博 士 （ 理 学 ） 佐 原 健 彦 学位 論文題 名
Studies on Structure and Function of the Bacterial Monomeric Isocitrate Dehydrogenase and Regulatory Mechanisms of the Gene Expression
（細菌由来の単量体型イソクエン酸脱水素酵素の構造と 機 能 及 び 遺 伝 子 発 現 に 関 す る 研 究 ）
学 位 論 文 内 容 の要 旨
イ ソク エン 酸 脱水 素酵 素
(IDH)は、 生物 の 代謝 にお いて重要な役 割を果たすクエン 酸回路 を 構 成す る酵素群のー つであり、イソク エン酸からa ―ケトグルタル 酸への反応を触媒 する。
こ の 酵素 は、 細 菌界 にお い てニ 量体 型 と単 量体 型 の二種 類に分類できる。好 冷菌Colwellia
mans（従 来Th‑brio sp. strain ABE‑1 とし て記 載 ）には 、二量体、単量体型
IDHアイ ソザイ ム が 存た し、 単 量体 型IDH aDH‑ID は 低 温適 応型 酵 素と して の 特徴 を示 し 、細菌の低 温適応 に 重 要な 役割 を 果た して い るこ とが 示 唆さ れて い る。 さら に 、IDH‑II を コードする 遺伝子
icdUの発 現は 低 温で 誘導 さ れる ことが以前に示さ れた。本研究では 、第一章にicdU の 低温誘 導 発 現に かか わ る調 節因 子 とIDH‑II の 生理 的役 割 につい ての研究を、第二章 に単量体型IDH の 高次構造の解明を 目的とした研究結 果を記述した。
icdU
の 非翻 訳 上流 領域 の デリ ーシ ョ ン実 験に よ って 、転 写 開始 点か ら
‑560〜‑526 に存在 す る 塩基 配列 を 除く と、 低 温(15 ℃）で の遺伝子発現量は 約20 倍に増加した。 また、‑38 の位 置 に 存在 するCCAA'I ￣ 配列を除くと、icdLI 遺伝子 の低温誘導性は完 全に消失した。し かし、
中 温
(37℃ ）で のicdU 発現 量は こ のよ うな デ リー ショ ンの影響を全 く受けず、常に低 レベル に 保 たれ ていた。以上 の結果により、iccUI の発現 は、低温誘導性プ ロモーターに支配 され、
こ の ニっ の異なるシス 因子が関与してい ると結論した。こ の結論は、ic む7 プロモータ ーと本 来 低 温 誘 導 性 で は な い 二 量 体 型IDH （IDH ．D 遺 伝子 血む
ORFと の 融合 遺伝 子 を用 いた 実 験 に よって裏づけされ た。II 冫H ‐II の生理学的機能を調べるため、血Z びあるいはあむを含む様々 な 遺 伝子 を大 腸 菌に 導入 し 、低 温での生育速度を 比較した結果、IDH ．u の発現レベル に比例 し て生育速度が促進 された。好冷菌由 来の単一酵素遺伝子 の導入によって、 低温域での生育速 度 を促進させた例は 、本研究が初めて である。
IDH
の 高次 構造 は 、大 腸菌 由 来の 二量 体 型mH にお い て構 造が 決 定さ れ、 触 媒反 応に 関 与 す る アミ ノ酸残基に至 るまで詳細に明ら かにされている。 しかしながら、mH ‐
nが属す る単量 体 型
IDHの高 次構造は現在のと ころ全く分かってお らず、また、両ア イソザイムのアミ ノ酸配 列 には相同性が無い ことから、両タイ プの酵素の構造と機 能及び分子進化を 考える上で、単量 体 型IDH の 高次構造の解明は重 要な課題である。 そのため、構造解析の最初のステップとして、
IDH
．
nと 比 べ て 比 較 的 熱 安 定 性の 高い
A勿め ぬ
c卿 洫 出瓜 ば由 来 の酵 素を 材 料に 用い 、 本 酵 素 の 精 製 、 遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ 、 及 び 塩 基 配 列 の 決 定 を 行 っ た 。
A． 凾 出 ユ
ddII）
H精 製 標 品 は、 他の 単 量体 型IDH 同様 、 分子 量約
80kDaで あり 、典 型 的 な 中 温性 酵素 の 熱安 定性 を 示し た。また、本酵素 遺伝子は、2223bp のオープンリーデ ィング フ レームを持ち、741 アミノ酸 残基をコードしていた。得られたアミノ酸配列のN ．末端配列は、
精 製 酵 素標 品 より 決定 さ れた もの と 一致 して お り、 本遺 伝 子が 、A 洫 出n 捌
IDH遺 伝子 （ 鬮
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で あ る こ と を 強 く 示 唆 す る 結 果 と な っ た 。 さ ら に 、IDH欠 損 株 で あ る 大 腸 菌DEK2004株 に 本 遺 伝 子 を 導 入 し た と こ ろ 、IDH欠 損 株 が 表 現 型 と し て 示 す グ ル タ ミ ン 酸 要 求 性 を 消 失 さ せ る こ と が で き 、IDH活 性 も 検 出 で き た こ と か ら 、 本 遺 伝 子 が 大 腸 菌 内 で 発 現 し 、 か つ 生 理 的 な 機 能 を 持 つ こ と が 明 ら か に な っ た 。 同 時 に 、 本 遺 伝 子 の 発 現 機 構 を 解 明 す る た め 、mRNA及 び 蛋 白 質 レ ベ ル で の 解 析 を 行 っ た 。A． vb出 コcば のtotmRNAを 用 い た プ ラ イ マ ー エ ク ス テ ン シ ョ ン 分 析 に お い て 、 二 種 類 の 大 き さ の 異 な る 転 写 産 物 に 相 当 す る シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た 。 一 っ は 、 翻 訳 開 始 点 か ら244bp上 流 に 位 置 し て お り （TS．1） 、 本 転 写 産 物 に 対 す る プ ロ モ ー タ ー が そ の 上 流 に 存 在 し て い た 。 も う ー っ は 、 翻 訳 開 始 点 か ら101bp上 流 に 位 置 し て い た が （TS．2） 、 こ の 転 写 産 物 に 対 す る プ ロ モ ー タ ー は 確 認 で き な か っ た 。 さ ら に 、 大 腸 菌DEK2004株 を ホ ス ト と し て 、 本 遺 伝 子 の5 ・ 非 翻 訳 領 域 の デ リ ー シ ョ ン 分 析 を行 った と ころ 、 両転 写 産物 はTS．1に 対 す る プ 口 モ ー タ ー に よ っ て 発 現 して いる こ とが 明 らか に なっ た。 こ の5 ・ 非 翻訳 領 域に 対し て デ ー タ ベ ー ス 検 索 を 行 っ た と こ ろ 、TS．2転 写 産 物 の5 ‐ 末 端 がRNaseEの 認 識 及 び 切 断 部 位 に 相 当 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。 こ れ ら の こ と か ら 、 本 遺 伝 子 の 転 写 開 始 点は 、TS．1で あり 、 TS．2転 写 産 物 はRNaseEに よ っ て 部 位 特 異 的 な 切 断 を 受 け た も の で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に 興 味 深 い こ と に 、 両 転 写 産 物 の 量 比 は 形 質 転 換 体 大 腸 菌 株 を 生 育 さ せ る 培 地 に よ っ て 変 化 し た 。 こ の こ と か ら 、 本 遺 伝 子 の 発 現 は 、RNaseEに よ るmRNA転 写 後 の 修 飾 に よ っ て 、 主 に 制 御 さ れ て い る こ と が 考 え ら れ た 。
本 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 の 決 定 に よ っ て 得 ら れ た ア ミ ノ 酸 配 列 を 、 低 温 適 応 型 酵 素 で あ るmH．H と 比 較 し た と こ ろ 、 そ の 温 度 安 定 性 な ど の 温 度 特 性 が 大 き く 異 な る に も 拘 ら ず 、 約66％ の 高 い 同 ー 性 を 示 し 、 さ ら に 相 同 性 は 両 酵 素 の ア ミ ノ 酸 配 列 全 域 に わ た っ て 存 在 し て い た 。 こ れ ら 両 IDHの 温 度 特 性 が 蛋 白 質 の ど の 領 域 に 支 配 さ れ て い る の か 特 定 す る た め 、 両 酵 素 遺 伝 子 を 部 分 的 に 融 合 さ せ た 遺 伝 子 を 構 築 し 、 発 現 さ せ た キ メ ラ 酵 素 を 用 い て 、 そ れ ぞ れ の 温 度 特 性 を 詳 細 に 調 ぺ た 。 そ の 結 果 、C・ 末 端 か ら185ア ミ ノ 酸 残 基 を 含 む 領 域 が 主 に 両II）Hの 熱 安 定 性 に 大 き く 関 与 し て い る 結 果 が 得 ら れ た 。 低 温 適 応 型 酵 素 と 中 温 性 酵 素 の 一 部 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 置 換 す る こ と で 熱 安 定 性 を 変 化 さ せ た 例 は 現 在 の と こ ろ 本 研 究 が 最 初 で あ り 、 酵 素 蛋 白 質 の 低 温 適 応 を 考 え る 上 で 興 味 深 い 結 果 が 得 ら れ た 。
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