オキシムの酵素的酸化還元について

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(1)九州大学学術情報リポジトリ Kyushu University Institutional Repository. オキシムの酵素的酸化還元について 萱嶋, 泉 九州大学農学部. https://doi.org/10.15017/21517 出版情報:九州大學農學部學藝雜誌. 18 (1), pp.25-34, 1960-10. 九州大學農學部 バージョン: 権利関係:.

(2) オ キ シ ム の酵 素 的 酸 化 還 元 に つ い て 筬島豊. On the enzymatic. oxidation Yutaka. 最 近 我 々 は オ キ シ マ ー ゼ6)(オ. and reduction. of oxime. Osajima. キ シ ム 還 元 酵 素)活. 性 を そ の 補 酵 素DPNの. 変化に よ り. 分 光 光 度 計 を 用 い て 測 定 す る 方 法 を 確 立 し,酵 素 活 性 の若干 を 調 べ た7)し は 酵 素 的 に 還 元 さ れ る だ け で はな く,酸. か るに オ キ シ ム. 化 を も受 け る こ とを 見 出 した の で こ こに そ の結 果. を 報 告 す る. 実 験 方 法,試 Glucose‑oximeの. 合成. 合 成 法 と し て はWoh1氏. の 方 法5)が 知 ら れ て い る が,こ. に 溶 か す た め 糖 を 加 え る 際 ア メ状 化 し 易 く,オ 生 じ た 粘 着 性付着物 0メ. 煮 沸 溶 解 後 急 冷 再 結 さ せ る 方 法 を 考 案 し た.し. つ て し て も長 日 を 費 し,少量 よ うな 改 良 法 を 案 出 し,よ. m1無. の 結 晶 し か 得 られ な か つ た.我. 無 水 ア ルコール. か し こ の改 良 法 を も. 々は さ らに検 討 した結 果 次 の な わ ち,28gの. を 大 型 乳 鉢 に と り磨 砕 し な が ら こ れ に200. 金 属 ナ ト リ ウ ム を 溶 解 さ せ た 溶 液 を 暖 か い うち に 徐 々 に 加 え. 示 薬 と し て フ エ ノ ー ル フ タ レ イ ン を 一 滴 加 え 赤 変 し な い よ う注 意 す る).少. 生 じ た 食 塩 を 濾 別 し,200ml無. 時 後,. 水 ア ル コ ー ル で 洗 う・ 濾 液 を ウ オ ー タ ー バ ス 上6'て 還 流. 冷 却 器 を つ け て 沸 騰 さ せ な が ら粉 末 無 水 グ ル コ ー ス609を 〜3日. 水. 研 究 室 に お い ては. り高 純 度 の結晶 を 大 量 に 得 る こ と が 出 来 た.す. よ び200m1の. 水 ア ル コ ー ル に89の. る(指. の 方 法 で はNH20H・HC1を. キ シ ム を 結 晶 し難 い.当. を 永 く冷 蔵 庫 に 放 置 す る こ と に よ り結 晶 化 さ せ,1,2)こ の 結 晶1gを60. タ ノ ー ル15mlに. NH20H・liClお. 薬. 加 え る(完. 全 溶 解)・37℃. に2. 保 持 後 冷 蔵 庫 へ 移 す と徐 々 に グ ル コ ー ス オ キ シ ム の 結 晶 を 器 壁 に 析 出 す る.. 再結. 充 分 析 出 後 加 温 濾 別 し40〜509の. 結 晶 を 得 る ・ これ を 少 量 の30%. に 加 温 溶 解 し無 水 ア ル コ ー ル の 大 量 を 添 加 し放 置 す る と徐 々 に 再 結 す る.こ す 時 は そ の 遊 離 ヒ ドロキ シ ル ア ミ ン は0.2〜0.002%と DPN:Lepageの DPNH:上. 方 法3)に 記DPNを. よ りイースト. アル コ ール れ を3度. 繰返. な る.. か ら調 製 し た(純. 度25〜30%)・. ヒ ドロ ズ ル フ ィ ッ ト叉 は ア ルコール. デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ に よ り還. 元 し た. TPN:NutritionalBiochemicalscorporation製(純 TPNH:上 Fnn:ワ. 記TPNを. 度90%保. ヒ ド ロ ズ ルフィット. カ モ1・製 薬 製(純. FMN:Theorelleta1.の も の で 純 度700fで. 度90%)を. 障)を. 用 い た.. に よ り還 元 し た ・. 使 用 した ・. 方 法4)に よ り肝 臓 か ら調 製 し ク ロ マ トパ イルYTよ あつた・. り精 製 し た.

(3) 上 記試 薬 は 実験 に 当 り各 々100%純度. に換算 した 量 を 用 いた.. 酵 素 の調 製 新 鮮 鶏 肝309を90mlのM/10燐 抽 出 後遠 沈上清 を得る.こ に 加 え,生. 酸 緩 衝 液(pll7.5)中に. じた 沈澱 を遠 沈除 去 す る.上清. ン33〜55%で. ホモ ジ ネ ート し,35'℃30分. れ に そ の半 最 の冷 却アセトンC‑15℃)を. 冷 却 槽 中 に て,徐. 々. に さ らに その 半 量 の冷 却 ア セ トン を加 え,ア セ. 沈 澱 す る部 分 を得 る.こ れ を57%冷. 却アセトン に て3回 洗 浄 す る(収ト. 量3〜59). 酵 素 液 の調 製 酵 素19を20mlの. 水 に 溶 か し3時 間 流 水 透 析 後 遠 沈 した 上清 を酵 素 液 と した.本 酵 素. 液 中 の蛋白 態 窒 素 量 は 銅 一Folin法に よ り,Nrin1.Orn1≒200〜300rで 測. あ つ た.. 定. 反応 液 の340mμ 化 値(△E)よ. に お け る吸 収 の 変化 に よつ た.但. し,特 記 せ ぬ 限 り数 値 は 完 全系 の変. り基 質 を除 い た系 の変 化 値 を差 引 い た値 を示 す もの とす る.. 反応条件 反 応 温 度 は30℃,反. 応 時 間 は30分. と した. 結果 並 びに考察. 酸 化 お よび 還 元 酵 素 の 存 在 につ い て オ キ シ マ ーゼ の測 定 は 初期6)に お いて は,0℃. ア セ トンお よび室 温遠 心 機 を 用 い て調 製. した酵 素(大 部 分 水 に不 溶)を 流 水 透 析 後 遠 沈 し,上 清 は 捨 去,沈 散 す る こ とに よ り得 た 遠 沈上 清 を 酵 素 液 と して 用 い た が,次. の実 験 に お い て は この酵 素 を. 水 に 溶 か し流 水 透 析,遠 沈 した上 清 に つ い て 測 定 した と ころ第1表 第1表.透. 反 応 液 組 成:遠 DPNを. 析. 上清. の. 活. 澱 部 を燐 酸 緩 衝 液 に 分. の よ うな結 果を得 た.. 性.. 沈 上 清1.Om1.0.025%DPNII1.Om1(不11)lilll:0). 含 む),0.005%F.ADO.5m',10‑3Moxime1.Om1,M/10. phosphatebuffer(pll7.5)1.Oml.. 上 表 は従 来 捨 去 して い た透 析 上 清 に もオ キ シ マ ーゼ活 性 が 含 まれ る こ とを示 し,さ. らに 燐. 酸 緩 衝 液 を加 え な い場 合 の反 応 の逆 行 は 燐 酸 塩 が オキ シ ム還 元 機 構 に あ る重 要 な機 能 を 果 して い る こ とを暗 示 し て い る.そ. こ で燐 酸 塩 濃 度 の影 響 を 試 験 す るた め,酵 素 調 製 法 に 述. べ た 可溶 性酵素 を 用 い て次 の よ うな結果 を得 た. 第2表 か ら明 らか な 如 く,アセトン. 分 別 酵 素 を 水 に 溶 か した 本 酵 素 液 は 充分 量 の 燐 酸 塩. を加 うれ ば オ キ シ ー マー ゼ活 性 を 示 す が,2×10‑4M以 み な らず 逆 にDPN→DPNH(340mμ. 下 の塩 濃 度 で は 活 性 を 示 さな い.の. に お け る吸 収 の 増 加)な. 酸 化 を 示 す よ うな 反応 が起 つ た こ とに な る.こ. る反 応 つ ま りオ キ シ ムの. の 才キ シ ム の酸 化 お よび 還 元 とい う相 反 す.

(4) 第2表.燐. 反 応 液 組 成:酵. 酸. 塩. の. 素 液1.Oml,0.025%DPNII(相. 影. 響,. 当量. のDPNを. 含 む)1.Oml,0.005%FADO.5m',pli7.5phosphatebuffer (M/10)1.Oml.. る反 応 は,こ の実験 か ら考 え られ る よ うに 燐 酸 塩 に よつ て の み 支 配 され る可逆 反応 な の か, それ と も別 個 の酵 素 作 用 に よ る ものか を調 べ るた め 次 の よ うな 一 連 の実 験 を試 み た. 第3表.緩. 反 応 液 組 成:酵. 衝 液 の 種 類 と反応 の指 向性.. 素 液1.Om1,0.013%DPNIIO.5m1,0.013%DPN. O.5m1,0.005%FADO.5ml,10一3MGlucose・oxlme1.Om1,pH7.5 Buffersoln*:1.Om';Phosphate・10‑IM,Acetate・5×10‑lM, Pyrophosphate・10‑3M,Arsenate・10'‑3M,Borate・10‑3M, Veronal・6×10‑一 "注"!1rsenat. 『2M,Tris・5×10‑2M. .e,Borate等. は340m!tの. 吸 収 を 阻 害 す る の で. 稀 薄 溶 液 を用いた.. 第3表. に 示 す よ うに オ キ シ マー ゼ 活 性 は 燐 酸 塩 を 加 え た 時 だ け に み ら れ る,一 方 ト リス,. べロ ナ ー ル,醋酸. の 各 緩 衝 液 を 使 用 す る と オ キ シ マ ー ゼ 作 用 は み られ ず,オ. キ シ ムの 酸化.

(5) が 観 察 さ れ る よ うに な る.し 元 反 応 つ ま り オ キ シマーゼ. か し こ れ ら の 場 合 も反応 系 に 燐 酸 塩 を 加 え,てや る と やは り還. 作 用 が 観 察 さ れ る よ うに な る.父. 砒 酸,硼酸,ピロ. 燐 酸 等 で は,. 両 反 応 と も む し ろ 阻 害 さ れ る 模 様 で あ る. こ れ ら の 実 験 結 果 か ら,オ はトリス,ベ. ロナ ー ル,醋酸. キ シ ム 還 元 反 応 の 測 定 に は 燐t1液. を,酸. 化 反応 の測 定 に. 等 の緩 衝 液 を 用 い れ ば ・ 各 々の 酵 素 作 用 が 測定 され る こ とが容. 易 に 理 解 出 来 る で あ ろ う. 第 4表.酸化反応と緩衝液の種類.. 反 応 液組成:酵. 素1夜1.Om1,0.025%DPN1,0m1,0,005%FAD. O.5rril,10̲3MGIucose‑oxime1.Oml,pll7.5Buflcr1.Oml. *Bufferの. 第4表 は 第3表. 濃 度 は 第3表. に 準 ず る. と異 り,DPNHを. .. 加 えず,DPNの. み を 加 え た 反 応 系 に対 す る緩 衝 液 の. 影 響 を 調 べ た も ので あ り,従 つ て酸 化 反 応 に 対 す る 影響 だ け が 観 察 され る こ とに な るわ け で あ る・ 燐 酸 塩 は 酸 化 反 応 を 阻 害 す る ら し く ト リス緩 衝 液 を 与 え た 場 合 も これ に 燐 酸 塩 を 加 え る と吸 収 の変 化 は 測 定 され な くな る.又.オ キ シ ム酸 化 反 応 の測 定 に は ト リス緩 衝 液 を 使 うのが 最 も有 利 の よ うで あ る.従 つ て今 後 還 元 反 応 の測 定 には 燐 酸 緩 衝 液 及 びDPNH, 酸 化 反 応 の 測定 に はト リス緩 衝 液 及びDPNを. 用 い る こ とにす る.. す で に報 告 した よ うに,7)オ キ シ マ ーゼ は他 の オキ シ ム例 え ばpyruvate‑oxime等 元 す る.こ の場 合DPNHの. も還. 酸 化 が 酵 素 剤中 に存在 す る乳 酸 脱 水 素酵 素 と オ キ シ ム中 に 混. 在 す るか も知れ な いpyruvateに. よ る ので は な い か との 疑 い を 生 ず るで あ ろ う・ この 疑 問. は しか しなが ら第3表 に 示 した よ うに,乳 酸 脱 水 素 酵 素 の 活性 が得 られ る筈 の醋酸,ピロ 燐 酸,ト. リス の各 緩 衝 液 中 で オキ シマ ーゼ 活性 が得 られ な い こ と,さ. らに 次 の第5表. に示. す よ うに 両 者 を同 ・ 条 件 で 比 較 して み る と両者 の 差 異は 一層明白 とな り,オ キ シマーゼ 活 性 と乳 酸脱 水素 活性 とは別 個 の もの で あ る と云 い得 る. 弟5表.Pyruvate‑Oxin2eとNa‑pyruvate.. 反 応 液 紺 成:酵. 素 液1.Om1,0.013%DPNIIO,5rn1,0.013%. DPNO.5m1,0.005%FADO.5m1,10‑3MSubstrate1.Om1, pH7.5Buffer1.Oml.. 又 同 じ こ とはGlucose‑oximeの. 酸 化 とブ ドウ糖 脱 水 素 酵 素 との 関係 に つ い て も云 え る.. ブ ドウ糖脱 水素 膵素D活 性 は通 例 燐 酸緩 衝液中 で測 定 され る のに 反 し,オ の 活 性 は 燐 酸塩 中 で は観 察 され ず,む. キ シ ム酸 化 酵 素. しろ阻害 され る こ とか ら両 者 は 明 らか に 異 な る も の.

(6) で あ る(大 村 浩 久他."ブ. ドウ糖脱 水素 酵素 及 び カル ボ キ シ ラー ゼ に対 す る オ キ シ ム の 影響". 九 大 農 学 部 学 芸 雑 誌 第17巻. 第4号415頁. 参 照 の こ と).. オ キ シム 酸 化 酵 素 の 性 質 につ い て オ キ シ マ ー ゼ につ い ては 既 に 報 告7)さ れ て い るが 酸 化 酵 素 との比 較 上 そ の 性質 の若 干 を記 載 す る.. 第1図.酸. 反 応 液 組 成;酵. 化. 反 応. 時. 間. 曲 線.. 素 液1.Oml,0.025%DPNl.Om1,10一3MGIucose‑. oxime1.Oml,5×10‑2MTrisbuffer(pH7.5)1.Oml.. 第6表.DPNとTPN.. 反 応 液 組 成:第1図 1.Om'を 加 え た.. に 準 ず る もDPN,TPNと. 第6表 に 示 す よ うに 酸 化 反 応 に お け る補 酵 素 と してTPNは マ ーゼ の場 合 と同様 で あ る.. も0.0130/液. 無 効 で あ る・ これ は オ キ シ.

(7) 第7一. 反 応 液 組 成:酵 0,005%FAD又 7.5)又. 表.フ. ラ. ビ. ン. の. 効'"1¥.. 素 液1.Oml,0.025%DPNII又. はDPN1.Om1,. はFMNO.5ml,5×10‑2MTrisbttfCer(pll. は10一1MPhosphatebuffer(pH7.5)1.Om/.. 第7表 か ら明 らか な如 く オキ シマーゼ 作 用 はFADの シ ム酸 化 酵 素 作 用 は 賦 活 され な い.オ FADの. 添 加 に よつ て賦 活 され るが,オ. キ. キ シ マ ーゼ の場合 酵 素 剤 を さ らに 硫 安 分 画 す る と. 賦 活作 用 は一 層 い ち ぢ る し くな り第8表. に示 す よ うに最 早やFADを. 加え ない と. 反応 を起 さな くな る.. 第8表.硫. 反 応 液 組 成:酵. 安 分 画 オ キ シ マ ー ゼ とFAD,. 液 素(硫. 安 分 画 酵 素)1.Om1,0.013%DPNIIl.Om1,. 10一3MGlucose‑OXIIIII'.1.Om1,navih液0.5m1,10'『IMphosphate buffer(pll7,5)1.Om/.. 第9/表.酸化. 反 応 液 組 成:酵. 反 応. と 基 質 濃 度.. 素 液1.Om1,0.025%DPN1.Om1,5;10‑‑2M. Trisbし1frer(pll7.5)1.Om1,0xime液1.Om1.. 第2,3図. に 示 す よ うに 両 酵 素 と も30°‑35℃. に 反 応 至 適温度を. 有 し て い る が,40℃. に な る と 著 る し い 違 い を 示 す よ うに な る,す な は ち オ キ シ マ ー ゼ 活 性 が30℃ %し. か 示 さ な くな る の に 対 し て 酸 化 酵 素 は 依 然 と し て90%の. ま り酸 化 酵 素 ン)方が 熱 に 対 し よ り安 定 の よ うで あ る,こ. で の 活 性 の40. 活 性 を 保 持 し続 け て い る.つ. の関 係 を 一層 明 らか に す るた め に. 酵 素 液 自 身 の 耐 熱 性 を 調 べ て み た. 第4,5図. は 酵 素 液 に 等量 の1%Na2CO3‑HC1緩. 衝 液(PH7.5)を加え各温度. 処 理 した 酵 素 液 に つ い て そ の 活 性 を 比 較 し た も の で あ る.. で5分. 門.

(8) 第2図.酸. 化 反 応 と 反 応 温 度・. 反 応 液 組 成:第1図. に 同 じ.. 第 3図.還元反応と反応温度. 反 応 液 組 成:酵. 素ll斐1.Orn1,0.025%DPNH1.Om1,0.of,UFAD. O.4m',10一3MGIucose‑oxime1.Om1,10‑1MPhospatebuffcr 1.Om/.. 40℃5分. の処 理 に よつ て オキ シ マ ーゼ 活性 は そ の62%が. では 逆 に20%活. 性 増 とな つ て い る.こ の こ とは 第2,3図. 失 わ れ るの に 反 し,酸 化 酵 素 を 良 く説 明 す る と と もに オ キ. シ マ ーゼ とオ キ シ ム酸 化 酵 素 とが 別 個 の存 在 で あ る こ とを示 す よ うであ る. 従 つ て,反 応 前 に 酵 素 液 を 予 め40℃5分 出来 る訳 で あ る.. 処 理 す れ ば オキ シ マ ーゼ 活 性 の大 部 分 を除 去.

(9) 第4図.酸. 化. 酵 素. 反 応 液 組成:第2図. 第5図.還. 元 酵. 素. 反 応 液 組 成;第3図. の. 耐. 熱 性.. に同 じ.. の 耐. 熱. 性.. に同 じ.. 酸化還元反応について 以 上 の 実 験 か ら本 酵 素 剤 中 に は オ キ シ マ ー ゼ の外 に,オ とが 明 らか と な つ た.オ. キ シ ム酸 化酵 素 を含 ん で い る こ. キ シ ム還 元 反 応 は 燐 酸 塩 を 必 要 と し オ キ シ マ ー ゼ で 営 ま れ る.一. 方 酸 化 反 応 は オ キ シ ム 酸 化 酵 素 に よ つ て 行 な わ れ 燐 酸 塩 に よ り阻 害 さ れ る よ うで あ る. 第6図. は こ の 関 係 を 利 用 し て 先 ず 酸 化 反 応 系(Enzyme‑DPN‑oxime‑Trisbuffer系). に よ りオ キ シ ム を 酸 化 し,DPNをDPNHに. 変 え る(∠E340、 、 μ の 増 大)こ. の 反 応 を30分.

(10) 行 な わ せ た 後,こ DPNHと. の 系 に10‑1M燐. 酸 緩 衝 液(1.Oml)を. 加 え 酸 化 反 応 系 に よ り蓄 積 さ れ た. オ キ シ マ ー ゼ に よ り残存 オ キ シ ム を 還 元 さ せ た も の で あ る(∠E340,。 μの 減 少).. 第6図.オ. キ シ ム の 酸 化 還 元 反 応.. こ の こ とは 燐 酸 塩 を 限 定因子 ・と し て,同一. 反 応 系 で オ キ シ ム の酸 化 お よび 還 元 が お こな. わ れ る こ と を 示 す も の で あ る.. 総. 括. 1)肝. 臓 酵 素 標 品中 に は オ キ シマーゼ. 2)オ. キ シ マ ー ゼ は 燐 酸 緩 衝 液 呼1での み そ の 活 性 を 示 す.こ. の 外 に オ キ シ ム 酸 化 酵 素 が 合 まれ て い る. れ に 反 し オ キ シ ム酸 化 酵 素 で. は 燐 酸 塩 の 存 在 し な い 時 だ け に 活 性 が 観 察 さ れ る. 3)オ. キ シー マー ゼ はFADを. 5)さ. らに両 者・ は 反 応 温 度,耐 性 に 當 ん で い る.し. 6)hi}酵. 素DPNは. 要 求 す る が酸 化 酵 素 は要 求 しな い。 熱 性 に お い て相違 し,後. か し両 者 と も に60℃. 者 は オキ シ マ ・ 一ゼ に 比 し よ り耐 熱. で 完/径に 失 活 す る.. 両 酵 素 と も に 有 効 で あ る がTPNは. 文. い ず れ に 対 し て も 無 効 で あ る.. 献. 1)青. 木,山藤,1957.九. 大農 産製 造 学 教室 特 別 報 告,(17):20.. 2)江. 藤,山 藤,1954.同. 上,(12):8.. 3). Le Page, G. A., 1947. J. Biol. Chem. 168: 623.. 4). Theorell,. 5). Wohl, A., 1893. Bcr. Deutsch. Chem. Ges. 28: 730.. 6). Yamafuji,. K., Aoki, M. and Omura, H., 1956. Enzymol. 17: 371.. 7). Yamafuji,. K., Osajima, Y., Omura, H. and Yoshida, T., 1959. Enzymol.. II. et al., 1935. Hely. Chim. Acta 18: 1022.. 21: 37..

(11) Summary 1) The oxime dehydrogenase. activity,. besides the oximase. action. was found. in the hen liver preparation. 2) The phosphate. action.. oxime dehydrogenase On the other. 3) Oximase not influenced 4) Further. hand, phosphate. is activated. by addition. was detected. seemed to be essential. of. for the oximase. of FAD, but oxime. more the dehydrogenase and the reaction. is different. temperature. dehydrogenase. from the oximase. ; by heating. to sotne extent, while the latter was inactivated. 5) DPN is the co-enzyme of these enzymes, action.. only in the absence. is. by it.. of the heat stability was activated. activity. in respect. at 40' C the former considerably.. but TPN shows. no coenzymatic.

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