家蚕硝酸還元酵素の水素供与体に就て
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(2) 415. 家蚕硝酸還元酵素 の水素供与体 に就 て 大 On the. 村. 浩. 久. hydrogen-donators of the reductase of silk-worm Hirohisa. nitrate. Omura. 緒. 言. 家 蚕 硝 酸 還 元 酵 素 は組 織竝び に消 化 管 に か な り緊 密 に 結合 して 存 在 し,単 に 磨 砕 す るだ け で は 抽 出 され ず,現 の で,通. に石 英 砂 と共. 段 階 に 於 て は 細 胞外 に分 離 す る事 に は成 功 して い ない. 常 背 部 を 切開 して消 化 管 を 破 らな い よ うに 内 容 物 を含 ん だ ま ま摘 出除 去 した 組 織. を 十 分洗滌 し水 叉 は 燐 酸 緩 衝 液 と磨 砕 懸 濁 し酵 素 液 と して用 い て き た. 従 来 基 質 共 の 他 の 諸 因 子 の 外,多 抽 出 純 化 され た 酵 素 製 品 は,触 は 取 り扱 は れ て きた が,そ. 数 の 関 連 す る反応 系 を も包 含 して い る生 細 胞 を離 れ て. 媒 作 用 を持 つ複 雑 な有 機 化 含物 と して,化 学 の分 野 に 於 て. の試 験 管 内 で示 す 反応 は 必 ず し も生 体 内 に於 け る酵 素 本 来 の行. 動 を全 面 的 に 反 映 してい る とは 云 い 難 く,生 物 学 的立 場 か らは過 度 に は精 製 せ ず基 質鼓 び に 諸 因 子 及 び 関連 す る諸 酵 素 系 を も含 ん だhomogenate叉. は 切片 を 使 用 す る事 も無意 味. では 無 く場 合 に よ つ て は寧 ろ好 ま しい様 に も考 え る. 併 し無 用 の不 純 物 の混 合を避 け る事 は 当然 で あつ て,蚕. 児 に 於 て は そ の大 部 分 を 占 め る. 消 化 管 に充 満 してい る食 下 され た 桑 葉 や 強 ア ル カ リ性 の 黄 褐 色 の 粘 稠 な消 化 液 に は硝 酸還 尤 酵 素 は 検 出 され ない 上,反 応 液 を着 色 して生 成NOzの を困 難 にす る外,反 応 液 のpHを. 比 色 測定 を 妨 害 し酵 素 力 の判 定. ア ル カ リ側 に 移 動 させ る事,当 研 究 室 に 於 てバイラス 誘. 起 作 用 を持 つ 事 が 見 出 され たNH,・OHやKN0.の. よ うな 含 窒 素 無 機 塩 を添 食 した蚕 児 の. 全 寮 体 を酵 素 剤 と した場合 反応 は著 し く弱 く酵 素 は不 活性 化 され たか の結 果 を示 す が,消 化 系 統 を除 き更 に 附着 血液 を も洗滌 除去 した組 織 の み に就 ては 却 て活 性 化 され,添. 食 され. た塩 類 自身 或 は此 の 反応 生 成 物若 くは 之 と 血 液 叉 は消 化 液 成 分 との結 合 物 が 酵 素 反 応 を阻 害 す る ら しい事 等種 々の 影 響 を観 察 した.之 等 の混 乱 を避 け るた め に は 或 る程 度 精 製 す る Ilfは必 要 で あ つ て ,家 蛮 酵 素 で は場合 に よつ て は組 織 抽 出残 渣 の再 懸濁液 を使 用 した が, 此 の場合 抽 出処 現 に よ る作 用 力 の低 下 は免 れ 得 なか つ た. 実. 験. 家 蚕 硝 酸還 元醇 素 に対 す る抽 出処 理 に よ る作 用 力低 下 の一 例 を第1表 除 いた 支108種,5齢. 蚕 組 織109を. 10燐 酸緩 衛 液 と共 に よ く磨 砕,100cc懸 2500r.P.m.に10分. に示 す.消. 化管を. 十分 に 水洗 した後 少量 の石 英 砂 をカrTえpH7.4のM/ 濁 液 と し之 を 原 酵 素 液 と し た.本. 間遠 心 分 離 し残 渣 を再 び 同一緩 衝 液 に磨 砕 懸 濁90ccに. 液90ccを 復 し た(残.
(3) 416. 第1表,家. 蚕. 組 織. 抽. 出 効 果.. 10‑2MNO3.pH7.4.35'.20h.. 渣 酵 素 液 一1)。 以 下 同 様 に抽 出 処 理 を 行 う(残渣 酵素 液 一2,・ … ・ ・).従 つ て 之等 の 酵 素 液 各5ccは 何 れ も家 蚕 新 鮮 組 織0.59叉 ン乾 燥 粉 末 に就 て も5cc当 りO.059Nは 素 液5ccと2×10‑2MNaNO3溶. は 之 に相 当す る量 を含 有 す る.同 じ様 に ア セ ト 相 当 量 を含 む様 に 酵 素 液 を調 製 し,之 等 の 各 酵. 液5ccと. 時 間 反 応 させ た 後 常 法 に従 つ て 生 成NO.・ 回 で1/12に. を 混 合 し トル オ ール 層 の被 覆下 に35。,24. を測 定 した が,生. 体 で は1回 抽 出 で約1/4,2. 作 用 力 は 激 減 しNア セ トン粉 末 で も2回 で約1/2と. 程 慶 は 小 さい が酵 素 力 の. 減 少 を惹 起 した 。 術 此 の 場合 原 酵 素 液 を 用 い た 反応 液 は漏 濁 して い るが残渣 で は殆 ど清 澄 で 酵 素 組 織 は 試 験 管 底 に 沈 積 し特 別 に醋酸 鉛 若 くは醋酸 に よ る除 蛋 白 を 必要 と し な か つ た. 元 来 硝 酸 還 元 酵 素 とい つ て も硝 酸塩 の み を特 異 的 に還 元 す る酵 素 は 見 出 され て居 らず, Bernheim及. びDixon氏(1928)ほ. 硝 酸塩 を直 接 の水 素 受容 体 と して ア ル デ ヒ ドの酸 化. を行 い 且 つ シ ア ンに よ る阻 害 性 を 示 さな い ア ル デ ヒ ド酸 化 酵 素 と,青 酸 感受 性 の然 も既 知 の 脱 水 素 酵 素 とは 異 るnitratereducingsystemと 呼 ぱ れ る もの との2種 存 在 す る と主 張 し,照 井 氏(1936)は. 同 氏 の 細 胞 外抽 出 酵 素 は シ ア ン感 受 性(重 金 属 接 触 性)及. 還 元 性 の両 性 質 に よつ て特 徴 づ け られ るdehydraseで 素 受 容 体 で あ る と考 え た が,山. 県 氏(1938)は. あ つ て,硝. 脱 水 素 酵 素 に よつ て基 質 か ら或 る中 間 体 に. 水 素 が転 移 され 之 に硝 酸 還 元 酵 素 が作 用 して硝 酸 塩 に水 素 を伝 達 す る と し,そ に 関 し次 式 水素供身体. ・ → 中 間水 素 伝 達 体 ↑ 脱水素酵素. を 提 案 し,江 上,佐 藤 両 氏(1948)は. び硝 酸. 酸 塩 は脱 水 素 酵 素 の水 の反 応機 構. 一→NO.{ ↑ 硝 酸還 元 酵 素. 之 を確 認 す る と共 に 少 く と もdl一 ア ラ ニ ン が水 素供. 与 体 の 時 は ヂ ・ニユ ー ク レ オチ ツ ドが 中 間体 とな り得 る事 を 証 明 し 更 に琥珀 酸 の 場 介 に は 中 間体 の 関与 を必 要 とせず 直 接 硝 酸還 元酵 素 と反 応 し て, 號. 王白. 酉菱. 一. 一一・ 一. 一一 一 一 一 ・ 一 ・ 一 一 一 一"一 一 一一一 一 一 一一. ↑ 脱 水 素. に従 う事 を示 した.何. →NO,,. ↑ 酵 素. 硝. 酸 還 琥珀酸 元 酵 素. れ に し て も硝 酸 還 元 酵 素 は脱 水素 酵 素 と密 接 な 関係 を持 ち 硝 酸塩 を. 直 接或 は間接 の水 素 受 容 体 とす る一種 の脱 水 素 酵 素 と考 え る事 が 出来 る.換. 言 す る と硝 酸. 塩 が終 局 の水 素 受 容 体 とし て作 用 す る脱 水 素 酵 素 反 応 を 硝 酸 還 元酵 素 作 用 と見 る事 が 出来 る.上 記 抽 出 処理 に よつ て作 用 力 が減 少 す る原 因 の一 つ と して,組 の水 素 供 与 体 或 は中間 伝 達 体 が 除 去 され るた め で,此. 織 内 に含 有 され る種 々. の や うな基 質 を 反応 系 に加 え る と作. 用 力は 或 る程 度 恢 復 し関 連 す る脱 水 素 酵 素 が推 定 出来 る.而. して生 体 内成 分 中脱 水 素 酵 素.
(4) 417. の水 素 供 与 体 と して 考 え られ るの は 先 づC{・ ヂ ・カルボ ン酸 系 或 はTCAサ す る酸 類 若 くは 各 種 の糖 類 で あつ て,実. イ クル等 に属. 際 に 之 等 を基 質 とす る多数 の脱 水 素 酵 素 が発 見 さ. れ て い る. そ こ で5齢 蚕 生 体 組 織 拉 に3齢 蚕 ア セ トン粉 末 を そ れ ぞ れM/10燐. 酸 緩 衝 液(pH7.4). で2回 抽 出 した 残 流 の再 懸 濁 液即 ち残 渣酵 素 液 一2を 用 いNO,と 供 与 体(NaOHで. 等 量 即 ち10‑2M水. 素. 中 和)を 加 え て 反 応 させ た 所,予 期 の通 り著 しい 恢 復作 用 が見 られ作 用. 力 の減 退 の 原 因 の 一 つ に水 素 供 与 体 の 除去 が あ る事 が確 め られ た(第2表;第3表).照 第2表.酸 10‑2MNO3,10噌2MH一. 第3表.糖 10‑2MNO3,10‑2MH供. 井 氏 はAsp.oryzae,Asp.nigerの. 類 添 加 の 効 果(生. 体 組 織).. 供 与 体,pH7.4,3S',20h,酵. 類 添 加 の 効 果(アセトン. 素 量0.59.. 粉 末).. 与 体,pH7.4,35。,20h,酵. 素 量0.059. .. 耐 久 製 品 に 就 て,Succino‑一,Fumarico‑,Tartarico‑一,. Citrico‑,Malico‑,Malonico,Lactico‑,Buthylico‑一,Formico‑,Oxalico‑一,β‑0xy‑ buthylico‑一,及 織 に 就 て は 第2表 酸,葡. びHexosemonophosphate‑dehydrogenaseを に 示 す よ う に,林. 檎 酸,乳. 証 明 した が 家 蚕 生 体 組 酸,マ. レ ィ ン 酸,フ. マ ー ル 酸,琥珀酸,枸櫞. 萄 糖 の 各 脱 水 素 酵 素 が 関 与 し そ の 効 果 は と 記 順 序 で あ つ た.特. に林 檎 酸 は 非 常 に 強.
(5) 418. く各 種 の水 素 供 与 体 が 混 在 す る原 酵素 液 の み に就 て即 ち本 来 含 有 され る水 素 供 与 体 に よつ てNO,,の77%がNO,に. 還 元 され た が,之. に等 量 の林 檎 酸 を加 え た 所 殆 ど完 全 にNO,. に変 化 した.糖 類 に 関 して もア セ トン粉 末 に就 て果 糖,ガ キ シロー ズ,葡 萄 糖 の順 で あ る事 は第3表. ラ ク トー ズ,蔗糖,マ. ン ノー ズ,. に示 す 通 りで あ る.. 併 し以上の 実 験 は照 井 氏 の場 合 を も含 み 反 応 時 間 が 長 いた め,添 雑 す る酵 素 に よつ て種 々 の変 化 を被 る事 は容 易 に考 え られ,そ. 加 した 水 素 供{芥体 が 爽. の 第1次,第2次. …反応生. 成 物 か ら初 め て硝 酸 還 元 性 とい う受 容体 特 異性 を持 つ脱 水 素 酵 素 を 介 して水 素 が 硝 酸 塩 に 与 え られ る事 も あ り得 るわ け で作 用 力 の復 活 を示 す各 物 質 の 脱 水 素 酵 素 が 直 接 関与 して い る とは 断定 出来 な い.更 酸一 林 檎 酸 とTCAサ. に 推 測 を 許 され るな らば 例 え ば枸櫞酸 一 … …一班 王 白酸 一 フマ ー ル. イ クル に従 つ て変 化 し 林 檎 酸 酸 脱 水 素 酵 素 を介 して初 め て 硝 酸 塩 と. の 関連 性 を持 つ に至 る と考 え る事 も第2表 に 示 す 恢 復 作 用 の 順 序 と 比 べ 無理 で は な い 様 に も思 ほれ る.糖 類 に就 て も葡 萄 糖 よ り果 糖 へ の転 換,蕉 糖 の加 水 分 解 更 に 燐 酸 の 関 与 も照 井 氏 のHexosemonophosphate‑dehydrogenase存. 在 の主 張 や 実 際 水 懸 濁 液 よ りも燐 酸. 懸 濁 液 に於 て作 用 力 の 強 く現 は れ る事 な どか ら も考 え られ る.此 の酵 素 例 えば 蛋 白分 解 酵 素 に よつ て,組 られ 現 象 を益 々複 雑 に す る.従. 織 蛋 白 に よ り生 じた ア ミ ノ酸 が 介 入 す る事 も考 え. つ て照 井 氏 の よ うに直 ち に それ ぞ れ の基 質 の脱 水素 酵 素 が. 関 与 す る と断 定 す る事 は甚 だ危 険 で あ るが,前 る以上,仮. の外 直 接 に は無 関係 の他. 記諸 物 質 の添 加 に よつ て反 応 力が 増 強 され. 令 間 接 的 に せ よ水 素 供 与 能 は 否定 出来 な い.. 従 来 照 井 氏 の 方法 に徹 つ て トル オ ー ル で液 面 を被 覆 して 酸 素 との接 触 を遮 断 して 反応 さ せ て きた が,そ. の効 果 は 不 十 分 で あつ て短時間 の場合 は 満 足 な結 果が 得 られ なか つ た.従. つ てThunberg管. を 用 い排 気後 作 用 させ た所 従 来 の よ りNO2の. 力 は認 め られ た.即 従 つ て5cc当. ち5齢 第1日 脱 皮 直後 のP・22種12頭. り0.59若. よ り得 た組 織29よ. り常 法 に. くは相 当量 を含 有 す る よ うに殺 菌 水 で調 製 した 各 酵 素 液(抽 出. 酵 素 液 は 原酵 素 液 を2500r.P.mに5〜10分. 間 遠心 分 離 して得 た溷 濁上 澄 液 を原 量 に復 し. た もの)に 就 て10‑2MNO3,Thunberg管 計 を 用 い て生 成 したNO,・. 生 成 量 は 少 い が 十分 作 用. 申 で排 気 後400に2時. を測 定 した.第4表. 間 反応 さ せ,光 電 比 色. は そ の1例 で あ るが 第1表. と全 く類 似 した. 値 を示 し抽 出効 果 に関 す る限 り反 応 時 間 の長 短 は 問題 で な い事 が 見 られ た. 第4表.抽. 出. 効. 10}2MNO3,40。,2h,酵. 果(短. 時 間 反 応).. 素 量0.5gThunberg管.. 此 の よ うに上記 条 件 で十 分 酵 素 力 を測 定 出来 る事 が 認 め られ た の で 再 び水 素 供 与 体 の影 響 を検 討 した.同 様 にP‑22,5齢 同量 即 ち10‑2Mの. 蚕 組織 よ り調 製 した残 渣 酵 素 液 一2にNO,,及. 水 素 供 与 体 を加 え てThunberg管. 酵 素 剤 と し て何 れ も5齢 蚕 を用 いた の でNO2の. 内で 脱 気 後40。2時. び それ と. 間 反 応 させ た 。. 生 成 が 少 く(註),個 々の数値 を厳 密 には 比. 較 出来 な い に して も,光 電 比 色 計 を使 用 してい るの で 従 来 の値 よ りは精 度 も高 い.第5〜.
(6) 419. 7表 に 示 す様 に此 の場合 も反応 時 間22時. 間 の際 と 同 じ傾 向 を示 し 酵 素 力 の 候 復 率 か ら考. 慮 して 少 く と も酸 類 に於 け る林 檎 酸,マ レ イ ン酸,琥珀酸,マ び に蔗糖,其. ・ン酸,糖. 類 に於 け る果 糖 姓. の他 グル タ ミ ン酸 及 び ア スパ ラ ギ ンの水 素 供 与 能 は 確実 で あ つ て,反. 応時間. の短 い 事 と考 え 併 せ て之 等 の脱 水 素 酵 素 は 硝 酸還 元 酵 素 作 用 に 直 接 関与 し得 る と思 はれ る. 一 方ア セ トア ル デ ヒ ド及 び エ タ ノー ルは 逆 に阻 害 作 用 を 示 しBernhei皿 及 びDixon両 氏 が 主 張 した ア ル デ ヒ ド酸 化 酵 素 の 関与 は家 蚕 組織 に は起 らない 事 ぱ 明 自で あ る.術 の酵 素 力は 齢 のみ で な く 日に よつ て も非 常 に 変 動 す るの で,同. 家蚕. 一 酵 素 剤 を 用 い た 試 験 の結. 果 を 同 一・ の表 に記 載 した. 第5表.水 10‑2MNO:s,10‑2M水. 素 供 与 体 添 加 の 効 果(1). 素 供 与 体,40。,2h,酵. 第6表.水 10‑2MNO3,10‑2M水. 素 量0.59,Thunberg管.. 素 供 与 体 添 加 の 効 果(2). 素 供 与 体,40。,2h,酵. 第7表.水 10‑2MNO3,10‑2M水. 素 量0.59,Thunberg管.. 素 供 与 体 添 加 の 効 果(3). 素 供 与 体,40。,2h,酵. 素 量0.59,Thunberg管.. (註,家 蛋 硝酸 還 元 酵 素 は4令 に於 て 強 く5令 蚕 では 非 常 に弱 い事,叉4令 日に よつ て 変 化 す る事 が 判 つ た).. 総 1.家. でも. 括. い.そ. 蚕 硝 酸 還 元 酵 素 は水 叉 は 燐 酸緩 衝 液 で磨 砕 抽 出 され な いが 作 用 力 の低下 は免 れ な の 低 下 度 は 生 体 組 織 に 於 て ア セ トン粉 末 よ り も著 し い.. 2.抽. 出 に よ る作 用 力 低 下 の 原 因 の 一 一つ と し て 水 素 供 与 体 の 除 去 に 基 く 事 が 確 認 され た.. 3.水. 素 供 与 体 を 反 応 系 に 添 加 す る 事 に よ り 抽 出 残 渣 の 酵 素 力 は 或 る程 度 険 復 され るが,. そ の 効 果 は3S。20時 酸,琥珀酸,枸櫞酸. 間 の場合,酸. 類 で は 林 檎 酸,乳. 酸,酒. の1頃で あ り,糖 類 に 於 て は 果 糖,ガ. 石 酸,マ. レ イ ン酸,フ. ラ ク トー ズ,蔗糖,マ. マール. ン ノ ー ズ,.
(7) 420. キ シ ロ ー ズ,葡 4.従. 萄 糖 の 順 で あ つ た.. 来 トル オ ー ル 被 覆 下 に 長 時 間 反 応 させ て い た が,Thunberg管. 十 分 で あ る 事 が 確 証 さ れ た.此 向 を 示 し た.叉7k素 に 果 糖,蔗糖,マ. の 場 合 抽 出 処 理 に よ る作 用 力 の 減 退 は 長時間. 供 与 体 も 林 檎 酸,マ ン ノ ー ズ,キ. レ イ ン酸,琥珀酸,マロ. シ ロ ー ズ,ラ. ム ノ ー ズ,葡. ,マ. 間 及 び40。2時. ロ ン 酸,果. 糖,蔗糖,グ. ン 酸,フマー. 間 の 両 方 法 に よ る 結 果 よ り少 く と も林 檎 酸,マ. 橋 平 八 郎 両 氏 に 厚 く感 謝 す る.. 文. 献. Bernheim,F.&Dixon,M.(1928):Biochem.J.,22,125. 藤. 了(1948):日 造,14,233.. ル 酸,鼓. び. レイ ン 酸,. ル タ ミン酸 及 び ア スパ ラ ギ ンの 各 脱 水 素 酵 素 は 硝 酸 琥珀酸 還. 終 り に 実 験 に 協 力 さ れ た 三 浦 道 雄,高. (1936):醸. の 際 と 同.一.・ 傾. 方 ア セ トア ル デ ヒ ド及 び. 元 酵 素 作 用 に 直 接 関 与 し得 る事 が 判 明 し た.. 江 上 不 二 夫,佐. 間で. 萄 糖 の 順 に 活 性 作 用 を 示 し た が,. 特 に 最 も強 い の は グ ル タ ミ ン酸 次 い で ア ス パ ラ ギ ン で あ つ た.他 エ タ ノ ー ル は 逆 に 阻 害 作 用 を 示 し た. 5.35。20時. を 用 い て2時. 化,69,160. 照井堯造. 山 県 春 次(1936):ActaPhytochim.,10,283.. Sllmmary Itwasobservedthatthenitratereductaseofsilk‑wormwasnotextracted withwaterorphosphatebufferbygrindingbutdecreasedtheactivity,for exampleincaseoflivingtissuetheactivityoftheresidueonceextractedwas about28%ofthatoftheoriginalenzymesuspensionand8.8%illthetwice・ treatedone.Inacetonepowder,thoughthegradeofthediminutionofthe enzymicactionwassmall,e.g.toabouthalfbytwiceextraction,theeffectof extractiononthenitratereductasehadthesametendency.Itisveryprobable thatthedecreaseoftheenzylnaticactivitybyextractionmaybeexplainedin partasduetotheremovalofsomesubstanceswhicllprovidehydrogentonit‑ ratebycatalyticactionofproperdehydrogel〕asecoexistingilltheenzyme preparation.Iassumedthatwhenahydrogendonatorwasfurnished,the enzymicactionmusthavebeenactivatedtosomeextentandthedehydrogen‑ aseconcernedwouldbedecided.Therefore,thesamequantityofsubstances astheNO3tobereducedwasaddedtoreactionr【1ixtureandtheNQ,produced wasdetermined.Therestorationofactivityofassuewhichwasextracted twotimeswasattainedaccordingtotheorderinthefollowingtable.. ..
(8) 421. and. in. case. of. However, the. was. were the. reaction. the. careful. It may. be. in long. said. in the. that. •-, and. by other to. enzymes the. in which. malic-,. that. period. maleic. was. the. reaction. enzyme. reaction found. effect. the. time I tried,. solution. time that. that. reaction. and. these. of extraction. were allowed. condition was. also. shown.. , succinic. asparagine-dehydrogenases. silk-worm.. It was. were. of H-donators.. NO3and the. to assume. which. because. effects. so as to shorten. circumstance reaction. is reason. compounds. estimate. tube. there. other. at 400 for 1 to 2 hrs.. In this. as that. rose --, glutamic reduction. Thunberg's. studies. by. added. too long. to proceed. :. in these. evacuation. satisfactory. same. results. powder. be attained. was. to use after. acetone. substances. which. therefore, mixed. the. would. of the. 22 hrs. by. from. reactivation. products. the. sugars. , malonic were. concered. , fructose-to the. , sucnitrate.
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