25。Omg 2.09 10.09 1.09
1.09
2・09
ThegeIfor皿ulationswerepreparedbyaddingPurifiedwatertogiveatotalweightoflOO9, a)[1251]Ebiratidehadaspecificactivityof13。96GBq/g.b)6400U/mg.c>10mg/皿L.
2‑4讃 脈 応投 与
実 験 の 前 日に 、 あ らか じめ ラ ッ トの頸 静脈 に シ リコ ンチ ュ ー ブ を用 い、 カ ニ ュ レー シ ョン手 術 を行 っ た69)。 実 験 当 日、 生理 食 塩 水 に溶 解 させ た[1251コEbiratideも
し くはECを カ ニ ュ レー シ ョ ンチ ュ ー ブ を介 して 投 与 した 。 投 与 後 、 チ ュ ー ブ よ り血 液 を経 時 的 に 採 取 し、 直 ち に遠 心 分 離 を行 い血 漿 を分 取 し た。 な お 、EC投 与 群 に つ い て は 食 事 に よ る血 漿 中 カ ル シ ウ ム濃 度 の 変 動 を避 け る た め 、EC投 与16時 間 前 か ら投 与 後 24時 間 ま で 絶 食 した。
2‑5ZηFノ むrOl経皮 透 遡 鬼 鹸
常 法 に従 い、 ラ ッ ト腹 部 を除 毛 し、 皮 膚 を摘 出 した後 、 水 和 し た(5℃,12h)。 水 和 に よ り平 衡 化 した 皮 膚 を、 フ ラ ン ツ型 拡 散 セ ル(透 過 面 積2.01cm2,レ セ プ タ ー容 量
10.5皿L)に 装 着 し た 。 ドナ ー 部 に は 、TablelOに 示 し た ゲ ル 軟 膏0.59([1251]
Ebiratide41.7kBq含 有)を 均 一 に 塗 布 し 、 そ の 上 部 を ア ル ミ ホ イ ル で 覆 い 密 閉 し た 。 レ セ プ タ ー 溶 液 に は 防 腐 剤 を 添 加 し たpH7.4のbufferを 使 用 し た 。 実 験 中 は 、 レ セ プ タ ー 部 を 恒 温 槽 中 で37℃ に 保 ち 、 内 部 溶 液 を マ グ ネ チ ッ ク ス タ ー ラ ー を 用 い 撹 拝 し た 。 経 時 的 に セ ル の サ イ ド ア ー ム 部 よ り レ セ プ タ ー 溶 液 を 採 取 し 、 放 射 活 性 を 測 定 し た 。
2‑61刀 γ頚o 経1皮吸 攻 契 験
実 験 の 前 日 に、 あ らか じめ ラ ッ トの頸 静 脈 へ の カ ニ ュ レー シ ョン手 術 と腹 部 の 除 毛 を実 施 し た 。実 験 の 当 日、 ラ ッ ト腹 部 に 円形 に 切 り抜 い た シ リコ ン ゴ ム(内 径2.26c皿) を張 り付 け、 そ の 内側 にTablelOに 示 した ゲル 軟 膏0.59(EB)ま た は0.49(EC)を 均 一 に塗 布 し、 そ の 上 部 を ア ル ミホ イ ル で覆 い、 テ ー ピ ング テ ー プ で 固 定 した 。 適 用 後 、 カ ニ ュ レー シ ョンチ ュ ー ブ よ り経 時 的 に 採 血 を行 い、 血 漿 中 の[1251]Ebiratideの
放 射 活 性 ま た は カ ル シ ウム 濃 度 を定 量 した 。 な お、EC投 与 群 に つ い て は適 用16時 間 前 か ら適 用 後24時 間 ま で は静 脈 内投 与 と同様 絶 食 を行 っ た 。
2‑‑7f125ノ ー7励1r8亡1dθ の 組 綴 移 行 盤 測 定
静 脈 内 投 与 に お い て は 、2‑4と 同 様 の 方 法 で 生 理 食 塩 水 に 溶 解 し た[1251]Ebi‑
ratide(41.7kBq/rat)を 投 与 し た30分 後 に 、 経 皮 適 用 に お い て は2‑6と 同 様 の 方 法 で ゲ ル 軟 膏0.5gを 適 用 し た12時 間 後 に 、 ラ ッ ト を 放 血 致 死 さ せ た 。 そ の 後 、 素 早 く 脳 、 肝 臓 、 腎 臓 、 脾 臓 を 取 り 出 し 、 冷 生 理 食 塩 水 で 洗 浄 し た 後 、 放 射 活 性 を 測 定 し た 。
2‑8だ25!‑7動 ノraε1dθの 放 射 涯 産 測 定
血 漿 お よ び 組 織 中 の[1251コEbiratideの 放 射 活 性 は ガ ン マ カ ウ ン タ ー(ア ロ カ 株 式 会 社:AutoWellGa㎜aSyste組,ARC‑370)を 用 い て 測 定 し た 。
2‑9血 漿 中 の.カ ル シ ウ ム 濃 麓 の 測 熔
血 漿 中 の カ ル シ ウ ム 濃 度 は カ ル シ ウ ムCテ ス ト ワ コ ー(和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社)を 用 い 、orthocresolphtaleincomplexone法 で 測 定 し た 。 す な わ ち 血 漿50μLに 緩 衝 液
と し て0.88Mの モ ノ エ タ ノ ー ル ア ミ ン5.0皿L、 そ し て69mH8‑quinolino1に0.63皿Mの
orthocresolphtaleinco皿plexoneを 溶 解 さ せ た 発 色 試 薬0.5mLを 加 え た 。 こ の 液 を 混 和 し 、5分 間 放 置 し た 後 、 分 光 光 度 計 を 用 い 、540r皿 で 比 色 定 量 し た 。
2‑10薬 物透 過パ ラメ ー タ ー の算 出 法 お よ び統 辮 祈 11nvltro、'渦 パ ー メ ー ター
第1章 と同 様 に[1251コEbiratideの 透 過 グ ラ フ に お け る見 か け 上 の 直 線 部 分 を最 小 二 乗 法 で 直 線 回 帰 す る こ と に よ り、 透 過 速 度Jsと ラ グ タ イ ム を算 出 した 。 ま た、 透 過 係 数Kpを 第1章 に 示 した計 算 式 を用 いて算 出 した 。
2几 ∠ の パ ラ メ ー タ ー
[1251]Ebiratide静 脈 内 投 与 後 の 、 薬 物 体 内 動 態 は 、 山 岡 ら の 解 析 ソ フ ト(凱TI) を 用 い7°)、 次 式 に 示 す2一 コ ンパ ー トメ ン トモ デ ル で 、 非 線 型 最 小 二 乗 法 に よ り算 出 し た 。
CF五 θ一α亡十Bθ 一βオ
こ こ でtは 投 与 後 の 時 間 を 、 α は そ の 時 点 で の[1251]Ebiratideの 血 漿 中 放 射 活 性(cpm)を 示 し た 。 乃 、 π 、B、 β は 二 指 数 式 定 数 で あ る 。
3)薬 理 効 果 一時 間 曲線 下 面 積(AUE)の 算 出
エ ル カ トニ ンの効 果 で あ る、 血 漿 中 カ ル シ ウム濃 度 の低 下 量 を指 標 と し、 そ の積 分 値 を静 脈 内投 与 も し くは 経 皮 適 用 後24時 間 ま で 台 形法 に よ り計 算 し、AUEを 求 め た 。 ま
た、 次 式 に示 す モ ー メ ン ト解 析 に よ り、 薬 理 効 果 と時 間 の 一 次 モ ー メ ン ト曲線 下 面 積 (AUME)お よ び平 均 効 果 持 続 時 間(MET)を 求 め た71'72)。
… デt…
MET=AUMEo‑24 AUEo‑24
な お 、 統 計 解 析 お よ び 各 デ ー タ の表 示 は第1章 と同様 と した 。
第3節 実験結果
3‑1だ25刀 動1r8む ノdθ静 脈 殉 投 与 後 の.並 中 動 態 お よ び エ ノ〃カ み ニ ン 静 脈 内 投 与 授 の 擁 漿 中 カ ル シ ウ ム 灘 の 推 移
[1251コEbiratideを 静 脈 内 投 与 し た 後 の 血 中 放 射 活 性 の 推 移 をFigure16に 、 エ ル カ トニ ン を 静 脈 内 投 与 し た 後 の 血 漿 中 カ ル シ ウ ム 濃 度 の 推 移 をFigure17に 示 し た 。
[ユ251]Ebiratideは2相 性 の 消 失 を 示 し た 。 こ の 消 失 曲 線 を2一 コ ン パ ー トメ ン ト モ デ ル で 解 析 し た と こ ろ 、 分 布 相 の 薬 物 消 失 半 減 期(t・/2。)はo.23±o.08h、 消 失 相 の 薬 物 消 失 半 減 期(t・/2β)は3.28±o.97hと な り、 放 射 活 性 で 判 断 し た 薬 物 の 消 失 は 非 常 に 速 い こ と が 判 明 し た 。
エ ル カ トニ ン(40U/rat)を 静 脈 内 投 与 す る こ と に よ り 、 血 中 の カ ル シ ウ ム 濃 度 は 急 速 に 低 下 し 、 そ の 効 果 は 投 与 後3〜30時 間 継 続 し た 。 な お 、 投 与 後24時 間 ま で の AUEo.24の 値 は 、57。9±7.5mg・h/dLと 算 出 さ れ た 。
(ぢ ＼ O ∈ ご Φ ﹀ Φ 三 ⊇ 2 8 窪 ω "5 己
Time(h)
Figure17.Changesi!1PlasmaCalciu皿Concentrations
Followingi.v.AdministrationofElcatonin.
Eachpointrepresentsthemean±SD(n=4‑・5>, (○)saline;(●)elcatonin,40U/rat.
3‑2 f12517動 ∫」瓶 ∫(ねの 加 眈ro経 皮 透 罎実凝
[1251]Ebiratideを 含 む ゲ ル 軟 膏 を ラ ッ ト皮 膚 に 適 用 し た と き の 放 射 活 性 で 求 め た 薬 物 の 透 過 グ ラ フ をFigure18に 、 そ の パ ラ メ ー タ ー をTable11に 示 し た 。
0 10 20 30 40
50Time(h)
Figure18.PenetrationProfilesofRadioactivity throughRatSkinafterApPlicationof For皿uIatio!10f[1251:]Ebiratide.
Eachpo正ntrepresentsthe皿ean±SD(n=4).ApPlieddose offor皿ulationwasO.59([1251]Ebiratide41.7kBq/4c皿2).
(○)Rp.1;(■)Rp.2;(口>Rp.3;(×)Rp.4;(▲)Rp.5.
Table11.InVitroPercutaneousPenetrationPara皿eters ofRadioactivitythroughRatSkinafter ApPlicationof[1251コEbiratide
FormuIation
Js (cpm/cm2/h)
Kp (x10‑4cm/h)
Lagti皿e (h)
Rp.l Rp.2 Rp.3 Rp.4 Rp.5
1397±401 16390±337ga) 23959±10191a)
1299±426 3016±245
2,79±0.81 32.78±6.76a>
47.92±20.38a>
2.60±0.85 6.03±0.49
1.073±1.176 0.165±0.067 0.222±0.129 0.041±0.721 0
Eachvaluerepresentsthemean土SD(n=4).
a)ρ<0.001co皿paredwithRp.1.
経 皮 吸 収 促 進 剤 と し てOTG,taurocholateお よ びEDTAを 配 合 し た 処 方3そ し てOTG, taurocholateを 配 合 し た 処 方2の 透 過 性 は コ ン ト ロ ー ル で あ る 処 方1の10倍 以 上 高 か
っ た 。 し か し な が ら 、Gl一 β一CyDを 配 合 し た 処 方4お よ び 基 剤 で あ る プ ロ ピ レ ン グ リ コ ー ル を 増 量 し た 処 方5で は 顕 著 な 透 過 性 の 促 進 効 果 は 認 め ら れ な か っ た
。 な お 、 intactの[1251]Ebiratideお よ び 皮 膚 透 過 後 の レ セ プ タ ー 液 をSephadexG45カ ラ ム を 用 い 、 分 子 量 に よ る 分 離 を 実 施 し た と き の 各 フ ラ ク シ ョ ン に お け る 放 射 活 性 濃 度 を Figurel9に 示 し た 。 処 方3に お い て 分 解 物 と 考 え ら れ る ピ ー ク が 出 現 し て い る も の の 、
[125i]Ebiratide本 体 は 皮 膚 透 過 後 も 多 く 残 存 し て い る こ と が 確 認 さ れ た.
Figure19.ElutionProfilesofE1251]Ebiratide
PenetratedthroughSkiaonSephadexG‑15 Colu皿nChro皿atography.
(岩＼㎝3⊆￡2⊆8⊆8岳りoと
Thereceptorso11】tionobtainedbytheinvitropenetrationstudyand intactEbiratidewereapPhedtoaSephadexG‑15column(1.5x25cm)・
(O)intactEbiratide(μg/mL);(●>and(▲)thereceptorsolutions obtainedafterapPlicationofRp・2andRp・3,respectively・
3‑3f125∫ 」 肋1raがdθ の 加 γ∫四軽 及1吸攻 試 験
Invitroに お い て 高 い皮 膚 透 過 性 を示 した処 方2お よ び 処 方3を 用 い て 、invivoに お け る経 皮 吸 収 実 験 を実 施 し た 。 ラ ッ トに ゲ ル 軟 膏 を48時 間 適 用 した と きの 血 中放 射 活 性 推 移 をFigure20に 示 し た 。 処 方2お よ び処 方3を 適 用 した と きの 血 中 放 射 活 性 は 、 経 皮 吸 収 促 進 剤 を配 合 して い な い 、 コ ン トロー ル の処 方1と 比 較 し、 高 価 を示 した 。
ま た、 適 用 後7時 間 程 度 経 過 し た後 の血 中 放 射 活 性 は 定 常 状 態 を示 す こ と よ り、 本 処 方 が 血 中 濃 度 を一 定 に 保 つ の に適 切 で あ る こ とが 確 認 され た 。
3‑4だ25∫ フ 励1r説 ノdθの静 療 内投 与 後 お よ び7器 製 剃潮 後 の 組 綴内 分 布 [1251]Ebiratideの 各 組 織 内 に お け る放 射 活 性 をFigure21に 示 した 。
静 脈 内投 与30分 後 の 濃 度 は 腎 臓 で 有 意 に高 く、 そ の 値 は 大 脳 皮 質 、 肝 臓 、 脾 臓 の 約 4倍 で あ り、[1251]Ebiratideは 全 身 を循 環 した後 す み や か に腎 排 泄 され る と推 測 さ れ た 。 通 常 ペ プ チ ドは 肝 臓 、 腎 臓 そ し て 末 梢 の 組 織 で 代 謝 分 解 さ れ 、 未 分 解 物 が 尿 中 に排 泄 され る こ とは な い た め 、 これ らの放 射 活 性 は 分 解 物 の もの で あ る と判 断 され た 。 ま た 、 大 脳 皮 質 に お い て も放 射 活 性 が認 め られ た こと よ り、Shimraら の 報 告 に も示 さ れ る よ う に73)、 ペ プ チ ドの 一 部 は 血 液 脳 関 門 を通 過 す る と考 え られ た74)。
(Φ8εoま)のoコω2εう一>B°5書歪
3‑5エ ル カ みニ ンの 加 γルo経 皮 吸夜 実 験
エ ル カ トニ ンのTTS製 剤 を ラ ッ トに適 用 し た と きの 血 中 カ ル シ ウ ム 濃 度 の 推 移 を Figure22に 、 パ ラ メ ー タ ー をTable12に 示 した 。血 中 の カ ル シ ウ ム濃 度 は急 速 に低 下
し、 適 用 後3時 間 か ら、 少 な く と も24時 間 ま で は一 定 の薬 理 効 果 を示 す こと が確 認 され た 。 今 回 の 処 方 中 で はD‑li皿oneneとtaurocholateを 配 合 した処 方7が 最 も高 い 薬 理 効 果 を示 し、 静 脈 内 投 与 時 と比 較 した 見 か け の 薬 理 学 的 利 用 率 は8.68±1.04%で あ っ た 。
Table12.Phar皿acodyna皿icParametersofElcatoninFollowingItsSinglei.v.
andPercutanous(P.c.)Administrat玉ons
i.v.
Para皿eter Rp.6 Rp.7 Rp.8
AUEo‑24(mg・h/(IL) AUEo̲24/dose(皿9・h/dL/U) MET(h)
ApParentphar田acological avallability(%)
57.9 1.45
100
5G.19±7.13 0.078±0.011 12.45±1.73
5.42±0.77
80.38±9.60 0.125±0.015 12.95±0.35
8.68±1.04
59.30±7.乞9 0.093±0.Ol1 13.45±0.35
6。40±0.79
Eachvaluerepresentsthe皿ean±SD(n=3).
Dose:Elcatonin(i.v.)40U/ratand(P.c.)640U/rat.
(]ミOEご①﹀Φ三⊇︒舳︻︒冨奮"配(岩＼O∈ご①﹀Φ這⊇り﹁8窪o①径 (﹂ミ◎εご︒﹀︒口彗欄り層・︒8岳㎝匡
Figure22.ChangesinPlas皿aCalciu皿 ConcentrationsFollouing PercutaneoUsApPlication ofTransder皿alSystemof Elcatonin.
Eachpointrepresentsthe皿ean±SD〈n=4), A,Rp.6;B,Rp.7;C,Rp.8.
(○)placebo(control)for皿ulatlon;
(●)elcatoninformulation(640U/rat).
第4節 考察
本 章 ま で に 、 経 皮 吸 収 促 進 剤 を使 用 す る こ とで 、 ペ プ チ ドの よ う な 高 分 子 水 溶 性薬 物 に お いて も、 経 皮 的 に透 過 させ る こ とが可 能 で あ る こ と を報 告 し た ・ しか し なが ら・
ペ プチ ドは 体 内 に 吸 収 され た後 は 急 速 に分 解 され、 か つ 血 中 で の 濃 度 も非 常 に 低 い た め、 通 常 の 方 法 で は 定 量 が 困難 で あ り、 現 在 まで そ の 動 態 は 明確 と され て な か っ た 。 今 回 、1251で ラ ベ ル し たEbiratideを 静 脈 内 投 与 し た と こ ろ 、 一 般 に 報 告 され て い る よ うに そ の 消 失 は 非 常 に速 い こ とが確 認 され た。 ま た、 経 皮 吸 収 促進 剤 と して OTGとtaurocholateを 併 用 した 処 方2お よび 処 方3が 高 い透 過 性 を示 し た こ とは 、 これ ま で の報 告 を裏 付 け る結 果 と な っ た 。 な お、taurocholateに つ い て は 、 胆 汁 酸 が カ ル
シ トニ ンの 口腔 粘 膜 で の 分 解 を抑 制 す る こ とお よび 歯 肉か らの 吸 収 を促 進 す る との 報 告 が あ る こ と よ り、 ペ プ チ ドの 分 解 抑 制 と吸 収 促 進 の 双 方 に作 用 す る もの と考 え られ た75'76)。 ま た 、 処 方3が 処 方2と 比 較 し て若 干 そ の 効 果 が 高 か っ た理 由 と し て、
EDTAが カ ル シ ウ ム イ オ ン と キ レー ト結 合 す る こ と に よ り、 細 胞 間 の 結 合 を緩 め た こ と が 考 え られ た12'77'78)。 但 し、OTGと イ ン ス リンの 経 鼻 吸 収 で そ の 促 進 効 果 が 知 られ て い る シ ク ロデ キ ス トリ ン類(Gl一 β一CyD>79)を 併 用 した 処 方4は 透 過 の 促 進 が 認 め ら れ な か っ た 。 この理 由 と して 、Gl一 β一CyDを添 加 す る こ と に よ り、 ゲル 軟 膏 の物 性 が 変
化 、 す な わ ち 、 粘 性 等 が 変 化 した こ とが 関 係 して い る と推 測 され た 。
[1251]Ebiratideのinvivoに お け る経 皮 吸 収 後 の血 中放 射 活 性 はinvitroで の 結 果 か ら予 測 され る よ り低 か っ た。 これ は 静 脈 内投 与 の結 果 か ら判 断 され る よ う に、 急 速 な代 謝 が 影 響 して い る もの と考 え られ る。 よ っ て 、 血 中放 射 活 性 は 低 か っ た もの の、
適 用 初 期 に は 経 皮 吸 収 され て い る こ とが推 測 され た 。 更 に、 薬 物 の 放 射 活 性 は 長 時 間 一 定 濃 度 を維 持 して お り、 か つ 、 脳 へ の移 行 も示 唆 され た こ と よ り、 本TTS製 剤 はATD に 対 して 効 果 を十 分 に発 揮 出来 る もの と考 え られ た 。
エ ル カ トニ ンの経 皮 吸 収 に お い て も、 静 脈 内投 与 時 と比 較 す る と 多 くの投 与 が 必 要 で あ っ た もの の 、TTS製 剤 は長 時 間 の 薬理 作 用 を示 し、 特 にD‑1imoneneを 配 合 し た処 方
7で の利 用 率 は 高 値 を示 した 。D‑Limoneneは 第1章 で 、 薬 物 の 初 期 透 過 を 高 め る効 果 が あ る と報 告 した が 、 本 結 果 に お い て も、 適 用 初 期 の血 中 カ ル シ ウ ム濃 度 の低 下 は 今 回 使 用 し た処 方 の 中 で最 も大 き く、 これ ま で の 報 告 を実 証 す る結 果 と な っ た 。
以 上 の こ と よ り、 ペ プ チ ドの体 内動 態 、 特 に脳 内 を含 む 各 臓 器 の移 行 性 を確 認 で き、
更 には ペ プ チ ドを含 有 す るTTS製 剤 の 有用 性 を実 証 す る こと が で き た 。
第5節 小括
1.[1251]Ebiratideを 静 脈 内 投 与 し た と き の 体 内 か ら の 消 失 は 非 常 に 速 く 、 体 内 で 分 解 さ れ た 後 腎 排 泄 さ れ た 。
2.OTGとtaurocholateを 経 皮 吸 収 促 進 剤 と し て 使 用 す る こ と で 、[1251コEbira‑
tideの 皮 膚 透 過 性 は 高 ま っ た 。 ま た 、 こ れ ら 促 進 剤 を 配 合 し たTTS製 剤 を 適 用 し た 際 の 薬 物 の 放 射 活 性 は 長 時 間 一 定 濃 度 を 維 持 し た 。
3.経 皮 吸 収 さ れ た[1251コEbiratideの 一 部 は 血 液 脳 関 門 を 通 過 し 、 脳 内 に 移 行 す る も の と 考 え ら れ た 。
4.D‑Limoneneとtaurocholateを 併 用 す る こ と で エ ル カ トニ ン の 皮 膚 透 過 性 は 促 進 さ れ 、 特 に 適 用 初 期 段 階 で の 血 中 カ ル シ ウ ム 濃 度 の 低 下 が 大 き か っ た 。