jsと ラ グ タ イ ム を算 出 した 。 更 に、 透 過 係 数Kpを 第1章 に示 し た計 算 式 を用 いて算 出 した 。 ま た、 統 計 解 析 お よ び 各 デ ー タ の 表 示 も第1章 と 同様 と した 。

第3節 実験結果

3‑1」 町ZO‑dθx加8η5の1.ηy1加o皮 膚 透 齪 験

未 処 理 も し く は 所 定 の 処 理 を 行 っ た ヘ ア レ ス ラ ッ ト皮 膚 に お け るFITC‑dextransの invitroで の 透 過 グ ラ フ をFigure10に 、 透 過 パ ラ メ ー タ ー をTable8に 示 し た 。

OTG未 処 理 の 正 常 皮 膚 に お け るFITGdextransの 透 過 は 、 い ず れ の 場 合 も 極 め て 低 か っ た 。 し か し な が ら 、 正 常 皮 膚 に お い て もOTG処 理 を 実 施 す る こ と に よ り 、FITG dextransは 容 易 に 皮 膚 を 透 過 す る こ と が 可 能 と な っ た 。 そ の 透 過 は 分 子 量 依 存 的 、 す な わ ちFD‑4>FD‑10>FD‑70の 順 で あ っ た 。 ま た 、FD‑4,FD‑10に お い て は 、OTG処 理 し た 際 のFITC‑dextransの 皮 膚 透 過 はstrippedskinと 同 等 で あ り 、OTGは 角 質 層 の バ リ ァ 機 能 を ほ ぼ 完 全 に 除 去 す る 効 果 の あ る こ と が 確 認 さ れ た 。 ま た 、OTG処 理 し た 皮 膚 お よ びstrippedskinに お け る 透 過 時 の ラ グ タ イ ム は 、 い ず れ のFITC‑dextransを 使 用 し た 場 合 も 非 常 に 短 か か っ た 。

Figure10、PenetrationProfilesofFITC‑

Dextrans[(A)FD‑4,(B)FD‑10,

(C)FD‑70]throughHa皇 「less

RatSkin.

(●)intactskin;(O)intactskintreated with1.5%OTG;(臨)strippedskin.

Pointsandverticalbarsrepresentthe 皿ean±SD(n=3).

Table8・PenetrationParametersofFITC‑DextransthroughIntact SkininthePresenceofOTGa轟dthroughStripPedSkin

compoundMW

一

Js,μg/cm2/hKp,x10‑5c皿/hLagTime,h

FD‑444000.096±0.005 FD‑1096000.061±0.012 FD‑70690000.023±0.008

1.92±0.10 1.22±0,25 0.45±0.16

0。330±0.296 の 二 。,

OTTrmnt compoundMWJsb),μ9/c皿2/hKpb),xlO‑5cln/hLagTi皿e,h

FD‑4440027.67±4.Ol FD‑10960016.71±1.08 FD‑70690000.82±0.09

553。31±80.100 334.12±21.520.463±0.319

16.29±1.700.611±0.506

StriedSkin compound廼WJsbナ,μ9/cm2/hKpb),xlO‑5cln/hLagTi組e,h

FD‑44400 FD‑IG9600 FD‑7069000

33.88±5.49677.62±109.8玉0.320±0.409 18.68±2.60373.70±51.910.487±0.005

1.78±0.41d,35.57±8.16d)0.745±0.353

a)Eachvaluerepresentthe皿ean±SD(n=3).

b)S三gn三f重cantdifferencebetweenintactskinandOTGtreat【nentor strippedskin(、 ρ〈0.01).c)Notdetermined.d)Significant differencebetweenOTGtreat韮nentandstrippedskin(p<0.01).

3‑2、 皮博 か らの タ ンパ ク質 の 溶 出

OTGは 膜 タ ンパ ク質 を溶 解 す る効 果 が あ り、 そ の 効 果 は 他 の溶 媒 や 界 面 活 性 剤 等 よ り も強 く、 有 効 域 も広 範 で あ る こ とが 知 られ て い る53)。 そ こで、 ラ ッ ト皮 膚 に含 ま れ る タ ンパ ク質 の 溶 出効 果 を、 代 表 的 な 脂 溶 性 の経 皮 吸 収 促 進 剤 で あ るlaUrOCapramと 比 較

した結 果 をFigure11に 示 した 。

OTGお よ びlaurocapra皿 はcontrol群(pH7.4bufferお よ び55%EtOH)と 比 較 して タ ンパ ク質 の 溶 出量 は 高 か っ た。 但 し、laurocapramが 経 時 的 に膜 タ ンパ ク質 を溶 出 させ る の に 対 し 、OTGは3時 間 以 内 の 短 時 間 で 急 速 に 膜 タ ン パ ク 質 を 溶 解 させ る こ と が 明 ら か とな っ た 。

Figure11・ReleaseofProtei11fro灘HairlessRatSkin

.

Allvaluesf・r1・5%OTGwere・ig・ ・ficantiydiffere。tf,。mth。se

forbuffer(ρ く0.05).

Eachcolumnrepresentsthe匡lean±SD(n二3) .

3‑3角 質 層 雛 屑脇髪質 の抽 留

OTGを 使 用 し た際 の 角 質 層 へ の セ ラ ミ ドの 残 存 量 は0.32±0.07%で あ り、pH7.4 buffer処 理 の残 存 量0.75±0.10%と 比 較 す る と、 多 くの セ ラ ミ ドが 溶 出 し た 。 しか し、

この 値 はlaurocapramに 比 べ る と低 く、OTGを 使 用 した 際 の皮 膚 透 過 に は 角 質 層 細 胞 間 脂 質 の 溶 出 以 外 の 要 素 が 関 与 して い る もの と考 え られ た。

3‑4走 査 型 電子顕 微鏡:に よ る観 察

ヘ ア レス ラ ッ トの 皮 膚 を、pH7 .4bufferに 溶 解 した1.5%OTGを 用 い て 処 理 し た際 の 表 面 変 化 写 真 をFigure12に 示 した 。

未 処 理 の もの(A)に お い て は(a)で 示 し た角 質 層 の 細 胞 間 隙 も閉 じて お り、 細 胞 膜 も密 着 して い た。 この 状 態 はbufferで7時 間 処理 した後 も 同様 で あ っ た 。 しか し(B)、

(C)、(D)で 示 す よ うに 、OTGで1〜7h処 理 す る こ と に よ り、 細 胞 膜 の 剥 離 が発 生 し た((b)で 示 す)。 但 し 、 細 胞 間 隙 に つ い て は 、 み か け 上 の 変 化 は 起 こ ら な か っ た 。

な お、Figure13に 示 し た よ う に、laurocapramを は じめ とす る脂 溶 性 の促 進 剤 で処 理 し た場 合 は、 角 質 層 細 胞 膜 へ の 変 化 は起 こ らず 、 角 質 層 細 胞 間 脂 質 の 抽 出 に よ る細 胞 間 隙 の拡 大 の み が認 め られ た 。

a

A

Figure12・ScanningElectron岡icrographs(国agnification,x2000)ofHairless

RatSkintreated冒ith1.5%OTG.°

(A)untreated;(B)treatedforlh冒ithOTG;(C)treatedfor3hワithOTG;(D)treatedfor7h 冒ithOTG,冒here脇a脚indicatescelljunction(intercellularspaces)and喝bのindicatesstratu皿 comeummembrane.

＼ 一 凝

＼ ︑

鴛 ︑ ︑

L、

.'＼

伽