蛋白 蛋白 発現 関す 研 究 咽頭癌 け 産 物 遺伝子

金 沢 大学 十 全 医学 会雑 誌 第^{1 0 5}巻 第2 号 1 8 7 ^‑2 0 2(1 9 9 6)

上咽頭 癌^{に お}け^{る E} p^stein ^‑B a r r ウ イ ^{ル ス} 遺 伝子産物^{お よび}

p5 3 蛋 白^{, b cト2} 蛋 白^の 発 現^に関 す^る研究

金 沢 大 学 医 学 部 医学 科耳 鼻 咽 喉 科学 講 座 ( 主 任^: 古 川 伎 教 授)

室 野 重 之

1 8 7

上咽頭 癌^における Epstein‑^{Ba r r ウ イル ス (Epstein‑Ba r r vir u s,E B V) の関 与を, 病理 組 織 学 的に E B V 遺 伝 子 産物を検} 出する^こと^によ り検 討^{し た. ま た,} 癌 抑 制 遺伝 子産 物p5 3 蛋 乱 癌 遺 伝 子 産 物bcl‑^{2 蛋 白の検 出 も 試み, これ らの上咽頭 癌へ}

の関 与お よ び E B V との関 連を検 討し た^. E B V が^{コ ー} ドする核 内 小R N A ( E B V e n c oded s ma11 R N As,E B E Rs) ^{お よ び}初期 遺 伝子 B H L F ^に対 す^{るオリゴヌ クレオ チ ド プロ ー ブ を}用^いて生 体 内 局 所^ハイ プリダ イゼ ^ー シ _ョ ン(in s

.^{itu hybrid iz atio n) を行っ}

た^. ま た, 潜 伏 感 染 遺 伝 子^{に コ v ド さ れ る}潜 伏 膜 蛋 白¹ (^{1ate nt m e mbr a n e} pr oteinl, L M P l)^{, E B V} 関 連 核 抗 原² (E B V‑^{a S S O Ciated n u cle a r a nti}g^{e n}2,E B N A 2), 増 殖^サイク ル の前 初 期 遺 伝 子^{に コ ー} ド さ れ る B Z L F l 蛋 白, p5 3 蛋 白^{お よ び} bcト2 蛋 白^に対 す^{るモ ノ クロ ー ナ ル}抗 体^{を 用いて}免 疫組 織 化 学 染 色^を行った. 上咽頭 癌^{5 6}症例 中, E B E Rs 陽 性は 4 6例(8 2 %),

B H L F 陽 性は 6 例 (1 1 % ), L M P l 陽 性は1 7例(3 0 % )^, B Z L F l 蛋 白 陽 性は1 8例 (^{3 2 %}) ^であった^. E B N A 2 は全 例^で陰 性^であ^っ た. 世 界 保 健機 構^の上咽 頭 癌 病^理組 織 分顆 別には, 分化 型 非 角 化癌^でほ3 2例 中3 0例 (94 %), 未 分化 癌で ほ1 7例 中1 6例 (9 4 %) ^に おい て E B E Rs が陽 性であった が, 扁平上皮 癌⁵ 例^{お よ び}腺 病²例で は E B E Rs は陰 性^であ^{った. 上}咽頭 癌 組 織^{か ら P C R} 法 を 用い て E B V‑^{D N A を増 幅し た ところ,} 分化 型 非 角 化 癌2 4例 中2 2例 (9 2 %), 未 分 化 癌1 3例 全 例^で E B V ^‑D N A の検 出が み ら れ た が, 扁 平上皮 癌³例^{お よ び}腺 癌² 例^{か ら は}検 出^{さ れ な かった. こ}れらの結果か ら分 化 型非 角 化 癌と未 分化 癌^にお^いて E B V の密接な関 与が証明 さ れ, E B V の潜 伏 感 染遺 伝子の発 現様 式^によ る分 類では, 1 型である^こと が 示 さ れ た^. bcト2 蛋 白 陽性^は 5 0例 (^{8 9 %}) ^であ^{った が}, その発 現^{は L M P l の}発 現^に依 存し^{て い}な かった^. 潜伏 感 染か ら増殖^サイク ル ^へ のスイ ッ チ故 能を有 する B Z L F l 蛋 白は主に細 胞 質^に発 現し て お り, B H L F の発 現が わず^かに散 在 す^{るのみ で}あ^ること よ り,B Z L F l 蛋 白^の発現^が あ^っても 増 殖^{サイク ル には}移 行し^てお らず, 細 胞 質^に発 現し た B Z L F l 蛋白はスイッ チ機 能を有さ ないと考え ら れ た^. p5 3 蛋 白 陽 性ほ3 1例 (^{5 5 %}) ^であっ た が, そ^の発 現ほ B Z L F l 蛋白^の発 現^と相 関^{してお り}(p <0^.0 0 1), 両者の相互作用 が B Z L F l 蛋 白

お よ び p5 3 蛋 白^の機 能 低 下をもた ら し, 発 癌^{の 一}因^にな り う る^こと が病理組 織 学 的^に示 さ れ た^.

K ey ^{w o r}ds n as opharyⁿg^eal c arcino m a, E _pstein^‑Ba r r viru s, p5 3,bcl‑²,histopathologi ^{c al stud}y

Epstein‑^{Ba r r ウ イルス( Epstein}‑^{Ba r r vir u s},E B V ) は,1 96 4年

に E_pst_ein と共同研 究 者^であ^{る Ba r r らによ りバ ー キットリン}

パ腫 培菱 細 胞 中^に発見さ れ た^{ヘ ル ペス}ウ イ^{ル ス}科に属 する^ウイ

ル スである^{1 )}. 他^{の ヘル ペ ス}ウ イ^ルス同 様 潜 伏 感 染を特 徴と し てお り, E B V 抗体 保 有 率は 2 ^〜 3 歳^{で7 0 〜}8 0% ^に達^し, 成人 で はほぼ1 0 0% である^. ヒ ト の病因 ウ イル ス と し^て, 思 春 期^に 初 感染する と伝 染 性 単核 症^を起^こす^{こと が}知^{られて いる. こ の} よう^{に ヒ}ト^への普 遍性を持^{つ 一}方^で, E B V を 正常ヒ トB リン パ球^に試 験 管 内 面 ^りか0) ^で感 染^{さ せ る と}芽 球化^し無 限 増 殖^を 起こす^こと か ら, 造腫 瘍性とも 関 連^づけら れ て^いる^. 現 在^のと ころ^{バ ー} キット リンパ腫を は じめ とする リン パ球増 殖 性 疾 患や ある種の固形 癌^{へ の}関 与が考え ら れ て^い る. 固 形 癌^{に おいて} はt 上咽頭痛^との関 連が, 血清 抗 E B V 抗 体 価^の上昇な ど^の血 清免疫 学 的手 法²⁾, サザンプ^ロ ット法^{によ る}腫 瘍 組 織^{に お}ける E B V^‑D N A の証弓即⁾な どの分 子 生 物 学 的 方 法, 潜 伏 膜 蛋 白 (^late nt m e mbr a n e p^{r o}tein,L M P) ^{や E B V} 関 連 核 抗 原 (^{E B V}‑

a s s o ciated n u cle a r a ntige n,E B N A) な ど E B V 関連 蛋 白^に対す る免 疫プロ ッ ト法^4〉,E B V‑^{D N A に対 する生 体 内 局所ハイ プ リ ダ}

イ^{ゼ ー シ} ョ ン(i^{n s}itu hybridiz atio n,IS H ) 法^{5 )}等^によ り 明 ら かに なった^. さ ら^に, 上咽頭 癌は粘膜 下^に浸 潤し 上咽頭 原 発 巣が早 期^に発 見さ れ ること が少^ないう え^に, 組 織 学 的^に低 分化 型 扁平 上皮 癌や未 分化 痛が多く, 原 発 部位不 明^のま ま頸 部^{リン パ}節に

転 移^をきたすことも 多^い. 中 川^飢ほ, 上咽頭 癌と E B V の密 接な 関 連^を原 発 部位^{不 明}頸部リ^{ン パ}節 転 移癌^の診 断^に応 用し, 報告

した^.

j咋³ 遺 伝 子^は, D N A 腫 瘍^{ウ イルス で}あ^{るシ ミ アンウ イルス} (simia n vir u s,S V) 4 0の遺 伝子^によ り^{ト ラ}ン ス フ ォ ^ー ムさ せ た

マ ウスの癌 細胞^{でS V 4 0 ラ ー ジ T} (^{1a r}geT) 抗 原^と複 合体^を形成 する細 胞 側^の蛋 白質^の遺 伝子と して単 離さ れ た^T}. 現 在^では,

♪5 3 遺 伝 子^は癌 抑 制 遺 伝 子^{と して}認 識^{さ れてお り,} 大 腸癌⁸⁾, 胃

痛⁹⁾, 肺癌^{1 0 )}, 乳 癌^{I l )}を ほ じ め とする多く^の悪 性 腫瘍^において,

高^い頻 度で そ^の変 異が報 告さ れ て^いる^. 変 異 型j咋3 遺伝子産 物

平 成⁷ 年1 2月1 4 日受付, 平 成⁸ 年^{1 月2 4 日受 理}

A b bre viatio n s : b_p, ba s e p^air; C T L, Cy t^OtO Xi^c T l_ym pho cy t^e; E A , earl_y ah ti_gen; E B E R, E B V e n c oded

Sm all R N A ; E B N A , E B V ^‑a S S O Ciated nucle a r antig^{e n}; E B V , E p^ste血 Ba r r vir us; F I T C, flu o r^es?^ein

i_{s ot}hiocy^{a n a}te ; H I V , hu m an im m u n odefficie n cy ^vir u s ;IS H, in situ h_ybridizatio n ; L C L,1_ymphobla stoid cell

であ^る変異 型p5 3 蛋 白ほt 核 内^に蓄 積さ れ る た め免 疫 組 織 学 的

に同 定 する^こと が でき, パ ラ フ _ィ ン包嘩標 本を用^{いた レ トロ ス}

ペ ク テ _ィ ゲ な追 跡が 可能^である^. そ^{の 一} 方で, 野 生 型p5 3 蛋 白 は‑ D N A 損 傷 時^に誘 導さ れ て細 胞を G l ^で停 止^{さ せ},D N A 合 成 前^に修 復さ せ る と とも^に, 修 復できな か ^った細 胞ほ^アポト^ー

シス(^apop to sis) ^を起^{こさ せ て}除 去 す^る作^用も持^{つ1 2j.bcl}‑^{2 遺 伝} 子ほ埴 胞 性B細 胞リ^{ン パ}腫^に高 率^に認め ら れ る染 色 体 転 座^t (1 4;1 8)(q3 2; q2 1) ^の解 析^{によ っ て}発 見^{さ れ た}癌 遺 伝 子であ

る^{1 3 ).} わcト2 遺 伝 子は, ニ の染 色 体 異常^によって免 疫^{グロ ブリン}

H 銀_(IgH) 遺 伝 子と融 合し,I_gH ^{ロ ー} カスi こ存 在 する^{ェ ン ハ} ン サ ^ー によっ て活性 化さ れ癌 化^に関 与^{し ている と}考^え.^{られ てい}

る.

近 年, E B V 潜 伏 感 染^に発 現^{さ れ る}既知^の遺 伝 子 産 物^に加え,

E B V が ^{コ ー} ドする核 内^の 小 R N A (E B V e n c oded s m a11 RN ^As,E B E Rs) ^が発 見^{さ れ た. 上}咽 頭 癌^における E B V ^の関 与

に ついてI E B V 遺 伝 子 産 物に対 する プ^{ロ ー} ブ お よ びモ ノ ク

ロ ^ーナ ル抗 体を 用^いて E B V 遺 伝 子^の発 現 状 態を解 明 する^べく 本 研 究を行った^. ま た, 上 咽 頭 癌^におけ^るp5 3 蛋 白^の過 剰 発 現

の有 無^{お よ び bcl}‑^{2 蛋 白の過 剰 発 現の有無を}免 疫 組 織 学 的^に検 討し, これ ら^の上咽 頭 癌^{へ の}関 与^{に ついて}も 検 討^{L た. な お,} 本 論 文で ほ, E B V の蛋 白を ^{コ ー} ド L うる読み と り枠 (^op^{e n}

r e ading fr a m e, O R F) ^の 命 名 法 ^ほ通 例^に 従^い , 例え ば

Ba m H トZ 断 片 内^の左 向 き^の1番目^の O R F は B Z L F l と表^し ている.

材料お よび 方 法

Ⅰ^. 使 用材 料

昭 和5 0年か ら平 成7 年^の間^に金沢 大学 附 属 病 院 耳 鼻 咽 喉 科^に おいて, お よ び昭 和^{6 2}年^{か ら}平 成⁶ 年^の間に国 立 金 沢 病 院 耳 鼻 咽喉 科^において治 療し た 上咽 頭 癌症 例^の上咽 頭^{お よ び}頸 部^リン

パ節^の生 検 も^{し く は}摘 出組 織^{で ∴}組 織学 的^に腫 瘍 細 胞^の認め ら れ るものを 用^いた^, 上咽 頭 組 織^の検 索し え たも^{のは5 6}例^で, 男 性^{が 4 2}例, 女性が1 4例であった^. 年 齢は1 6歳か ら8 5歳で その平 均は 5 2^.4歳^であった. 頸 部^リンパ節 組 織^の検索^{し え た}ものは1 8

F ig^･1^･ T he M ic r oPr obe^{T M} syst_{e m} ･ T he ap pa r atu s c o n sists

｡f a slide stain e r u nit(A)^{, V a riab le te m pe r atu r e in c ubato r}

例^で, う ち1 6例は 上咽 頭 原 発 巣 も 検 索し え た^. 組 織ほいずれも 1 0% ^{ホ ルマ リン}溶 液^で固定^し, パ ラフ ィ ン に て包^{哩 し た}も^のを 用^いた^. 病理組 織 像は世 界保 健 故 構 (W o rld He alth Orga niz aト io n, W H O ) の上 咽頭 癌 分 煩^{1 現 にて}行^い , 臨 床 病 期 分 類^ほ U I C C の T N M 分 輯^{1 5 一に}従った^. 臨 床 背 景 因 子を検 討 する際,

臨 床 病 期^のT 因子 を腫瘍が 上咽頭 内^に と ど ま る か 否 か^によ り T l と T 2 お よ び T 3 と T 4 ^にわけ^これ を T 因 子^A 分 類と し た^{. 一} 方, 腫 瘍^の頭 蓋 底 浸 潤が予 後不良 因 子^{の 一 つ}である^{1 6 )}こ と か ら, 頭 蓋 庶 浸 潤^{のない T l} と T 2 と T 3 お よ び頭 蓋底 浸潤

のある T 4 にわけこれ を T 因 子 B 分塀と し た^.

Ⅱ. 病 理 組 織 学 的 検 討

1 ^{. マ}イ^クロプロ ^ー ブシ ステム の使用

I S H , 免 疫 組 織 化 学 染 色ともPa rk ら^{1 7 一}, Re ed ら^{1 8)} お よ び

Ie z z o ni ら^{I g ‑ の}方 法 ^に 準じ^{て マ} イ ク ^ロ プ ^{ロ ー} ブ シ ス テ ム

( M ic r oPr obe^{T M}sys t e m) (F ishe r Scie ntific,P it tsbu rgh, U S A) を 用^{い て}行^った( 図¹)^{. ス ライ ド グラ スと し て プロ ー ブオン プラ}

ス (Pr obeOn P lu s

T M) (^{F ishe r Scie ntific}) を用^い∴組 織 面を向か い合^{わ せ る よ}う^にし て対^にする^こと^によ り 1 5 0/^上m の間隙を形 成し, 毛細 管 現 象を利用 し^て同部^において後 述 す^る条 件^によっ て反 応を進め た (図2 )^{. パ ラフ} ィ ン包埋組 織か ら紬m 厚^の切 片を作 成^{し た.}

2 ^. 生 体 内 局 所^ハ イ プ リ ダ イ^{ゼ ー シ}ョ ン

キシ レ ン(和 光 純 薬, 大 阪) と^{へ モ}デ(He m o De) ( 藤 沢 薬 品,

大 阪)を 1 ^: 3 に混 合し た溶 液に1 0 0ヒ2分, 4 回反 応さ せ て脱

パラフ ィ ンを行った後^{1 0 0}% ^{エタ ノ ー} ルにて 6 回洗 浄し た^. つ い で ^ペプシ ン (^{B io m eda,Fo ste r C i}t y,U S A) ^{に て1 00 ℃ 2} 分³⁰秒 反 応さ せ た^. プ^{ロ ー} ブにはフ ル オ レス セイン イ ソ チオシ ア ネ ^{ー ト}(flu o r e s c ein is o thio cya n ate, FI T C ) 標 識 E B V ( E B E R) オ リ ゴヌ クレオチ ド( D A K O^,G lo str up^,De n m a rk ) を 2 5倍^に希 釈

し て, ま た F I T C 標 識 ^{E B V} ( B H L F ) ^{オ リ ゴ} ヌ ク レオチ ド ( D A K O) を2 5倍に希 釈して使用 し, 1 0 0 ℃^で4分,8 0 ℃^で6分,

6 5 ℃ で1 2分^ハイ プ リ ダ イ^{ゼ ー} シ ョ ソを行^った^. ア ルカ リ フォ ス フ_ァ タ⊥_ゼ標 識 抗^{F I T C} 抗 休 (^{5 0}倍 希 軋 D A K O ) を4 5 ℃ で1 0分 反 応さ せ た後, 発 色 基 質と して ナフ ト ^ー ル A S‑^{M X リ ン酸} (^{n a}pht oI A S M X pho sphate) とフ ァ ^ー ス トレ ッ ド T R 色 素 (fa st r ed T R s aIt) を 1 ^: 1 で混 合し た N A S F R T R ( Re s e a r ch

(B) a nd a slide holde r(C)^{･ A slide stain e r u nit c o ntain s F ig･2･ Capilla ry‑a Ctio n･ T w o Pr obeOnT M gla s s slide sfo r m a}

e n o ugh v olu m e (1 0 0 ml) ^{r e a}g^{e n}t w e11s (^ト8)^{･ a n abs o rbe nt 1 5 0 pm ‑Wide c apilla ry cha n n el･ Ca}pilla ry^‑a Ctio n cha n n els p^ad (9) a nd s ma11 v olu m e(^{1 5 0} F^Ll)^{r e a}ge ntis olato r s(1 0^‑1 2)^{･ a r efiu}ed wi th the ap pr opriate r e age nts^･

1in e ; L M P,1ate nt m e mbra n e p^rotein; L S A B,1abeled strep t^{a v}idin bioti_{n ;} O H L, O r al h airy leukoplaki^a; O R F･

op^{e n re a}d in_g fra m e; S V , Simia n vi_{r u s ;} V C A , Vir al cap^sid a nti_ge n ; W H O, W o rld H e alth O^rg^{a n}iz atio n