廿日鼠及び牛肝臓の硝酸還元酵素
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(2) 423. 什 日鼠及 び牛肝臓 の硝酸還元酵素 大 The. nitrate. 村 reductase Hirohisa. 緒. 浩. 久. of maus. and. ox-liver. Omura. 言. 硝 酸 還 元 酵 素 が生 物体内 に於 け る窒 素 同化 の過 程 に於 て 重要 な役 割 を 演 ず る事 は,特 に 硝 酸 塩 を主 要 窒 素 源 とす る植 物 並 び に微 生 物 に 就 て は 重視 され るが,無. 機 窒 素 を 同化 し得. な い と され て い る動 物 に於 ては 困 難 で あ る.併 し各 種 動 物 の 肝 臓,鼠. の筋 肉等 に は硝 酸 還. 元 酵 素 は 認 め られ て 居 り,更 に 牛 乳 のxanthineoxidase,aldehydeoxidase等. も硝 酸. 塩 を還 元 し得 る事 は 知 られ て い る.動 物 に 由来 す る之 等 の酵 素 は 硝 酸 還 元 性 とい う受 容 体 特 異性 を持 つ 脱 水 素 酵 素 の一・ 種 で あ るか 叉 は 之 と密 接 な 関 係 を持 ち,何 塩 は水 素 受 容 体 と して作 用 す る と考 え られ る.江E氏(1950)は. れ の場 合 に も硝 酸. 大 腸 菌,牛 肝 臓 の酸 素 吸. 収 が硝 酸 塩 で促 進 され る場 合 には 硝 酸 還 元 酵 素 が 関 与 してい る事 を 明 らか に し,硝 酸 一 硝 酸 還 元 酵 素 が 単 に終 局 の水 素 受 容 休 と してだ け では な く或 る種 の 細 胞 呼 吸 に於 け る 申 問酸 化 触 媒 と して作 用 す る と し・ 所謂 硝 酸 塩 呼 吸 と して の機 能 を強 調 して い る.一 方 家 蚕 に硝 酸 塩,亜 1950).或. 硝 酸 塩 を 添 食 した 場 合 蚕体 内 オ キ シ ム含 量 の増 大 す る事(山 藤,吉 原,和 田, は 弧硝 酸塩 を主 要 窒素 源 と して飼 育 され た 廿 日鼠 の 内臓 オ キ シ ム も 同様 に増 加. す る事(山 藤 ・ 大 村 ・1952)は. 正常 代 謝 に 依 るか 又 は特 に 無機 窒 素 が 過剰 に 与 え られ た異. 常 状 態 に於 て初 め て現 わ れ る現 象 か は 断 定 出来 ない が,少. くと も昆 虫 類 或 は高 等 動 物 に於. て も無機 窒 素 の 同 化 が起 り得 る事 を示 し,硝 酸 還 元 酵 素 が之 に関 与 し てい る事 が 推 定 され る.従 つ て家 蚕 に続 い て 先 ず 当教 室 に於 て 動物 試験 に用 うる昔 日鼠 並 び に 動 物酵 素 剤 と し て最 も広 く一般 に使 用 され る牛 肝臓 の硝 酸 還 元 酵 素 に 就 て概 略 の性 質 を検 討 した. 実 1.・廿日鼠.従. 験. 来エーテル 叉 は ク ロ ロホ ル ムで麻 酔 した後 解 剖 して い たが,麻. 酔 剤 の酵. 素 に 影 響 す る懸 念 もあ り,且 は個 体 が小 さ くて屠 殺 も容 易 で あ る の で麻 酔 剤 の使 用 を避 け, 生 きた ま ま頸 動脈 を切 つ て 出血 死 に 至 ら しめ 直 ち に 内臓(心 臓,肝 臓,腎. 臓,脾 臓)を. 摘. 出 し よ く水 洗 後 之 等 を 一緒 に して 内臓 酵 素 剤 と し,比 較 的 に大 量 得 られ 易 い筋 肉 だ け は別 に し て後 肢 よ り採 つ た. (1)酵 M/15燐. 素 作 用 の確 認 ・ 内臓 及び 筋 肉 を採 取洗滌 後 直 ち に 少 量 の 石英 砂 及 びpH7.4の 酸 緩 衝 液 と磨 砕 調 製 した10%(w/v)懸. をThunberg管. 濁 液5ccと2×10‑2MNaNO:tsccと. 内 で排 気後 混 合 し40。 に …定 時 間 反 応 させ た 後 常 法 に 従 つ て 生 成NO.,. を 測定 した ・ 盲験 区 には100。 に5分. 間 浸 漬 した 加熱 酵 素 液 を用 い たが,第1表. に 示 す様.
(3) 424. に 内 臓 筋 肉 共 に 酵 素 作 用 が 認 め られ,且 Thunberg管. 中 排 気 後40。2時. つ 反 応 は 上 記 条 件 即 ち10‑2MNO,,,酵. 素 量0.5g,. 間 で 十 公 で あ る二 事 が 判 つ た の で 以 後 特 別 の場合 の 外 此 の 条. 件 で 行 つ た. 第1表.反. 応. 10‑2MNO,1,pH7.4,40。,酵素. (2)抽. 出 処 理 の影 響.次. 時. 間. 石 英 砂 を加 え て乳 鉢 中で 十 分 磨 砕 し. 第2表.廿日鼠. 試 験 に は 之等 の酵 素 液5cc宛. 抽. は1回 で 既 に40%,2回. 出. 効. で35%に. し. 渣 酵 素 液 一3等 と呼 ぶ.. 果.. 素 量0.5g,Thunberg管.. を使 用 した が 何 れ も酵 素 剤0.5gi若. 含 有 す る.内 臓 は1回 で70%,2回. 間遠心分 離 し ヒ. じ く残渣 も再 び磨 砕 しなが ら水 に 再 懸 濁15ccと. す る.以 下 同様 に処 理 して残 渣酵 素 液 一2,残. 10‑2MNOa,pH6.0,400,2h,酵. 出 液 に約60%の. 響.. 濁 液 とした(原 酵 素 液).15ccを2500r.P.m.に5分. 澄 液 を 旧量 に 復 す(抽 出 酵 素 液),同 残 渣 酵 素 液一1と. 影. に家 蚕 に於 け る と 同様 に 内臓 並 び に筋 肉 を磨 砕 抽 出 し そ の酵. 素 力 に 就 て 第2表 の結 果 を得 た.即 ち それ ぞ れ29を 水 を 加 え て20cc懸. の. 量0.5g,Thunberg管.. く は 之 に相 当 す る董 を. 抽 出 に よつ て も半 分 以.Eの 活性 を保 持 した が 筋 肉 で 減 じそれ 以 後 は 大 体 一 定 した が,家 寮 組織 と異 つ て抽. 作 用 力 が認 め られ た.Bernheim,Dixon両. 氏(1928)は. 肝1臓筋 肉1≒に. 細 刻 した 後 繰 り返 し洗 つ て も容 易 に水 で 洗 い 出 され な い事 を報 告 して い るが,石 英砂 と共 に磨 砕 し細 胞 膜 を破 壊 す る事 は 行 つ て い な い し叉抽 出液 に就 て の試 験 も無 く,定 性 的 域 に 止 つ て い る. (3)水. 素 供与 体.家. が あ る事 は,内. 蚕 同様 抽 出 に よ る作 用 力 の 減退 の 原 因 の 一 一 ・ 一つ に水 素 供 与 体 の 除 夫. 臓 の残 渣 酵 素 液 一 ・2に 就 て水 素 供 与 体 の 影 響 を検 討 した 第3表 の 結 果か ら. 確 認 され るが 家 蚕 の場 合 とは 異 つ て,枸櫞酸. 〉琥珀酸 〉林 檎 酸 〉乳 酸 の順 に何 れ も約50%. 前 後 の作 用 力増 加 を示 して略 ζ原 酵 素 液 の活 性 近 く迄 恢 復 して い る.続 い て 酒 石 酸 ン フ マ ール 酸 〉α‑ケ トグ ル タル酸 の順 では あ るが 殆 ど影 響 な く,焦 性 葡 萄 酸 及び マ レ イン酸 を 添 加 した場 合 に は却 て作 用 力は 低 下 し阻 害 効 果 を示 した.糖 類 で は ガ ラ ク トー ズ 〉 ラム ノ ー ズ 〉 マ ン ノ ー ズ〉果 糖 〉葡 萄 糖 の順 で あつ て,家 蚕 組 織 で 好 結 果 を 与 え た蔗糖 は キ シ μ.
(4) 425. 第3表,水. 素 供. 10『2MNO3,10'一"2MH一. 与. 体 添. 加. の 効 果.. 供 与 体,pH6.0,40。2h,酵. 一 ズ と共 に 寧 ろ 阻 害 灼 に 作 用 し た .而. 素 量0.59,Thunberg管.. し て 短 時 間 の 反 応 で あ る の で そ れ ぞ れ の 基 質 か ら直. 接 若 くは 中 間 休 を 経 て 水 素 が 与 え られ る と考 え る 事 が 許 さ れ る な ら ば 少 く と も 廿 日 鼠 内 臓 で はCitrico‑一. 一 一,Succino‑,Malico‑,Lactico‑・. Mannose‑dehydrogenaseが. 一,Galactose‑,Rhamnose‑,. 硝 酸 還 元 作 用 に 関 与 し て い る と 云 う事 が 出 来 る.特. に糖 類 に. 於 て体内 代 謝 の 中 間 体 と して 最 も 広 く出 現 を 予 想 さ れ る葡 萄 糖 或 は 果 糖 よ りは ガ ラ ク トー ズ,ラ. ム ノ ー ズ 並 び に マ ン ノ ー ズ に 強 い 効 果 が 認 め られ る の は 興 味 を 感 ず る.此. 動 物 の 種 類 に よ つ て 基 質 効 果 の 序 列 が 異 る事 は,同 村E,1949)か. ら も推 定 出 来 る,叉. ドが 殆 ど 影 響 し な い 点(大. 村,未. の よ うに. じ 大 腸 菌 で も菌 株 に よ つ て 異 る 事 実(. 特 に 焦 性 葡 萄 酸 が 阻 害 作 用 を 示 す 事 は ア セ トア ル デ ヒ 発 表)と. 考 え 併 せBernheim,Dixon両. 氏 の肝 臓 製 品. が 両 者 に よ り促 進 さ れ る事 及 び ア セ トア ル デ ヒ ドの 阻 害 作 用 を 持 つ 江 上 氏 等(1950)の. 牛. 肝 臓 製 品 と も 異 つ た 基 質 特 異 性 を 示 した. (4)最. 適pH.組. 織0.59を. 原 酵 素 液3ccにM/!0緩 後 混 合 し40。2時 肉 で は6.5附. 含 有 す る よ うに 従 来 よ りは 稔. 間 反 応 さ せ て 生 成NO,)最. 近 に 最 適pHの. 稠 密 に 水 に 磨 砕 懸 濁 した. 衝 液5cc,5×10‑'iMNaNO:}2ccをThunberg管. を 比 較 した 所,内 臓 に 於 て はpH6.0〜62,筋. あ る事 が 見 られ た(第1図)。. 緩 衝 液 の 種 類 に よ つ て も 異 る の でpH5‑‑6.2を醋酸 塩 を 用 い 境 界 部 は 重 複 さ せ た.醋酸. 内 で脱 気. 一醋酸. 酵 素 能 は 第4表 ソー ダ,5.8‑7.0の. に示 す よ うに 間 は 燐… 酸. 塩 も 水 素 供 与 体 と し て 作 用 し得 る事 が 推 測 され る が,.
(5) 426. 第4表.緩. 働 液 の 種 類 に よ る 作 用 力 の 相 異.. 10‑1MNO3,40。,2h,酵. 事 実 同…pHに. 素 量O.5g,Thunberg管.. 於 ては醋酸 緩 衝 液 に於 て燐 酸 塩 の 場 合 よ りも作 用 力 が 強 く親 わ れ た ので 図. で は 燐 酸 塩 に補 正 した.江 上 氏 等 の精 製 標 品 は大 腸菌,肝. 第1図1卜. 臓 共 にpH7.4附. 近 に最 大 値 を. 日鼠 酵 素 の 最 適pH. 10‑iMNO3,40。,2h,酵. 素 量0.5g.Thunberg管. 持 つが 単 な る磨 砕 物 で あ る粗 酵 素 品 では 生 体 同様 に 各種 の 基 質 を組 織 に従 つ て種 々 の量 に 含 有 し更 に それ ぞ れ に 応 じた 脱 水 素 酵 素 が 関 与 す る ので 之 等 の綜 合 され た結 果 を 示 す わ け で精 製 品 よ りも生 体 内 の現 象 に近 く反 映 す る の で は な い か と考 へ られ る.内 pHも6附. 近 で あつ て最 適pHの. 値 とほぼ 一致 す る事 は,生. 臓磨砕物 の. 物 組 織 内の 状 態 は 反 応 に 都. 合 の 良 い状 態 に あ る事 を 暗 示す る の で は な いか と考 え る. (5)分. 布.廿. 日鼠 の体 躯 が小 さい た め従 来 内臓 と して一 ・ 一 一 括 使 用 して来 た が一 応 そ の分. 布 を 見 て置 く事 も必 要 で あ つ た.廿 臓0.59,肺. 臓0.59,後. 脚 筋 肉1.29を. 日鼠3頭. よ り心 臓0.59,肝. 臓5.59,腎. 臓1.29,脾. 採 りそ れ ぞ れ 石英 砂 及 び水 で10%(w/v)磨. 砕. 懸 濁 液 を調 製 し各 組織 に含 まれ た 基 質 其 の他 の諸 因 子 を も 考 慮 した 各器 官0,59宛. の酵 素.
(6) 427. 力 を比 較 検 討 した が,第5表. に 示 す よ うに,肝. 臓 に 於 て著 し く強 く筋 肉 及 び腎 臓 に も検 出. され たが 肺 臓 並 び に脾 臓 には 認 め 得 なか つ た.萄 此 の場 合NO2の. 測定には光電比 色計 を. 使 用 した. 第5表.骨. 日鼠 に 於 け る 酵 素 の 分 布.. 10‑2MNO3,40e,2h,酵. 素 量0.59,Thunberg管.. II.牛 肝臓 (1)作. 用 力 の確 認 並 び に抽 出効 果.廿. 日鼠 の場 合 と同様5cc当. り0.59若. くは相 当. 量 を 含 有 す る よ うに水 で磨 砕 抽 出処 理 を施 した酵 素 液 に 就 て作 用 力 を検 討 し た所 明 らか に 酵 素 力 が 確 認 され る と共 に,第6表. に 示 す よ うに家 蚕 組 織,廿. 日鼠 内臓 更 に筋 肉 と叉 異 つ. た特 性 を示 し石 英 砂 及 び水 とよ く磨砕 し2500r.P.m.に10分 大部 分 は溷 濁上 澄 液 に移 り残渣 では 殆 どNO,,の 第6表.牛 10‑2MNO:1,10‑2MH一. 肝. 臓. 間遠心分離すれ ば酵素力の. 生 成 は見 られ な かつ た.然 抽. 出. 効. 供 与 体,pH6.6,40。,酵. も此 の 作 用 力. 果.. 素 量O.59,Tunberg管.. の低 下 は酵 素 自体 の1除去 に基 くもの で単 に水 素 供 与体 が 完全 に抽 出 され たた め では ない 事 は水 素 供 与 体 と して の能 力 の高 い(後 述)ラ. ム ノ ー ズ,グ. リシ ン,マ. 液 に加 え て も作 用 力 は 復 活 しない 事 か ら も明 白 で あ る.術5分間 素 液 を用 いた 盲 験 で は 何 れ の場合 に も勿 論NO,1の. ロン酸等 を残 渣酵 素. 沸騰 水 に浸 漬加 熱 した酵. 還 元 は起 らなか つ た.本. 試 験 に於 け る. 抽 出 酵 素 液 も蛋白 膠 質 液 で あ つ て,酵 素 が文 字 通 り抽 出 され た のか2500r.P.m.に10分 間 遠 心 分 離 して も沈下 しな い 小 粒子 に結 合 した状 態 に止 つ て い る の か は断 定 出来 ず,誤 解 を 招 き易 い が 便 宜上 抽 出 液 と して記 述 した. (2)最. 適PH.廿. 日鼠 の際 と同 じ く江 上 氏 等 とは異 つ て磨 砕 液 のpH6附. を 示 し,生 物 組 織 は 反 応 に適 した 状 態 に あ る との 推 測 を更 に 支持 す る(第2図).. 近 に最 適 値.
(7) 428. 第2図.牛. 肝 臓 酵 素 の 最 適pH. 10‑2MNO.?,40。2h,酵. (3)水. 素供 与 体.肝. 事 は 出来 な いが,特. 素 量O.5g,Thunberg管. 臓 で は 酵 素 も水 素供 与 体 も共 に抽 出液 中 に来 る の で両 者 を分 け る. 定 の基 質 を過 剰 に加 え て反 応 が 促 進 され るな らば 少 くもそ の 基 質 に 関. す る脱 水 素 酵 素 は 関 与 して い る と考 え て よい.そ こ で常 法通 り0.59和 素 液 を用 いNO3の5倍 させ た結 果 を第7表. 量 即 ち5×10‑2Mの に 示す が,表. 当量を含む 抽出酵. 水 素供 与 体 を加 え て脱 気 後40。2時. 中琥珀酸+マロ. 間反応. ン 酸 区 は 半 量 宛即 ち2.5×10‑2M宛. 加. へ 両 者 を合 せ て他 の水 素 供 与体 と等 し くな る よ うに した. 第7表.水 10‑2MNO3,5×10‑2MH一. 素. 供. 与. 供 与 体,pH6.0,400,2h,酵. 体. の. 影. 響. 羅0.59,Thunberg管. .. 糖 類 で は ラ ム ノー ズが最 も強 くガ ラ ク トー ズ〉 マ ン ノー ズ 〉葡 萄 糖 〉果 糖 と続 き糖 ア ル コ ール で あ る マ ンニ ッ トも約10%の 促 進 作 用 を示 した .此 の場 合 に も上 位3者 が廿 日鼠 内臓 に於 け る と同様 広 く出現 を予 想 され る葡 萄 糖 若 くは果 糖 で は な くて ラ ム ノ ー ズ,ガ ク トー ズ 及び マ ン ノー ズ であ つ た.琥珀酸. ラ. 脱 水 素酵 素 の特 異 的阻 害 剤 で あ るマロン酸 単 独.
(8) 429. の水 素 供 与能 も相 当 強 くマロン酸 脱 水素 酵 素 の 存 在 を暗 示 す るが,琥珀酸 に強 く両 者 を半 量 宛 混 含 した 場 合は そ の 中 間 で あ つた.琥珀酸. の効 果 も勿論 更. 添 加 区 に於 け る硝 酸 還 元 が. 脱 水 素 酵 素 作 用 に よつ て 提 供 され た水 素 に よ り行 わ れ る と考 え る と,マロン酸 加 でNO2生. の添 琥珀酸. 成 は 減 少 してい るの で琥珀酸 脱 水 素 酵 素 は 阻害 され た と見 られ るわ け で 何 等. 矛 盾 しな い.若. し或 る脱 水 素 酵 素 が硝 酸 還 元 能 とい う受 容体 特 異性 を持 つ て い るな らば 基. 質 に よる硝 酸 還 元 酵 素 作 用 の促 進 を以 て 脱 水 素 酵 素作 用 力判 定 の一 基 準 とも な し得 る か と 考 え られ,10‑5M或. は それ 以 下 とい う微 小 能 力 を も現 わす 事 が 出来 る だ ろ う.共. の他の. 酸 類 に 就 て は 同 一 の 試 料 で 正 確 な値 が得 られ な か つた の で他 の機 会 に 譲 るが,廿 日鼠 内 臓 で 最 高 の 復 活 効 果 を 示 した枸櫞酸 は 逆 に 阻 害 的 に作 用 した.ア ミ ノ酸 類 で は グ リシ ン,ア ラニ ン共 に 有 効 で あ りア スパ ラギ ン も亦 良好 な水 素 供 与 体 で あつ た.特. に ア セ トア ルデ ヒ. ド及 び そ の還 尤 生 成 物 エ ク ノー ルに よ る 作 用 力 の増 強 は著 し くBernheim,Dixon両 の主 張 した様 に ア ル デ ヒ ド酸 化酵 素 の存 在 を裏 書 きす る もの で あ つ て,江. 氏. 上 氏 等 と相 反 す. る.一 ・ 方 ホ ル ム ア ル デ ヒ ド,メ タノ ール系 列 は グ リー ス試 薬 で 白濁 を生 じ正 確 な測 定 値 は 得 られ なか つ た が,概. 略 影響 は 及ぼ さな い様 で あ つ た.. 之等 の水 素 供 与 体 の 中,代 表 的 な ラム ノー ズ,琥珀酸,ア 果 を 示 した枸櫞酸 の 添 加 量 の 関係 を 求 め た.第8表 を 無 添 加 区 に於 け るNO2生. 成 量 を100と. 第8表.水. 素. 10‑2MNO3,pH6.0,40。,2h,抽. ラム ノー ズはNO:sの2倍. セ トアル デ ヒ ドと共 に 阻 害 効. に は添 加 量 を変 え て生 成 したNO2量. す る相 対 値 で示 した.. 供 与. 体. 添 加. 量. の. 関 係.. 出 酵 素 液0.59,Thunberg管.. 量 迄 は 酵 素 液 中に 本 来 含 まれ て い る水 素 供 与 体 の存 在 の た めか サ. 影 響 な く,4倍. 添 加 す る事 に よつ て初 め て 促 進 効 果 を 若干 示 す に至 り 爾後 添加 量 の増 加 に. 伴 つ て 効 果 も大 き くな る.従. つ て 当初5倍 彙 の 水 素供 与 体 を 加 え た事 は無 意 味 で は な く,. 若 し家 蚕 或 は廿日鼠 に 倣 つ てNO,,と. 等 量 加 え て い た な らば ラム ノー ズの効 果 は 見 出 され. て い な か つ た で あ ろ う.琥珀酸 は2倍 程 度 で 或 る限 界 に達 す る ら し くNQ,と. 等 量 で も術. か な りの 促 進作用 を 示 し酵 素 固 有 の 水 素 供与 体 に比 して優 先 して脱 水 素 酵 素 の作 用 を 受 け る と も考 え られ る.ア セ トア ル デ ヒ ドは非 常 に強 力 な促 進 効 果 を持 ちNO,,の1/10量 に極 大 値 に達 しそれ以上 加 え て も効 果 は 増 加 し ない.而 迄 促 進 して い るが 此 の 時 のNO2の 此 の促 進 作 用 は 勿 論Bemhe1m,Dixon両 が,他. 生 成 量 即 ちNO3の. してNQ引. の1/100即. 還 元 量 は0.3×10‑5Mで. で既. ち10‑「,M あ つ た.. 氏 の アル デ ヒ ド酸 化 酵 素 に よ る と考 え られ る. の脱 水 素 酵 素 の作 用 す る余地 を与 え ず特 に 優先 す る事 を 示す もの と思 わ れ る.一 方 は添 加 黛 の減 少 に 伴 つ て阻 害 効 果 も減 殺 されNO3と. 進 的 に なつ て い る.所 が グ リー ス氏 試薬 に よ るNO2の. 等 量若 くは2倍 量 で は却 て促 枸櫞酸. 呈 色 は第9表. の よ うに枸櫞酸 に よ.
(9) 430. つて妨害 され る事 が判つたの碩 第9表. のNα. に 示 す よ うに な り,NO,,還. 激. 一饗 諜 に よつ て 概. 元 に 及 ぼ す枸櫞酸. 第9表.枸櫞酸. の. 影. す ると第8表 の齢. の 阻 害 効 果 は 実 際 は 単 な るNO,・. 響. 補. 正.. 色 の妨 害 で あつ て,酵 素 作 用 へ は 寧 ろ促 進 的 に働 い て い る よ うに思 わ れ る.此 成NO2の. 呈. の よ うに生. 判 定 を妨 害 す るた め外 観.E酵 素 作 用 を阻 害 す るか の 結 果 を示 す 物 質 の他 の好 例. は ア ス コル ビ ン酸 で あつ て,第7表. に 示 す よ うにNO2の. 作 用 を 阻止 す る よ うに思 わ れ るが,反. 生 成 が 見 られ ず 一 応 完全 に酵 素. 応 条 件 に従 つ て5×10‑2Mの. ア ス コ ル ビ ン酸 を含. 有 す る2×10‑5MNaNO2水 溶 液 は グ リー ス 氏 試 薬 に よつ て全 く呈 色 しな か つ た.ア ス コル ビン酸 がNO,)を 破 壊 す るか 叉 は グ リー ス 氏 試 薬 と反 応 してNO,,の 呈色を阻止す る の で,NO,,の. 還 元 に も影 響 す るか 否 か は判 定 出 来 な い.従. つ てGreen氏. 等(1934)が. 酸還 元 酵 素 反応 に於 け る中 間伝 達 体 の検 索 に 際 して否 定 的 結 果 を得 て い るが,或. 硝. は原因が. 此 の よ うな点 に あ るの か も知 れ な い. (4)カ. ル ボニール 化 合 物 及 び そ の オ キ シ ム の 影響.ア. 進 効 果 を示 しBernheim,Dixon両. セ トア ル デ ヒ ドが 特 に 著 し い促. 氏 の ア ル デ ヒ ド酸 化 酵 素 の役 割 を 強 調 す る 結 果 と一. 致 し江 上 氏 等 の場 合 と相 反 した.ア セ ト アル デ ヒ ドは 酸 化 され て醋酸 を 生 じ還 元 され る と エ タ ノー ル に変 化 す る.若 し前 者 が 起 れ ば 水 素 を与 え て 促 進 的 に 作 用 し後 者 で あ れ ば 同様 に水 素 受 容体 と して作 用 す るた め に硝 酸 還 元 を拮 抗 的 に 阻 害 す る事 に な り,此 の何 れ が 起 るか は酵 素 製 品 に共 存 す る 関係 酵 素 に支 配 され る と思 わ れ る.此 ドの み な らず 焦 性 葡 萄 酸 やα‑列. の よ うに アセ トアル デ ヒ. ・グ ル タル 酸 の よ うな ケ ト酸 も生 体 内代 謝 現 象 の 中 間体. と して 極 め て 重 要 な 役 割 を演 ず るの で 之 等 の 影 響 を 更 に検 討 した.常 NO,,の5倍. 量 の カル ボ ニ ール化 合 物 並 び に そ の オ キ シ ム を加 え た.カ. と しては 純ケトン と して最 も簡 単なアセトン,ケ びα‑ケ. トグ ル タル酸,ア. 法 通 り抽 出酵 素 液 に ル ボ ニ ール化 合 物. ト酸 と して 生理 的 に 重 要 な焦 性 葡 萄 酸 及. ル デ ヒ ドと して ア セ トアル デ ヒ ドの4種 を選 び 同時 に それ ぞ れ. の オ キ シ ムを用 い た.第10表. に そ の結 果 を示 す が アセ トンは 殆 ど影 響 せ ず 焦 性 葡 萄 酸 は. 強 い 阻害 作 用 を示 した が,同. じ く中 間体 と して 同様 に 電 要な 作 用 を持 つ α ケ トグ ル タル. 第10表.カ 10‑2MNO3,5×10一2M供. ル ボ ニ ー ノし化 合 物 並 に オ キ シ ム の 影 響. 与 体,pH6.0,40。,2h,酵. 素 量0.59,Thunberg管..
(10) 431. 酸 は 賦 活 作 用 を 持 つ.ア セ トア ル デ ヒ ドは 勿論 強 力な 促 進 作 用 を 示 す が 之等 の オキ シ ムは 何 れ もそ れ 等 の 作 用 を 減 殺 す る傾 向 を持 ち促 進 的 に作 用 した ア セ トオ キ シ ムは 別 と して, 生 理 的 意 義 を 持 つ焦 性 葡萄 酸,α‑・ ケ トグ ル タル酸,ア. セ トア ル デ ヒ ドの 各 オ キ シ ムは 何. れ も阻 害 効 果を 及 ぼ す事 は注 目す べ き で あ る.先 に 当 教 室(山 藤,1950;山. 藤,川. 上,篠. 原,1952)に 於 て オ キ シ ム よ りア ミノ化 合 物 へ の転 移 を触 媒 す る酵 素 が 発 見 され オ キ シ マ ーゼ と命 名 され た が そ の 変 化 機 構 に 関 して は 一 応 次 の2式 が考 え られ る.ケ ト酸 オ キ シ ム を例 と し, R‑C‑一. 一 ・COO且R‑CH‑COOH. I【. 十H20=1・. 十. 〇2(1)NOHNH. ,. 一方硝酸還元作用は HNO3十H2=HNO,)十H20(3) に 従 うが 蝕 でH2は. 再 三 述 べ た よ うに水 素 供 与 体 よ り脱 水 素 酵 素 を介 して 与 え られ る.若. しオ キ シ マ ー ゼが(2)式. に従 うな らば 硝 酸 還 元作 用 と同 一 一の機 構 が予 想 され,硝. 酸還 元. 酵 素 が 硝 酸 還 元 性 とい う受 容 体 特 異 性 を持 つ 脱 水 素 酵 素(群)と 考 え られ る よ うに オ キ シ マ ーゼ も,オ キ シ ム還 元 性 を受 容 体 特 異 性 とす る脱 水 素 酵 素(群)で あ る との推 測 も可能 で あ る.硝 酸還 元 酵 素 と オキ シ マ ーゼ が全 く異 る もの で あ るか 或 は オ キ シ マ ーゼ作 用 ほ水 素 受 容 体 と しての 硝 酸 塩 を オ キ シ ムに 置 換 した硝 酸還 元酵 素 作 用 の 別 の 面 を 示 す もの で あ るか は 今 後 の研 究 に 倹 つ が,何. れ に して も硝 酸 塩 の受 取 るべ き水 素 を共 存 す る オキ シ ムが. 拮 抗 的 に奪 い そ のた めNO:sの. 還 元 が 妨害 され る と考 え て よ く,水 素 供与 体 の 影 響 は 例 え. ば ア セ トア ル デ ヒ ドは家 蚕 に於 ては 阻 害 し牛 肝 臓 で は 著 し く促 進 す る よ うに 動物 に よつ て 異 るが,オ. キ シ ム の阻 害 効 果は ノ ト肝 臓 のみ な らず 廿 日鼠 内臓,家 蚕,鶏. 肝臓等に共通す る. 事 か ら も推 定 され る. 叉 焦 性 葡 萄 酸 は アセ トア ノ レデ ヒ ドに 変 化 して強 い促 進 作 用 を示 す とい う事 をBernheim, Dixon両. 氏 は主 張 して い るが,第10表. の よ うに廿 日鼠 と同様 に阻 害 作 用 を示 し之 も焦 性. 葡 萄 酸 が脱 炭 酸 され て ア セ トア ル デ ヒ ドに 変 じて か ら 促 進 効 果 を 及 ぼ す とい う事 よ りも, 直接 水 素 受 容体 と して 水 素 を拮 抗 的 に奪 つ て 乳 酸 を生 ず るた め と考 え られ,動. 物 組 織 に於. け る カルボ キ シ ラ ー ゼ と乳 酸 脱 水 素 酵 素 の分 布 役 割 等 を考 え合 わ せ て寧 ろ此 の方 が 普 遍 的 で あ る様 に思 わ れ る.. 総. 括. (1)背. 日鼠 内臓 及 び筋 肉 並 び に牛 肝 臓 に硝 酸 還 元 酵 素 作 用 を確 認 した.. (2)廿. 日鼠 内臓 の 硝 酸還 元 酵 素 力 は2回. で は約35%が. 残 存 し60%は. 磨砕 抽 出 に よつ て約1/2に. 減 少 し,一 方筋 肉. 抽 出 され た ・此 の場合 に も減 少 の原 因 の一..一 つ に水 素 供 与 体. の除 去が あ る事 を確 か め た.他 方 牛肝 臓 の酵 素 は大 部 分 抽 出 され た. (3)水. 素 供 与 体 の効 果 は廿 日鼠 内臓 に 就 て は,枸櫞酸. 〉琥珀酸 〉林 檎 酸 〉乳 酸 の順 に.
(11) 432. 促 進 作 用 を 示 し 酒 石 酸,フ. マ ー ル 酸,α. マ レ イ ン 酸 は 阻 害 的 に 作 用 した.一 果 糖 の 順 で あ つ た.叉. ・ケ ト グ ル タ ル 酸 は 殆 ど 影 響 な く 焦 性 葡 萄 酸 及 び. 方 糖 類 で は ガ ラ ク トー ズ 〉 ラ ム ノー ズ 〉 マ ン ノ ー ズ ン. 牛 肝 臓 に 於 て は 糖 類 で は ラ ム ノ ー ズ ン ガ ラ ク トー ズ 〉 マ ン ノ ー ズ ン. 葡 萄 糖 〉 果 糖 〉 マ ン ニ ッ トの 順 で あ り,琥珀酸,マ ア ラ ニ ン の 順 に 窒 素 化 合物 も 有 効 で あ る が,最. ロ ン酸 の 外 ア ス パ ラ ギ ン 〉 グ リシ ン ン も 強 力 な 促 進 作 用 を 示 した の は ア セ トア ル. デ ヒ ド,続 い て エ タ ノ ー ル で あ つ た. (4)酵. 素 作 用 の 最 適pHは. も磨 砕 液 のpHに (5)廿. 廿 日鼠 内 臓6.0〜6.2,筋. 肉6.5,牛. 肝 臓6.0附. 近 と何 れ. 近 い 点 に あ つ た.. 日鼠 の 酵 素 作 用 は 肝 臓,筋. 肉,並. び に 腎 臓 に 検 出 され 心 臓,脾. 臓 及 び肺 に は 見. 出 され な か つ た. (6)カ. ル ボ ニ ー ル化 合 物 中,ア. セ トア ル デ ヒ ド及 びα‑一 ケ トグ ル タル 酸 は 促 進,焦. 性. 葡 萄 酸 は 阻 害 的 に 作 用 し た が 之 等 の オ キ シ ム は 何 れ も そ の 影 響 を 減 殺 す る 傾 向 を 示 しf'1.つ NO,壼 の 還 尤 を拮 抗 的 に 阻 害 す る よ うに 思 わ れ た. 終 りに実験 に 協 力 され た 三 浦 道 雄 氏 に 厚 く感 謝 す る.. 文. 献. Bemheim,F.&Dixon,M.(1928):Biochem.J.,22,125. 江 上 不 二 夫(1950):酵 江 上 不 二 夫,鈴. 木 旺,丹. 素 化 学シンポジウム,4,3. 羽 充,佐. 藤 了(1950):日. 化,71,226.. Green,D.E.,Stickland,L.H.&Tarr,H.L.A.(1934):Biochem.J.,28,1812. 村 上 枝 彦(1949);酵素. 化 学シンポジウム,2,10.. (1950)=Nature,167,770. 山藤一雄 山 藤 一 雄,吉 ,川 山 藤 一 雄,大. 原 典 子,和. 田 春 子(1950):Enzymologia,14,170.. 上 哲 夫,篠. 原 弘 次 山藤一雄 郎(1952):Enzymologia,15,199.. 村 浩 久(1952):E船zymologia,15,296.'. Summary Maus-organ (liver, kidney, heart and spleen) and maus-muscle of the hind legs of the same body were repeatedly washed with sterilized water, mixed with small amount of quartz sand, grounded thoroughly in mortar and made up 10 % (w/v) suspension with M/15 Sorensen's phosphate buffer solution of pH 7.4. Ox-liver suspension was prepared with water as in the above procedure and its pH was 6.0. 5 cc of each enzyme solution was mixed with 5 cc of 2x 10-2 M NaNOs solution after careful evacuation in Thunberg's tube, placed the tubes in a water bath at 40°. As control, enzyme solution which had been previously heated at 100° for 5 min. was used. After 1 and 2 hrs. the mixture was heated in the same manner to stop the reaction, added a few drops of.
(12) 433. conc.aceticacidandcentrifuged.ThecolourimetricestimationofNOzformed intheclearsupernatantliquidwascarriedoutintheusualway.Theresults wereasfollows.. Itcallbeseenfromthedataintheabovetable,thatthedetectablequanti‑ tyofNO2wasproducedfromNO3bythecatalyticactionofthesetissue suspension,inotherwords,theexistenceofthenitratereductaseinthese tissueswascon丘rmed. Thentheeffectofextractionwithwaterontheenzymeactivitywasstu‑ diedasforthesilk‑worエn.Theaqueoussuspensionofgroundtissuewas de且nedasoriginalenzyme(0・E).Acertainvolumeof0.Ewascentrifuged andthesupernatantfluidrestoredtooriginalvolumewithwater,anditwas calledextract・enzyme(E・E)andresuspensionofresiduehavingthesalnevolu‑ mewasnamedresidue・enzyme‑1(R・E・1).Thesuspensionofresiduewhich wasextractedtwotimeswasresidue・enzyme・2(R‑E‑2)andsoon.Each5cc oftheseenzylnesolutionscontainedO.5gtissueorcorrespondingamountsof residueorextractedmatter.Inthenexttable,therelativeactivityofthe nitratereductaseoftheseenzymesolutionswerepresented:. Theabovetableteachesusthatthenitratereductaseactivityofmaus‑or‑ gandecreasedtoabouthalfbyextractingtwice,whilethatofthemuscleof thesameanimalwasextractedabout60%and40%ofthatretainedinresidue andbytwice‑treatingabout35%wasinvolved.Tocontrastthesethings,a1‑ mostwholereductaseinox・liverwasenteredintoextract. Theoptimu】. 〔nactionofthereductaseofbothmaus‑organandox・1iveroc‑. curredatpH6.0〜6.2whichisclosetothepHofhomogellateofthesetissues. Ithasbeenfoundtoincreasetheiractivitybyadditionofvarioussub‑ stances.TothereactionmixturewithR・E‑20fmaus‑organthesamequantity ofsomeacidsands・ugarsasnitratewasadded.Therelativeactivitieswereas.
(13) 434. follows.. On the other hand, the substances which were five times amounts of nitrate were supplied to reaction mixture with E-E of ox-liver because I doubted if the addition of equal quantity of H-donator cause activation, for E-E contained both enzyme and substrate and the effect of substrate added would be hindered. To contrast to maus-organ and silk-worm the restoration of activity was attained according to the following order : rhamnose, galactose, mannose, glucose, fructose and marmite. The rate of activation, however, were also within 50% accorded with that of maus. Succinic acid and malonic acid which is specific inhibitor of succinodehydrogenase also had high ability of about 2.7 times and 1.9 respectively and by addition of each half amounts of both acids the rate lied between both. Some nitrous compounds such as glycine, alanine and asparagine caused the stronger reactivation. But the most effective one was acetaldehyde having 8-fold rate and the next its reduction product, ethylalcohol, with 4.3 times. On the other hand, citric acid showed the inhibiting action and in case of addition of ascorbic acid NO2 was not detected. However, in pure solution citric acid decreased the rate of coloration of NO2. Therefore, when one thought over above, it is found that the citric acid also have H-donating capacity even small. NO2 solution containing ascorbic acid developed no red colour with Griess's reagent. Now the influences of carbonylic compounds on the enzyme were studied. As seen from data in the table,. though. acetaldehyde. inhibitory, oximes fore,. oximes would. nitrate. and of these. receive reductase. lyze the conversion. a-- ketoglutaric compounds. hydrogen and. of oximes. from. oximase, to amino. acid were. acted. actively. inhibitingly.. H-donators discovered compounds,. and. would. acid. that. these. I assumed. competitively in my. pyruvic. laboratory, be the. with. NO;,, therewhich. same. cata-. enzyme..
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