博 士 （ 医 学 ） 村 上 慶 洋 学 位 論 文 題 名
Association of NY‑ESO‑1 expression with T cell
infiltration in the tumor microenvironment of esophageal squamous cell carcinoma and survival
（食道扁平上皮癌の腫瘍局所環境におけるNY‑ESO ・1 の発現とT 細胞浸潤および 生存率との関連）
学位論文内容の要旨
【 背景と 日的 】 食道 癌は 未だに 予後 不良の 疾患 である 。こ のため 、癌 ワクチン療法はそ の 補助療 法の 有カな 候補 として 期待されている。癌精巣抗原は、成人の正常組織では精巣以 外 での発 現は 認めら れず 、その 組織特異的な発現から、癌ワクチン療法のターゲットとして 特 に 注 目 さ れて い る 。 癌精 巣抗 原のー っで あるNY‑ESO‑1は食 道癌 より発 見さ れ、多 くの 癌 種 で の 発 現が 報 告 さ れて いる が、NY‑ESO‑1陽性 の癌 患者は 陰性 の患者 に比 ペ予後 が良 好 である こと が報告 され ている 。
近 年 、NY‑ESO‑1に 対 す る癌 ワク チン療 法の 臨床試 験が 進行癌 に対 して行 われ 、特異 的な 免 疫応答 が誘 導され るこ とが確 認されているが、残念ながら期待されるような腫瘍縮小効果 を 認 め て い ない も の が 多 い 。 我々 は 、 食 道 扁平 上皮癌 患者 におい て、CD4+およ びCD8+T 細 胞(TILs)の 浸潤 を認め た患 者は予 後が 良好で ある 事を報 告し ている 。本研究でまず、食 道 扁 平 上 皮 癌細 胞 株 お よび 手術 検体を 用い てNY‑ESO‑1の発現 評価 の標準 化に ついて 検討 し た 。 ま た 、NY‑ESO‑1の発 現と 臨床因 子お よび組 織病 理学的 因子 との相 関を 評価し た。
こ の 中 で 特 に 、CD4+あ る い はCD8+T浸 潤 とNY‑ESO‑1発 現 の 相 関 と予 後 と の 関 連 に つ いて検 討し た。
【 材 料 と 方 法】 ヒ 卜 食 道扁 平 上 皮 癌 細 胞 株はTE2，TE5，TE8，TE10，TE13，HEC46， SGF7を 用 い た 。 マ ウ スは4‑6週 齢 の ヌ ー ド マウ ス(CB17)を 用 い た。 食道癌 細胞 株TE8、 HEC46の 細胞株 をヌ ードマ ウス の皮下 に移 植し、 腫瘍 を生着 させ 、この 腫瘍 を用い た。 切 除 組 織 の 標 本は 実 際 の 手術 での 切除標 本か ら10mm大 の切片 を．800Cで凍 結保 存し、 その 中 か ら5mm角 の切 片 をHE染 色 によ る 食 道 扁 平 上 皮癌 の 診 断 に 、 約100 mm3 (100 mg)の 切 片 をRNAの 抽 出 に 用 い 、 生 検 検 体 相 当 標 本 に つ い て はImm3（1mg)の 切片 をRNAの 抽 出に用 いた 。
NY‑ESO・1の 発 現 を 評 価 する た め のRT‑PCRは 食 道扁 平 上 皮 癌 細 胞株8種と手 術切 除検体 42例 か ら 抽 出 し たRNAを 用 い て 行 い 、 陽 性 対 照 に は ヒ 卜 精 巣細 胞 のcDNAを 用 い た 。 Real‑time PCRも同 様の検 体に て行っ た。 手術検 体に おける 免疫 染色と 臨床 病理学 的因 子 の 検 討 に は 、 食 道 切 除 術 が 施 行 さ れ た122例 の 検 体 を 用 い た 。 免 疫 染 色 は streptavidin‑biotin‑peroxidase法にて行った。腫瘍細胞の細胞質が1％以上染色されている も のをNY‑ESO‑1発現 症例 と診断 した 。
統 計 学 的 有 意差 の 検 討 ではX2テス ト、Fisher′8 exactテス ト、Mann‑WhitneyUテスト 、 生 存 率 の 分 析で はKaplan‑Meier法 、log‑rankテス ト、単 変量 解析、 多変 量解析 にはCox 比 例ハザ ード モデル を用 いpく0.05を有 意差あ りと した。
【 結 果1 （1)RT‑PCRに お い て は8種 類 の 食 道 扁 平 上 皮癌 細 胞 株 の う ちHEC46に の み NY‑ESO‑1の 発現 が 認 め ら れ 、TE8を含 む 他 の 細 胞 株 ではNY‑ESO‑1の 発 現 は認 め ら れ な か っ た 。(2)食 道 扁 平 上 皮 癌 切 除 標 本 に お け るRT‑PCRで は42例 中10例 にNY‑ESO‑1の 発 現 が 認 め られ た 。10例のNY‑ESO‑1発 現検体 いず れにお いて も、生 検検 体相当 の検 体か ら はNY‑ESO‑1の 発 現 は 認 め ら れな か っ た 。(3)Real‑time‑PCRに おいて も、RT‑PCRに お い てNY‑ESO‑1の 発 現 が 認 め ら れた 検 体 以 外 か ら は 発現 が 認 め ら れなか った 。(4)TE8、 HEC46腫 瘍移 植 マ ウ ス 切 片 に おい て 、NY‑ESO‑1の免 疫染色 では 、核染 色は 両者に 認め ら れ た が、細 胞質 の染色 は陽 性対照 であ るHEC46移 植マ ウス切 片の みに認 めら れたた め、 以 後 、 免 疫 染 色に お け る 陽 性 対 照と し てHEC46の 移植 切片を 用い た。(5)手術検 体122例に お け る 免 疫 染色 で は22例（18％）に おい て癌細 胞の 細胞質 の染 色を認 めた 。NY‑ES0‑1発 現 症 例の約 半数 では腫 瘍細 胞の染 色陽 性率は10％以 下で あった 。(6)臨 床病 理学的 因子 と
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NY‑ESO‑1の 発 現 の 関 連 性 の 統 計学 的 検討 では 年 齢とNY‑ESO‑1の発 現と の 間に 有 意な 相 関 を 認 め たが 、他 の 項目 で は有 意 な相 関を 認 めな か った 。(7)CD4+T細 胞、CD8+T細胞 、 及 びNK細 胞 浸 潤 とNY‑ESO‑1の 発 現 と の 関 連 性 の 検 討 で は 、NK細 胞 浸 潤 との 関 連性 は 認 め ら れ なか った(p=0.9947)。 一 方、CD 4i̲r1'細胞 浸 潤(p=0.0889)、CD8゛T細 胞浸 潤 (p=0.0641)そ れ ぞ れ 単 独 因 子 とNY‑ESO‑1の発 現 との 相 関を 解 析し たと こ ろ、NY‑Eso‑i 陽性症 例では浸潤細胞 数が増加する 傾向は認めら れたが、有意 な相関を認めな かった。しか し な が ら 、CD4+T細 胞 、CD8+T細胞 両 者と も浸 潤 陽性 の グル ー プで は、 他 のグ ル ープ と 比 較し てNY‑ESO‑1の発現 との間に有意 な相関を認め た(p=0.0029)。(8)生存率の 検討では、
NY‑ESO‑1陽性 の 症例 は陰 性 の症 例 に比 ぺ 予後 良好 な 傾向 を認め た(p=0．0858)。Stagem又 はIVの 症 例に つ いて 層別 解 析す る とNY‑ESO‑1陽性 の 症例 は 陰性 の 症例 に 比べ 有意に予後 良 好 で あ っ た(p=0.0107)。 単 変 量 解 析 に お い て はNY‑ESO‑1の 発 現(p=0.0212)とCD4/8 陽 性T細 胞 浸潤(p=0.0028)が 予 後予 測 因子 とし て 抽出 さ れ、 多 変量 解析 で はNY‑ESo‑iの 発 現(p=0.0058)とCD4/8陽 性T細胞 浸 潤(p=0.0399)がStageIII又はIVの 食 道扁 平 上皮 癌 患者の 独立予後規定因 子として抽出 された。
【 考察 】 NY‑ESO‑lを発 現 して い る腫 瘍 に対 する 癌 ワク チ ン療 法 の臨 床 試験 を行うには 適応患 者を選択するた めの診断法の 標準化が必要 である。切除 不能な食道癌患 者で適応患者 を 選択 す るに は 生検 検体 か らNY‑ESO‑1の 発現 を確 認 する こ とが 有 用で あ ると 考えられる が 、今 回 の結 果 からは生 検検体での正 確な診断は困 難であると考 えられた。実際 に、HEC46 細 胞 株 移 植 腫 瘍 の 生 検 検 体 相 当の 検 体か らもRT‑PCRに おい て はNY‑ESO‑1の発 現 が確 認 で きな か った 。 移植切片 の腫瘍ではヒ トの腫瘍組織 と異なり、め ったにheterogeneityを有 し てい な い為 、 生検 検体 か らのNY‑Eso‑iの発 現の 診 断が 困 難で あ り、 正 確な 診断には十 分 な腫 瘍 組織 が 必要 であ る と考 え られ た 。RT‑PCRと 免疫 染 色の 結 果の 乖 離に ついては報 告がな されており、発 現の不均一性 が原因ではな いかとの推測 がなされている 。今回の結果 は この 乖 離の 原 因の ーっ がNY‑ES0‑1発 現 細胞 の不 均 一性 で ある こ とを 強 く示 すものであ る 。 最 後 に我 々は 以 前にCD4+あ る いはCD8+T細 胞 浸潤 の 意義 を 明ら かに し た食 道 癌症 例 を 用い て 、NY‑ESO‑1の発 現 と宿 主 の癌 に 対す る免 疫 応答 を 免疫 染 色を 用 いて 評価した。
NY‑ESO‑1陽 性 症 例 で も 、 約 半 数は 陽 性細 胞の 比 率は 数 ％で あ った が、 多 くのNY‑Eso‑i 陽性症 例が陽性細胞数の割合に関わらず、CD4／8（十／十）群に属していた。この事はNY‑ES0‑1 発現症 例では陽性細胞 数が少ない場 合でも免疫反 応に認識され ている可能性を 示しており、
さ らに 、 この 事 が患 者の 予 後を 改 善し て いる 可能 性 があ る 。一 方 で、NY‑ESO‑1以外の癌 抗原と 免疫細胞との問 の免疫応答に ついても考慮 する必要があ る。我々は以前 に食道癌患者 のうちCD4′8（十／十）群が有意に予後が良好であることを報告した。したがって、免疫反応が 予後を 改善する重要な 因子であると 考えられる。 その上、進行 食道癌での長期 生存患者は全 てCD4/8（十′十）群 に属しており 、そうでない患者群は他の群に属していた事は非常に重要で ある。 今回の検討では 、生存曲線は 早期癌患者に 比ベ進行癌患 者に於いての方 が免疫反応が 認めら れている点が重 要である。ま た、興味深いことにCD4′8（十/十）群とその他の群では癌 の進行 度には差を認め なかったこと である。ここ で注目すべき は、StageIII、IVの進行癌で あ って も 腫瘍 を 切除 した 患 者に 於 いて は抗腫瘍免疫 が患者の予後 を改善する可 能性がある 事であ る。
【 結 鎗 】NY‑ESO‑lの 発 現 を 免 疫染 色 にて 評価 す る場 合 には 、 適切 な陽 性 対照 お よび 陰 性対照 を用いるべきで あり、今回我 々は標準的な 評価系を確立 した。食道扁平 上皮癌患者に 於 いて は 、NY‑ESO*1は宿 主 に癌 抗 原と し て認 識さ れ てい る と考 え られ 、 最も 効果的な抗 腫 瘍免 疫 反応 は 腫瘍 切除 後 に認 め られ る可能性があ る。したがっ て、癌ワクチ ン療法は、
NY‑ESO‑1発現 陽 性患 者の 術 後補 助 療法 と して 行わ れ るべ き であ り 、予 後 を有 意に改善す る可能 性があると考え る。
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学位論文審査の要旨 主査 副査
副査
教授 教授 教授
平野 秋田 瀬谷
学 位 論 文 題 名
聡 弘俊 司
Association of NY‑ESO‑1 expresslonWithTCe11 I
in 丘 ltrationinthetumormlCroenVironmentofeSOphageal SquamouSCe11CarCinomaandSurViVa1
（ 食 道扁 平 上皮 癌 の 腫瘍 局所 環境におけ る NY ・ ES0 ・ 1 の 発現とT 細 胞浸潤お よぴ 生 存 率と の 関連 ）
食 道 癌 は 未 だ に予 後 不良 の疾 患 であ り、 癌 ワク チン 療 法は その 補 助療 法の 有 カな 候補 と し て 期 待 さ れ て いる 。 本研 究で は 食道 扁平 上 皮癌 より 発 見さ れた 癌 精巣 抗原 の ーつ であ る NY‑ESO‑1に つ い て 発 現 診 断 の 標 準 化 を 行 う 事 と 、 癌 ワ ク チ ン療 法 への 可能 性 を評 価す る 事 を目的とした。
食 道 扁 平 上 皮 癌 細 胞 株 、 切 除 検 体 の 凍 結 標 本 、NY‑ESO‑1陽性 細 胞株 移植 マ ウス から 得 ら れ たRNAを 用 い たRT． PCRの 結 果 、 及 び 移 植 マ ウ ス 、 切 除 検 体122例 の 免 疫 染 色 の 結 果 を 比 較 し 、RTPCTと 免 疫 染 色 で の 発 現 診 断 の 整 合 性 が 確 認 さ れ た 。 ま た 、NY‑ESO‑1 陽 性 患 者 の 検 体 に お け る 生 検 相 当 の 検 体 に お い て は 、RTPCRでNY‑ESO‑1の 発 現 が 確 認 で き な か っ た こ とか ら 、生 検で の 発現 診断 は 困難 であ る 可能 性が 示 唆さ れた 。 免疫 染色 で の 陽 性 対 照 に はHEC46細 胞 株 移 植 マ ウ ス の 切 片 が 陽 性 対 照 と し て 適 し て い る 事 が 示 さ れ た 。
次 に 、 手 術 切 除 検 体122例 のNY‑ESO‑1の 免 疫 染 色 の 結 果 、 及 び 臨 床 病 理 学 的 因 子 と の 関 連 性 の 検 討 を 行 っ た 。CD4+T細 胞 、CD8・ トr細 胞 、NK細 胞 そ れ ぞ れ の 浸 潤 とNYESO．1 の 発 現 と の 関 連 性 の 検 討 で は 、NK細 胞 浸潤 との 関 連性 は認 め られ ず、CD4叩 細 胞、CD8゛T 細 胞 浸 潤 そ れ ぞ れ の 因 子 とNVESO．1の 発 現 と の 間 に は 有 意 な 相 関 を 認 め な か っ た が 、 CD4゛T細 胞 、CD8゛T細 胞 の 両 者 が 浸 潤 陽 性 の グ ル ー プ で は 、 他 の グ ル ー プ と 比 較 し て NYESO‐1の発 現 との 間に 有 意な 相関 を 認め た（p〓0．0029） 。また、NyESO．1の発現と他の 臨 床 病 理 学 的 因 子と の 間に は年 齢 以外 に有 意 な相 関を 認 めな かっ た が、 発現 陽 性患 者で は 陰 性 患者 に比 べ5年 生 存率 にお い て予 後良 好 な傾 向を 認 めた （p O．0858）。さらに、Stage m・Wの 進 行 癌 患 者 の み の 検 討 で はNVESO．1陽 性 患 者 が 陰 性 患 者 に 比 べ 、 有 意 に 予 後 が 良 好 であ った （p〓0．0107）。NVESO．1の 発現を含めた臨床 病理学的因子と生 存に関する検討 を 行 う と 、 単 変 量 解 析 に お い て はN謦ESO 1の発 現（p＝0．0212） とCD4/8陽 性T細 胞浸 潤 くp＝0．0028）が予 後予測因子として 抽出され、多変量解 析ではNVESO・1の発現（p〓0．0058） とCD4/8陽 性T細 胞浸 潤（p〓O．0399） が独 立し た 予後 良好 の 因子として抽出 された。本研究 で はNVESO‐1の 発 現 診 断 の 標 準 化 が な さ れ る と 共 に 、 生 検 検体 で の診 断の 問 題点 が示 さ
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れ た 。 ま た 、NY‑ESO‑1は 宿 主 の 免 疫 機 構 か ら 認 識 さ れ て い る 事 が 示 唆 され 、こ れ をタ ー ゲ ッ ト と し た 免 疫 療 法は 、 手術 にて 病 巣が 切除 さ れた 患者 の 術後 補助 療 法と して 行 われ る 事 で効 果が 得 られ るで あ ろう こと が 示唆 され た 。
口 頭 発 表 に 続 き 副 査 瀬 谷 司 教 授 よ り 癌 精 巣 抗 原 の 局 在 に 関 連 し た 本 来の 機能 に 関す る 質 問 とNY ESO‑1蛋 白 を 用 い た 癌 ワ ク チ ン 療 法 がCD4陽 性T細 胞 、CD8+陽 性T細 胞 両 者 を 強 カ に 誘 導 す る は ずで あ るが 、臨 床 効果 とし て 満足 な結 果 が得 られ な い理 由に っ いて の 質 問 が あ っ た 。 続 い て 副 査 秋 田 弘 俊 教 授 よ り 、NY ESO‑1の 発 現 が 生 検 相当 の検 体 で確 認 で き な い 事 実 に お け るheterogeneityの 関 与 に つ いて 、NY‑ESO‑1の免 疫 染色 での 発 現頻 度 が 低 い が 、 免 疫 染 色 の 感 度 の 影 響 に つ い て 、 免 疫 染 色 で のNY‑ESO‑1陽 性 のcutoぱ 値 を NY ESO‑1陽 性 細 胞 数1％ に 設 定 し た 理 由 に つ い て の 質 問 が あ っ た 。 最 後 に 主 査 平 野 聡 教 授 よ りNY‑ESO‑1の 食 道 扁 平 上 皮 癌 に お け る 他 の 報 告 で の 陽 性 率 に つ い て、 生検 相 当検 体 と し て 設 定 し たImm角 の 検 体 の 、 実 臨 床 に お け る 生 検 検 体 と し て の 妥 当 性 に っ い て 、 NY‑ESO‑1が 発 現 し て い て も 腫 瘍 の 増 大 は 抑 制 さ れ な い と い う 考 察 と 研 究結 果の 整 合性 に つ い て 、 実 臨 床 でNY‑ESO‑1を 用 い た 治 療 を 行 う 場 合 の 対 象 患 者 の 選 択 につ いて の 質問 が あ った 。
腫 瘍 免 疫 や 癌 精 巣 抗原 に つい ての い くっ かの 基 礎的 な質 問 に対 する 回 答で は、 申 請者 の 理 解 お よ び 知 識 が 不 十分 と 思わ れる 部 分を 認め た が、 今回 の 研究 の方 法 論、 結果 と その 考 察 に つ い て の 質 問 に 対し て は、 文献 的 考察 を混 じ えて ほば 適 切に 回答 が 行わ れた 。 今回 の 研 究 は 食 道 扁 平 上 皮 癌 に お け るNY‑ESO‑1の 、 今 後 の 臨 床 応 用 の 可 能 性 を基 礎的 デ ータ と と も に 実 際 の 臨 床 デ ータ を 併せ て検 討 した もの で あり 、申 請 者は 当該 領 域に 関す る 深い 見 識 と研 究遂 行 能カ を有 す るこ とを 示 すも ので あ る。 審査 員 一同 はこ れらを総合 的に評価し、
大 学院 課程 に おけ る研 鑽 や取得単位なども併 せ、申請者が博士 （医学）の学位を 受けるのに充 分 な資 格を 有 する と判 定 した 。
質 疑 応 答 の 時 間 は 約15分 で あ っ た 。 な お 、 出 席 者 は お よ そ30名 で あ っ た 。
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