ヒト骨髄間質細胞に関する研究　第1編 ヒト骨髄間質細胞の増殖動態並びに造血支持能に及ぼす抗白血病剤の影響

岡 山 医 誌 (1994) 106, 261∼273

ヒ ト骨髄 間質細 胞 に関す る研 究

Key words: Human bone marrow stromal cells, Long-term bone marrow culture, •@ Chemotherapy 緒 言 生体 の造 血 系 は,造 血幹 細 胞 とそれ を支 持 す る いわ ゆ る「造 血微 小 環 境 」1,2)によって構 成 され る.ヒ ト 「造 血微 小 環境 」 の 主体 は骨 髄 間質 細 胞 で あ るが,血 液 細 胞 との 直接 接触3-7),造 血 因 子8-10),細胞外 基 質11,12)の産 生 な どによ り血 液 細 胞 の維 持 と分 化.増 殖 に対 す る支 持 能 を発 揮 し て い る と考 え られ て い る13-15).この 骨髄 間質 細 胞 は,造 血器 腫 瘍 の化 学 療 法 にお いて は も とよ り骨 髄 移植 の前 処 置 に際 し,血 液 細 胞 と同様, 抗 白血 病剤 の影 響 を受 け る もの と思 わ れ,そ の 検 討 は継 続 して施行 され る化 学 療 法 の あ り方 と 臨床 病 態 の把 握 に対 し重 要 な情 報 を提 供 す る も の と考 え られ る.な か で も,骨 髄 間質 細 胞 に 及 ぼす 抗 白血 病 剤 の影 響 に つ い ては マ ウ ス を用 い た検 討 が一 部 報告 され て い るが16-20),ヒ ト骨髄 間質 細 胞 に対 す る抗 白血病 剤 の 影響 につ いて の 体 系 的 な検 討 は 少 ない21,22).今回著 者 は以上 の観 点 に た ち,ヒ ト骨 髄 間質 細 胞 の 増殖 動 態 と造 血 支持 能 に及 ぼす 各種 抗 白血 病 剤 の影 響 を長期 液 体 培養 系 を用 い検 討 す る こ とに よっ て,「宿 主-腫 瘍-薬 剤」 の 相 関 に立 脚 した至 適 化 学療 法 設 定 へ の 一助 とせ ん と した. 材 料 と 方 法 1.材 料 1)骨 髄 血 使 用 し た 骨 髄 血 は,イ ン フ ォ ー ム ド ・コ ン セ ン トを 得 た 後,ボ ラ ン テ ィ ア の 健 康 人(24-33 歳)の 胸 骨 も し くは 腸 骨 よ り穿 刺 吸 引 法 に て,   Heparin加 で 無 菌 的 に 採 取 し た. 2)抗 白血 病 剤 並 び に 濃 度 設 定 Daunorubicin(DNR), Doxorubicin(DXR), Mitoxantron(MIT), Aclarubicin(ACR), Cyclophosphamide(CPM)の 活 性 型 で あ る4-Hydroperoxycyclophosphamide, Vincristine (VCR), Cytosine arbinoside(ara-C)お よ び Methotrexate(MTX)を 用 い た.各 薬 剤 の 濃 度 勾 配 は,図1の ご と く各 々 の 治 療 域 血 中 濃 度 (high dose療 法 を 含 む)を 反 映 し,そ の 濃 度 を 含 む 範 囲 に 設 定 し た.各 薬 剤 は 濃 度 勾 配 を作 成 し た 後,速 や か に 実 験 に 供 し た.な お, ara-C はin vivoで は 速 や か に 不 活 性 化 さ れ る が,培 養 液 中 のara-C活 性 はRIA法 に て 検 討 し,図 2の ご と く今 回 のin vitroの 実 験 中(曝 露 期 間 7日 間)第1日 の1/10以 下 に 低 下 す る こ とは な く,十 分 な 濃 度 が 維 持 で き て い た. 2.方 法 1)骨 髄 間 質 細 胞 の 長 期 液 体 培 養 法 Dexter培 養 法3)に 準 じ,以 下 の ご と く行 な っ 261

262 松﨑 敏 朗 図1  各種抗 白血病剤の治療域血中濃度 た.ま ず,ヒ ト 骨 髄 血 をFicoll-Hypaque (HISTOPAQUE-1077; 1.077g/mm3, Sigma, St. Louis, MO)に 重 層 し,比 重 遠 心 法(450g, 15分 間)に て 単 核 球 を 分 離 し た.こ の 単 核 球 分 画 は, α-minimal essential medium(α-MEM;

GIBCO, Gland Island, NY)に て2度 洗 浄 し た. そ の 後,得 ら れ た 骨 髄 単 核 球5×106個 をT-25フ ラ ス コ(25cm2; Coster, Cambridge, MA)で37℃, 5%CO2の 条 件 下 で 液 体 培 養 し た.培 養 液 は, α-MEMに15%牛 胎 児 血 清(FCS; Boehringer Mannheim, W. Germany), 2×10-6M Methyl

prednisolone, 40U/ml Penicillin, 40μg/ml Streptomycinを 加 え た も の を 使 用 し た.培 養 中, 週 に1回,使 用 培 養 上 清(非 付 着 性 細 胞 分 画 を 含 む)の 全 量 を 新 鮮 な 培 養 液 と 交 換 し,骨 髄 間 質 細 胞 が 培 養 フ ラ ス コ 底 に ほ ぼ100% confluent に な る ま で 培 養 し た. な お,以 下 の 実 験 は 全 てtriplicateで 行 い, 薬 剤 曝 露 の な い 場 合 を コ ン ト ロ ー ル と し た. 図2  骨髄 間 質 細 胞 培 養 上 清 中 のAra-C濃 度 の推 移 2)ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態 に 及 ぼ す 抗 白血 病 剤 の 影 響 (1)ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 抗 白 血 病 剤 へ の 曝 露 ヒ ト骨 髄 血 よ り分 離 し た 単 核 球5×106個 を用 い, T-25フ ラ ス コ で 骨 髄 間 質 細 胞 を長 期 液 体 培 養(1次 培 養)し た.骨 髄 間 質 細 胞 が フ ラ ス コ 底 に100% confluentに な っ た 時 点(培 養3∼4 週)で,フ ラ ス コ底 に 付 着 し て い る骨 髄 間 質 細 胞 を そ の ま まPBSに て2回 洗 浄 し た 後, 0.05% EDTA(ethylenediamine-tetraacetic acid)加 0.25% Trypsin液 を5ml加 え,充 分 に ピ ペ ッ テ ィ ン グ し,骨 髄 間 質 細 胞 を個 々 に 剥 離 した.こ れ ら の 骨 髄 間 質 細 胞 を α-MEMに て 洗 浄 後,抗 白 血 病 剤(薬 剤 濃 度10-3M∼10-9M)を 含 む 培 養 液8mlに 浮 遊 させ, 37℃, 5% CO2の 条 件 下 でT-25フ ラ ス コ に て 培 養(抗 白 血 病 剤 へ の 曝 露)し た.な お,抗 白 血 病 剤 へ の 曝 露 時 間 は, DNR, DXR, MIT, ACR, CPMお よ びVCRで は3 時 間, ara-CとMTXで は3時 間 お よ び7日 間 と し た が, ara-CとMTXの ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 造 血 支 持 能 に 及 ぼ す 影 響 の 検 討 で は,曝 露 時 間 の 設 定 に 関 し て は,複 数 の ボ ラ ン テ ィ ア の 骨 髄 血 を 用 い,曝 露 時 間 を24時 間, 72時 間 と した 検 討 で も,抗 白血 病 剤 に よ る抑 制 様 式 は い ず れ も 同 様 で あ っ た た め,最 長 曝 露 時 間 で あ る7日 間 で の 検 討 結 果 の み を 示 し た. (2)ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態 抗 白血 病 剤 に 曝 露 後,骨 髄 間 質 細 胞 を 回 収 し, PBSに 浮 遊 さ せ ピペ ッテ ィ ン グ した の ち さ らに, 細 胞 表 面 に 抗 白 血 病 剤 が 残 存 し な い よ う計3回

Studies on human bone marrow stromal cells 263 充 分 洗 浄 し た.そ の 後,細 胞 数 を5×105個 に 調 整 し,培 養 液1.5mlで35mm培 養 皿(Coster, Cam bridge, MA)に て 培 養 し た(2次 培 養).培 養 液 及 び そ の 交 換 方 法 は, 1次 培 養 と同 様 で あ る. 週 に1度 の 培 養 液 交 換 時,曝 露 濃 度 別 に2次 培 養 皿 をTripsin処 理 し,培 養 皿 底 に 付 着 増 殖 し た 骨 髄 間 質 細 胞 を個 々 に 剥 離 した.こ の よ う に して2次 培 養 第1週 か ら 第4週 ま で, 1培 養 皿 あ た りの 骨 髄 間 質 細 胞 数 を 計 算 板 に て 算 定 した. こ の 骨 髄 間 質 細 胞 数 の 変 動 を そ の 増 殖 動 態 と し た. 3)ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 造 血 支 持 能 に 及 ぼ す 抗 白 血 病 剤 の 影 響 (1)ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 抗 白血 病 剤 へ の 曝 露 前 述 の ご と く ヒ ト骨 髄 血 よ り分 離 し た 単 核 球 5×105個 を 用 い, 35mm培 養 皿 で 骨 髄 間 質 細 胞 を長 期 液 体 培 養 し た.骨 髄 間 質 細 胞 が100% conflu entに な っ た 時 点(培 養4∼5週)で,培 養 皿 底 に 付 着 し て い る 骨 髄 間 質 細 胞 を そ の ま ま, DNR, DXR, MIT, ACR, VCRお よ びCPMに3時 間, ara-C, MTXに7日 間,そ れ ぞ れ 一 定 の 薬 剤 濃 度(治 療 域 血 中 濃 度: 10-3M∼10-9M)で 曝 露 させ た.抗 白 血 病 剤 に 曝 露 後,骨 髄 間 質 細 胞 をPBSに て3回 洗 浄 し,抗 白 血 病 剤 を含 ま な い 培 養 液 に よ る3時 間 の 中 間 培 養 を 行 い,そ の 後 さ らにPBSに て3回 洗 浄 し,骨 髄 間 質 細 胞 上 の 抗 白 血 病 剤 を 充 分 に 除 去 し た.こ の よ うに し て抗 白血 病 剤 へ の 曝 露 後 の100% confluentヒ ト骨 髄 間 質 細 胞(以 下,抗 白 血 病 剤 曝 露 間 質 細 胞)を 作 成 し た. (2)骨 髄T細 胞 除 去 非 付 着 性 単 核 球 正 常 人(24∼33歳)骨 髄 血 よ り前 述 の 方 法 に よ り分 離 し た 単 核 球 分 画 か ら, E-ロ ゼ ッ ト形 成 法 に てT細 胞 を 除 去 後, T-25フ ラ ス コ に 培 養 液 と共 に37℃, 5%CO2の 条 件 下 で2時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た .そ の 後,フ ラ ス コ底 壁 に 付 着 し た 細 胞 分 画 を 除 き,培 養 液 中 の 非 付 着 性 細 胞 分 画 の み を 回 収 した. (3)コ ロ ニ ー ・ア ッセ イ 抗 白 血 病 剤 曝 露 間 質 細 胞 上 で,骨 髄T細 胞 除 去 非 付 着 性 単 核 球(5×105個/培 養 皿)と を 液 体 共 培 養 した.培 養 は,前 述 の 培 養 液(α-MEM, 15% FCS, 2×10-6M Methylprednisolone, 40

U/ml Penicillin, 40μg/ml Streptomycin)1.5 mlを 用 い, 37℃, 5%CO2の 条 件 下 で 行 っ た.一 週 間 の 培 養 後,培 養 上 清 を静 か に 除 去 し,乾 燥 さ せ た 後, Myeloperoxidase(以 下, MPO)と Giemsaの2重 染 色 を行 い,抗 白 血 病 剤 曝 露 間 質 細 胞 上 に 接 着 形 成 さ れ た 造 血 細 胞 の コ ロ ニ ー 数 を算 定 し,骨 髄 間 質 細 胞 の 造 血 支 持 能 と し た. な お,細 胞 数20個 以 上 を コ ロ ニ ー と した.ま た, 全 実 験 系 に お い て, Trypsin処 理 に て 回 収 し た 骨 髄 間 質 細 胞 のviabilityは, trypan blue dye exclusion testに て80∼85%で あ っ た. 結 果 1.ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態 に 及 ぼ す 各 種 抗 白 血 病 剤 の 影 響 増 殖 動 態 は,抗 白 血 病 剤 曝 露 後 の2次 培 養 に お け る ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 数 の 第1週 か ら 第4週 ま で の 経 時 的 算 定 に よ り検 討 し た.グ ラ フ の 縦 軸 は, 2次 培 養 第0週 の 実 細 胞 数 に 対 す る各 週 の 細 胞 数 の%比 で 表 し,横 軸 は 時 間 経 過(週) と し た.コ ン トロ ー ル 群 で は,培 養4週 目 ま で 時 間 経 過 と と もに 対 数 的 に 増 殖 し,そのdoubling 図3  DNRの ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 に 対 す る増 殖 抑 制 効 果

264 松﨑 敏 朗 図4  DXRの ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 に 対 す る増 殖 抑 制 効 果 図5  MITの ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 に対 す る増 殖 抑 制 効 果 timeは 約38時 間 と推 定 され た.抗 癌 性 抗 生 物質 のDNR, DXR, MITお よ びACRで は,骨 髄 間質 細 胞 の 増殖 は ともに 濃度 依 存 的 に抑 制 さ 図6  ACRの ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 に 対 す る増殖 抑制 効 果 れ る傾 向 が 認 め られ た(図3∼ 図6). MIT, ACR で は1×10-7M, DNR, DXRで は1×10-6Mよ り 抑 制 傾 向 を 示 し た.ま た, 2次 培 養 第1週 目 に お け る抑 制 の 強 さ を50%抑 制 濃 度 で 比 較 す ると, DNR, DXR, MITお よ びACRで は,各 々1.5× 10-6M, 2.0×10-7M, 3.0×10-8Mお よ び6.0× 10-8Mで, MITの 抑 制 効 果 が 最 も 強 く,つ い で ACR, DXR, DNRの 順 で あ っ た が,す べ て 治 療 域 濃 度 の 範 囲 で 増 殖 が 抑 制 さ れ る こ とが 示 さ れ,化 学 療 法 時 に 認 め ら れ る骨 髄 抑 制 の 程 度 に 近 似 し て い た.植 物 ア ル カ ロ イ ドのVCRで も, 図7の ご と く抗 癌 性 抗 生 物 質 同 様,治 療 域 濃 度 内 で 濃 度 依 存 性 に 骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 抑 制 傾 向 が 認 め ら れ た.ア ル キ ル化 剤 のCPMで も図8 の ご と く治 療 域 濃 度 内 で 濃 度 依 存 性 に 骨 髄 間質 細 胞 の 増 殖 抑 制 が 認 め ら れ た.一 方,代 謝 拮 抗 剤 のara-Cで は,図9の ご と く骨 髄 間 質 細 胞 に 対 す る 増 殖 抑 制 効 果 は, 10-3M∼10-8Mの 薬 剤 濃 度 で ほ とん ど認 め ら れ ず,同 じ く代 謝 拮 抗 剤 で あ るMTXで も,図10の ご と くara-Cと ほ ぼ 同 様 に 骨 髄 間 質 細 胞 へ の 増 殖 抑 制 効 果 は 認 め ら れ な か っ た.

Studies on human bone marrow stromal cells 265 図7  VCRの ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 に対 す る増 殖 抑 制 効 果 図8  CPMの ヒ ト骨髄間質細胞に対す る増殖抑制 効 果 2.ヒ ト骨 髄 間 質細 胞 の 造 血支 持 能 に及 ぼ す抗 白血病 剤 の 影響 本 実 験系 にお け る薬 剤 の 濃度 も,治 療 域 血 中 濃度 を参 考 に設 定 した.ま た,抗 白血病 剤 へ の 曝 露 後 も骨 髄 間 質細 胞 は 形 態的 に変 性 して培養 図9  Ara-Cの ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 に対 す る増 殖 抑 制 効 果 図10  MTXの ヒ ト骨 髄 間質 細 胞 に対 す る増 殖 抑 制 効 果 皿 底 か ら剥 離 す る よ うな こ とは な く, 100% conflu entを 維 持 し て い た.ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 造 血 支 持 能 を コ ロ ニ ー ・ア ッ セ イ に よ り検 討 し た が, 形 成 さ れ た 造 血 細 胞 コ ロ ニ ー はMPO陽 性 及 び 陰 性 コ ロ ニ ー に 分 け て 検 討 し た. MPO陽 性 お よ

266 松﨑 敏 朗 図11  ヒ ト骨 髄 間質 細 胞上 に 形 成 され た ペ ル オ キ シ ダー ゼ 陽性 お よび 陰性 コ ロニー び 陰 性 コ ロニ ー は 図11に 示 す ご と くで, MPO陽 性 コ ロ ニ ー は,形 態 学 的 に もmyeloid様 細 胞 だ が, MPO陰 性 コ ロ ニ ー は,胞 体 は や や 小 型 でN/ C比 の 大 きい 細 胞 が 中 心 で あ っ た.し か し, CD 3, CD7, CD13, CD14, CD19, CD34, CD45, HLA-DRを 用 い た 検 討 で は,い ず れ もmyeloid の マ ー カー を保 持 して い た.グ ラ フの 縦 軸 はMPO 染 色 に よ る コ ロ ニ ー の分 類 を,横 軸 は2次 培 養 皿 一 つ あ た りに 形 成 さ れ た コ ロ ニー 数 を示 し た. 抗 癌 性 抗 生 物 質 のDNRで は,図12の ご と く, まず10-7Mよ りMPO陽 性 コ ロ ニ ー 形 成 が 抑 制 され,つ ぎ に10-6MでMPO陰 性 コ ロ ニ ー 形 成 も 完 全 に 抑 制 さ れ る 傾 向 を示 し た.ま た, DXRで は 図13の ご と く10-7MでMPO陽 性 コ ロ ニ ー 形 成 が 抑 制 さ れ,つ ぎ に10-6MでMPO陰 性 コ ロ ニ ー 形 成 も 抑 制 さ れ る傾 向 を 示 し た が ,完 全 に は 抑 制 され なか った. MITで も 図14の ご と くDXR とほぼ 同 様 に 濃 度 依 存 性 に 最 初 に10-7MでMPO 陽 性 コ ロ ニ ー 形 成 が 抑 制 さ れ,つ ぎ に10-6Mで MPO陰 性 コ ロ ニ ー 形 成 が 抑 制 さ れ る傾 向 が 認 め ら れ た が,完 全 に は 抑 制 され な か っ た. ACRで も 図15の ご と く 濃 度 依 存 性 を 示 し, 10-7Mで MPO陽 性 コ ロ ニ ー 形 成 が 抑 制 さ れ,つ ぎ に10-5 MでMPO陰 性 コ ロニ ー 形 成 が 完 全 に抑 制 され た. ま た,植 物 ア ル カ ロ イ ドのVCRで も,図16の ご と く抗 癌 性 抗 生 物 質 とほぼ 同 様 に 最 初 に10-7M でMPO陽 性 コロ ニー 形 成 が 抑 制 さ礼 つ ぎに10-6 MでMPO陰 性 コ ロ ニ ー 形 成 が 抑 制 され,抑 制効 果 に は 濃 度 依 存 性 の 傾 向 が 認 め ら れ た.ア ル キ ル 化 剤 のCPMは,図17の ご と く骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 動 態 に 濃 度 依 存 性 の 抑 制 傾 向 を示 した に も か か わ らず,抗 癌 性 抗 生 物 質 と異 な り,骨 髄 間 質 細 胞 の コ ロ ニ ー 形 成 支 持 能 に 対 す る抑 制 傾 向 は 認 め られ な か っ た.代 謝 拮 抗 剤 のara-C処 理 後 の 骨 髄 間 質 細 胞 の コ ロ ニ ー 形 成 支 持 能 は, 図18の ご と く コ ン トロ ー ル と 差 は 認 め られ なか っ た.し か し,同 じ代 謝 拮 抗 剤 で あ るMTXで は,図19の ご と く一 定 濃 度(10-4M)以 上 で 著 明

Studies on human bone marrow stromal cells 267 図12  ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 造 血 細 胞 支 持 能 に 及 ぼ すDNRの 影 響 に 抑 制 さ れ た.特 に, MPO陽 性 コ ロ ニ ー の 形 成 が 抑 制 さ れ た が, MPO陰 性 コ ロ ニ-も や や 抑 制 傾 向 に あ っ た. な お,各 図 の 最 下 段 に 示 す よ うに, endogenous colonyの 検 討 で は,同 コ ロ ニ ー は 形 成 され ず, 今 回 の 実 験 で 形 成 さ れ た コ ロ ニ ー は,骨 髄 間 質 細 胞 上 で 共 培 養 さ れ た 非 付 着 性 骨 髄 単 核 細 胞 由 来 と考 え られ た. 考 察 1961年Till, McCulloch24)が 脾 コ ロニ ー 形 成 法 を 開 発 し て 以 来, Botnickら27)に よ っ て 代 表 さ れ る よ う に 化 学 療 法 に よ る 骨 髄 抑 制 の 検 討 は CFU-Sを 中 心 と し た造 血 幹 細 胞 か らの 検 討 が ほ と ん どで あ っ た25-28).一 方, 1977年Dexterら3) に よ り造 血 微 小 環 境 をin vitroで 最 も よ く反 映 し て い る と さ れ て い るマ ウ ス の 長 期 骨 髄 液 体 培 養 系 が 開 発 さ れ,骨 髄 間 質 細 胞 に 及 ぼ す 抗 白 血 病 剤 の 影 響 が マ ウ ス を 用 い 検 討 さ れ て き た 図13  ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 造 血 細 胞 支 持 能 に 及 ぼ すDXRの 影 響 が16-20),ヒ トでは まだ十 分 に検 討 が な され て い ない.今 回著 者 は,ヒ ト骨 髄 間質 細 胞 に及 ぼ す 抗 白血 病 剤 の影 響 に つい てDexterら3)に よ り考 案 さ れ た長期 骨 髄 液体 培 養 系 の変 法 を用 い検 討 した わけ で あ るが,抗 癌 性抗 生 物 質 のDNR, DXR, MITお よびACRは,骨 髄 間質 細 胞 の 増 殖能 と造 血支 持 能 を と もに 濃度 依 存性 を示 しな が ら抑 制 す る傾 向 を 示 し,増 殖 能 抑 制 力 は MIT>ACR>DXR>DNRの 順 で,造 血支 持 能 抑 制 力 はDNR≒ACR>DXR≒MITで あ った. cell cycleのM期 に 主 な作 用 点 を有 し29),臨 床 的に 造 血抑 制 が 比較 的 軽 度 で あ るVCRが,抗 癌 性 抗生 物 質 同様,骨 髄 間質 細 胞 の増 殖 能 と造 血 支 持能 を ともに 濃度依 存性 に抑 制 す る傾 向 を 示 した の は興 味 あ る所 見 と考 え られ る.ま た, アル キル化 剤 のCPMで は,治 療 域 血 中濃 度 の 範 囲 内 で,濃 度依 存 性 に 骨髄 間質 細 胞 の増 殖 が 抑 制 され た もの の,造 血 支持 能 は 抑制 され ない こ とが示 され た が,抗 癌 性抗 生 物 質 と同 じcell

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図14  ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 造 血 細 胞 支 持 能 に 及 ぼ すMITの 影 響

cycle phase non-specificな 薬 剤 であ るに もか か わ らず,造 血 支持 能 が 抑 制 さ れ なか っ た こ と はCPMの 特 異 性 を示 す もの と も考 え られ た. CPMは 骨髄 移 植 の前処 置 用薬 剤 として代 表 的 な もの で あ るが, CPMが 骨 髄 間 質 細胞 の造 血 支 持 能 を保 存 し得 る事 実 は, CPMが 前処 置 用薬 剤 の ひ とつ と して有 用 で あ る こ とを示 唆 して い る も の と も思 われ る.代 謝 拮抗 剤 で あるara-C, MTX の検 討 で は,両 薬剤 とも骨 髄 間質 細 胞 の増 殖 に 対 し抑 制効 果 を示 さ なか った.こ の よ うに骨 髄 間質 細 胞 の増 殖 能 に対 し細 胞周 期 に 比較 的非 依 存性 の 抗 白血病 剤 が 抑 制効 果 を発 揮 し,依 存 性 の抗 白血病 剤 に そ の効 果 が 認め られ な か っ た こ とにつ い て は,骨 髄 間 質 細 胞 の細 胞 回転 が遅 い (doubling timeが 約38時 間)こ とに一 つ の 原 因が あ るの では な いか と考 え られ るが, 1週 間 に及 ぶ長 期 曝 露 に対 して も抑 制 効 果 が認 め られ なか った こ とか ら して, S期 に入 って い る骨 髄 間 質 細 胞の 比率 が極 め て低 い こ とを示 唆す る も 図15  ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 造 血 細 胞 支 持 能 に 及ぼ すACRの 影 響 の で は な いか と考 え られ る.今 回 の増 殖抑制 の 実 験 は,臨 床 上化 学 療 法 後 に障 害 を受 け た骨髄 間 質 の修 復 過程 を よ り反 映 させ る こ とを一つ の 目的 と した もの で,す べ てconfluentに なった 状 態 の間質 細 胞 をTrypsin処 理 に よって剥離 し, 抗 白血病 剤 にて 前処 置す るこ とに よって行 われ てお り,も しこれ ら薬 剤 を増殖 期 で作 用 させ た 場 合 はara-C, MTXと も増殖 を抑制 した可能 性 は 否 定 で き な い.さ らに著 者 は化学 療法 の影 響 を機 能 的 に検 討 す るため,造 血 支持 能 に対す る影響 を検 討 したわ け で あ るが,抗 癌 性抗 生物 質 お よび植 物 アル カ ロイ ドで は その機 能 に も強 い障 害 を与 え る こ とが示 され た.た だ, ara-Cは 造 血 支 持能 に抑 制 的効 果 を与 えてお らず,治 療 域 濃 度 に お い て は造 血能 支 持 とい う骨髄 間質細 胞 機 能 に 対 す るara-Cの 影響 は極 め て少 ないの で は ない か と推 定 され る.一 方, MTXで は10-4 M以 上 の 濃 度 で造 血 支持 能 が 抑制 され,同 じ代 謝 拮 抗 剤 でara-CとMTXの 間 に差 が認め ら

Studies on human bone marrow stromal cells 269 図16  ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 造 血 細 胞支 持 能 に 及 ぼ すVCRの 影 響 れ た こ とは 注 目され るが,両 薬剤 の作 用機 序 の 差 す なわ ちMTXに お いて はmRNAか ら蛋 白 合成 への過 程 を阻 害す る29)といった作 用機 序 の差 に一 つ に は起 因 した可能 性 が 推定 され る.臨 床 上極 め て 長期 にわ た る化 学 療 法後 の造 血障 害 を きたす 症例 を経 験 す るこ とが あ るが,こ れ ら症 例 で は化 学療 法 に よつ て骨 髄 間質 細 胞 の量 的, 質 的変 調 を きた して い る可 能 性 が強 く推定 され る.特 に,骨 髄 間 質細 胞 の 量 的減 少 が 推定 され る高齢 者,骨 髄 の 一部 線 維 化 を伴 う白血病,骨 髄低 形 成 型 白血 病 症例 では,化 学 療 法 に よ り強 い骨 髄 間質 細 胞 の 減少 とそれ に随 伴 した造 血 支 持 能 の低 下が 惹起 され る可 能性 が あ り,「宿 主-薬 剤-腫 瘍」 の相 関か らも投 与主-薬 剤 量 に対 す る 配慮 が 当 然必 要 と され よ う.ま た,骨 髄支 持 能 の保 持 とい っ た点 でara-Cの 有 用性 が 示 された が,骨 髄 移 植 の 前処 置 として,白 血病 細胞 を含 む 多 くの病 的 造 血細 胞 がara-Cに 感受 性 が あ る こ と を考 え あわせ ば, ara-C大 量 投 与 法 も骨 髄 図17  ヒ ト骨 髄 間質 細 胞 の 造 血 細 胞 支 持 能 に 及 ぼ すCPMの 影 響 移植 前 処 置 の有 力 な手 段 に な り得 るの で は ない か と考 え られ る.一 方,今 回 の成 績 か らMTX の 中等 量 あ るいは 大量 投 与 に お い ては 造血 障 害 の遷 延 化 を引起 こす可 能 性 が考 え られ,骨 髄 間 質細 胞 の 増殖 動 態 お よび造 血 支持 能 に 障害 を及 ぼ す他 の 薬剤 との 併用 につ い て は十 分 な配慮 が 必要 とされ る もの と思 われ る.ま た,今 回 の実 験 系 にお いて は観 察 され る コ ロニー の 構 成 細胞 に つ い て も検 討 を加 えたが, MPO陽 性 細 胞 が比 較 的早 期 に減 少 した こ とは,骨 髄 間質 細 胞 が血 球分 化 ・増殖 過 程 の い か な る過程 に関 与 す るか とい っ た点 を解 明 して ゆ く上 に極 め て示 唆 深 い 成 績 と も考 え られ る. 以上,本 研 究 にお い て ヒ ト骨 髄 間質 細 胞 に 及 ぼ す抗 白血病 剤 の 影響 を検 討 した が,そ の 作用 様 式 は 多 くの場 合 薬 剤 の作 用 機 序 の差 に起 因 す る と考 え られ る もの の,造 血 細 胞 に対 す る効 果 とは 異 な る反 応態 度 を示す 薬 剤 が あ り,薬 剤 の 造 血 障害 は,骨 髄 間質 細 胞 と造 血 細 胞へ の影 響

270 松﨑 敏 朗 図18  ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 造 血 細 胞 支 持 能 に 及 ぼ すAra-Cの 影 響 とい う総合 的 な表 現型 と して臨 床 的 には 把 握す る必 要 が あ る.今 回は,不 均 一 な骨 髄 間 質細 胞 集 団 をひ とつ の機 能体 と し検討 を加 えた が,骨 髄 間質 細 胞 群 を構 成 す る各 細 胞 に 対 しmono clonal抗 体 が近 い将 来 開発 される可能 性 があ り, 単 一 種 の 骨髄 間 質細 胞 に対 す る検 討 が な され る なか で,骨 髄 間質 細 胞 の特 殊 性 もよ り一 層 明確 に され る もの と思 われ る.今 後,骨 髄 間質 細 胞 の病 因 ・病 態論 的 意義 も明 らか に され て くる も の と思 わ れ るが,各 疾 患 が造 血 細 胞 と骨 髄 間 質 細 胞 の い ずれ に病 因論 的 関与 を有 す るか で治療 法 の選 択 も変 っ て くるの では ないか と考 え られ, 骨髄 間質 細 胞 に対 す る検 討 は そ の量 的,質 的異 常 を含 め各 疾 患 の病 因 ・病 態論 的 関 与 さ らに治 療 法 の新 た な展 開 に今 後 重要 な情 報 を与 え る も の と考 え られ る. 図19  ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 造 血 細 胞 支 持 能 に 及ぼ すMTXの 影 響 結 論 ヒ ト骨髄 間質 細 胞 の増 殖 動 態 と造 血支持 能に 対 す る抗 白血 病 剤 の影 響 に つ い てDexter培 養 変 法 の長 期 液体 培養 系 を用 い検 討 を加 え た.そ の結 果, 1.抗 癌性 抗 生 物 質 のDNR, DXR, MITお よ びACRは,ヒ ト骨 髄 間質 細 胞 の増 殖能 お よび 造 血 支持 能 と もに濃 度依 存 性 に抑 制 したが,増 殖 能 は1×10-6M,造 血支 持 能 は1×10-7Mよ り抑 制傾 向 を示 し,造 血支 持 能 抑制 は増殖 能抑制 よ り,よ り低 濃 度 か ら認 め られ た. 2.植 物 ア ル カ ロ イ ドのVCRは,ヒ ト骨髄 間質 細 胞 の増 殖 能 お よび造 血 支持 能 ともに 濃度 依 存 性 に抑 制 し,増 殖 能 抑 制,造 血 支持 能抑制 ともに1×10-7Mよ _{り認め られ た .}

Studies on human bone marrow stromal cells 271 3.ア ル キ ル 化 剤 のCPMは,ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 能 に 対 し10-4Mよ り濃 度 依 存 性 に 抑 制 傾 向 を示 した が,造 血 支 持 能 に 対 す る抑 制 傾 向 は 認 め られ な か っ た. 4.代 謝 拮 抗 剤 のara-C, MTXは,と も に ヒ ト骨 髄 間 質 細 胞 の 増 殖 能 は 抑 制 し な か っ た. ara-C処 理 後 の 骨 髄 間 質 細 胞 の コ ロ ニ ー 形 成 支 持 能 は コ ン トロ ー ル に 比 し差 は 認 め ら れ な か っ た が, MTXで は,骨 髄 間 質 細 胞 の コ ロ ニ ー 形 成 支 持 能 は1×10-4M以 上 で 著 明 に 抑 制 さ れ,同 じ代 謝 拮 抗 剤 で も骨 髄 抑 制 に差 異 が 認 め られ た. 5.骨 髄 間 質 細 胞 の コ ロニ ー 形 成 支 持 能 が 抑 制 さ れ る 場 合, MPO陽 性 細 胞 に よ って 構 成 さ れ る コ ロ ニ ー 形 成 能 が よ り早 期 に 抑 制 さ れ た. 以 上 の 成 績 を得 た が,今 後 「宿 主-腫 瘍-薬 剤 」 の 相 関 に 立 脚 し た化 学 療 法 の 設 定,薬 剤 起 因 性 の 続 発 性 造 血 器 障 害 の 病 態 解 析 さ らに,骨 髄 移 植 の 前 処 置 薬 剤 の 選 択 に 際 し,一 つ の 情 報 を 提 供 す る も の と考 え ら れ た. 稿 を終 え る に あ た り,御 指 導,御 校 閲 を賜 っ た木 村 郁 郎 教 授 な らび に御 指 導 を い た だ い た高 橋 功 講 師 お よ び大 本 英 次 郎 助 手 に深 甚 な る謝 意 を表 し ます. なお,本 論 文 の 要 旨の 一 部 は,第52回 日本 血 液 学 会 総 会(東 京),第53回 日本 血 液 学 会 総 会(京 都)お よ び第33回 日本 臨床 血 液 学 会 総 会(東 京)に お いて 発 表 した. 文 献

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272 松﨑 敏 朗

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Studies on human bone marrow stromal cells 273

Studies on human bone marrow stromal cells

Part 1. Effects of antileukemic agents on human bone marrow

stromal cells

Toshiaki MATSUZAKI

Second Department of Internal Medicine, Okayama University Medical School,

Okayama 700, Japan (Director: Prof. I. Kimura)

The effects of antileukemic agents on the growth of human bone marrow stromal cells (HBMSC) and its ability to sustain the growth of normal hematopoietic progenitors were studied by using a modified Dexter's culture system. Antileukemic agents used were daunor ubicin (DNR), doxorubicin (DXR), mitoxantron (MIT), aclarubicin (ACR), vincristine (VCR), cyclophosphamide (CPM), cytosine arabinoside (ara-C) and methotrexate (MTX). In this experiment, HBMSC were exposed to each concentration of DNR, DXR, MIT, ACR, VCR and CPM for 3 hours, and to ara-C and MTX for 7 days.

DNR, DXR, MIT and ACR suppressed the growth of HBMSC at the concentration of •†10-6 M, and also suppressed its ability to sustain the growth of normal hematopoietic progenitors at the concentration of •†10-7M. VCR suppressed both the growth of HBMSC and its ability to sustain the growth of normal hematopoietic progenitors at the concentration of •†10-7M.

CPM suppressed the growth of HBMSC at the concentration of >10-4M. However, its ability to sustain the growth of normal hematopoietic progenitors was not suppressed. Ara-C and MTX did not suppress the growth of HBMSC at the concentration of 10-8M to 10-3M. The ability of HBMSC to sustain the growth of normal hematopoietic progenitors was not suppressed by Ara-C. On the other hand, it was suppressed by MTX of >10-4M.

These findings, which clarified the effects of the antileukemic agents on the functions of HBMSC, provide some information not only on the optimal combination of antileukemic agents and premedication of bone marrow transplantation, but also on drug-induced hematotoxicity.