?肝臓の硝酸還元酵素(1)
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(2) 難 肝 臓 の 硝 酸 還 元 酵 素(1) 大 On the nitrate. 村. 浩. reductase Hirohisa. 久. of the fowl liver. (I). Omura. 緒. 言. 先 に 廿 日 鼠 及 び 牛 の 肝 臓 酵 素 に 就 て 若 干 の 報 告 を 行 つ た が(1954‑b),叉. 家蚕組織に硝酸. 還 元 作 用 を 阻 害 す る 因 子 が 含 まれ る事 を 認 め 其 の 本 態 が 尿 酸 で あ る 事 を 確 め た(1957).更 にXanthine,Hypoxanthine,Guanine,Adenine等. 生体 内 に於 け る尿 酸 の 先 駆 物質 も. 同 様 に 阻 害 作 用 を 示 す 事 を 観 察 し た(未 thine酸. 化ll孝素 の 作 用 で あ つ て,硝. 発 表).一. 方 動 物 組 織 に よ る 硝 酸 塩 の 還 元 はXan‑. 酸 塩 が 酸 素 に 代 つ て 反 応 す る 事 に よ り行 わ れ る と 古 く. か ら主 張 さ れ て い る が(DixonandThurlow,1924),近 flavoproteinに. 年 特 に 著 し く進 展 したMetallo‑. 関 す る 研 究 か らXanthine酸. 化酵素(Kielley,1955;Remyetat.,. 1955;RichertandWesterfeld,1954;WacKlearetal.,1954),もNeurosporaの 硝 酸 還 元 酵 素(Nicholasetal・,1953;NicholasandNason,1954)も 性 基 と す るFlavin酵. 素 で あ る 事 が 判 明 し た.最. Mo‑Plavoprotein中,牛 oxidase,硝. 乳 や 哺 乳 動 物 蛇 に 鳥 類 肝 臓 のXanthine酵. 酸 還 元 酵 素,Hydrogenase等. Indophenolと. 共 にMoを. 近Westerfeld等(1956)は. 素 の 外 にAldehyde. で は 硝 酸 塩 が 酸 素,Methyleneblue或. は. 共 に 水 素 受 容 体 と し て 作 用 し 得 る と記 載 し て い る.. 何 れ に し て も 硝 酸 塩 の 還 元 はPurine代 哺 乳 動 物 に 於 て はUricaseに 還 元 阻 害 能 も 消 失 す る.併. 謝 と密 接 な 関 連 を 持 つ 事 が 推 定 さ れ る.尿. に 報 告 し た(1957)・. し難 肝 はUricaseを. 含 ま な い 為 そ の ま ま排 泄 され る.然. 難 肝 臓 の 硝 酸 還 元 能 に 関 し て はBernheim,Dixon(1928)の. 記 載 が あ り前 記Westerfeld等. 酸 は. よ り更 に 分 解 さ れ 尿 素 と し て 排 泄 さ れ る が そ れ と共 に 硝 酸. 酸 還 元 能 を 示 す の で 哺 乳 動 物 の 酵 素 と比 較 研 究 す る事 が 好 都 合 だ と 思 わ れ,そ. る に 過 ぎ な い.従. 活 種 々の. もXanthinedehydrogenase作. も硝. の一 部 は 既 簡単 な. 用 とし て多 少触 れ て い. つ て 今 後 の 研 究 を 進 め る に 当 りそ の一般 的 性 質 に つ い て 一 応 の 概 念 を 得. る 必 要 が あ る と 考 え る.. 実 作 用 力 の 測 定 は 特 記 す る場 合 の 外 前 報(1954‑b)に. 験 従 つ て 行 い,活 性 は 生 成 し たNOSの. 濃 度 を 以 て 示 し た. 1.抽. 出効 果. 牛 肝 臓 の 場 合,水. 或 は 緩 衝 液 で の 磨 砕 懸 濁 液 及 び 之 を 遠 心分 離 し て得. ら れ た溷 濁上 層 部 に 活 性 が あ る こ と を 観 察 し,其 た.難. の 後 之 を 川 発 物 と し て 酵 素 標 品 を調整 し. 肝 に つ い て も先 ず これ に做 つ て 抽 出 試 験 を 試 み た.十. 分 に 水 洗 した 新 鮮 組 織 を 少 量.
(3) の 硅 砂 及 びpH6.oのM/15燐 homogenateを. 酸 緩 衝 液 と共 に乳 鉢 で よ く磨砕 し 調 製 した10%(M/v). 前 回 同様"原 酵 素 液"と. し,之 を3000r.p.m.で10分. 間 遠 心 分 離,上 層. 部 を 旧量 に復 し て 抽 出酵 素 液"と した.叉 沈 澱 部 も再 び 同 じ緩 衛 液 に 磨 砕 懸 濁 し 同 量 の "残 渣 酵素 液 一1"を 得 た .以下 同様 の処 理 を 行 い"残 渣 酵 素 液一II"と す る.之等酵素 液 一 定 量 は 含 有 す る絶 対 量 は 勿論 異 るが 何 れ も厨 一量 の原 組 織 に対 応 す る.即 液5m1宛. を用 いた が 何 れ も原 肝 臓 組 織0.59に. 相 当 す る.そ. 騰 水 に5分 間 浸 潰 した 酵 素 で の 盲 験 区 に は 勿 論NOzの Table. 1.. Extraction. of. liver. ち試 験 には 酵 素. の 一例 を第1表 に 示 す.沸. 生 成 は 認 め られ な か つ た.. tissues. with. buffer.. 緩 衝 液 の代 りに 水 を用 い て も 殆 ど同様 の 傾 向 を示 し 組 織 懸 濁 液 そ の もの よ りも結 締 組 織 。組 織 片,細 胞 片等 粗 大 部 を除 い た抽 出 部 の 方 がNO2量 牛 の場 合 と異 る.此 の一 因 と して 生 成 され たNO2が れ る.通 常NO;;還. 元酵 素 測 定 に 用 い た 条 件 で 生 成 濃度 即 ち約50〜100μMのNO2をNO. の代 りに 用 い て反 応 さ せ る と,場 合 に よ りNO2が ぜ い10%以下. は若 干 多 い様 で あ つ た.此 の 点. 更 に酵 素 的分 解 を 受 け る 事 も̲}7ら. で あ つ た.併. 減 少 す る 事が あ つ た が そ の減 少 度 は せ い. し試 料 に よつ て か な り変 動 し時 に は著 しい 減 少 を来 しそ の極. 端 な場 合 は20%に. 及 ぶ事 もあ つ た.然. け る よ りもNO2減. 少 度 は 常 に大 きか つ た が,此 の両 者の差 は顕 著 で は な く 何 れ の場 合 も. も明 か に"原 酵 素 液"に 於 て"抽. 5%程. 度 を越 え る事 は な か つ た.従. 液"に. よる も の よ りも常 に 大 き い 事 は 時 に 起 るNO2の. に帰 す る事 は[;来 な い.寧 等 も考 え られ る.又"残. つ て"抽 出 酵 素 液"に. ろN0.:測. よるNO:;の. 出酵 素 液"に 於. 還 元 量 が"原 酵 素. 引 続 き減 少 す る度 合 の少 い事 だ け. 定 の為 に 行 う液 の 清 澄 化 に 際 し沈 澱 部 へ の吸 着 の差. 渣 酵 素 液"の 活 性 も多 少 変 動 し一 部 は 破 壊 を免 れ た組 織 片 や細 胞. 等 の残 存 活性 に 基 く事 も示 唆 され るが,少. くも同 様 の 操 作 に よ り牛 肝 臓 では 常 に 活 性 が 見. られ ず 此 の 点 に も牛 肝 の場 合 との 相 異 が 認 め られ る. NO;;の. 還 元 は 第1図. に 示 す 様 に 酵 素 量0.59迄. は ほぼ 直 線 関係 に あ る事 が 観 察 され. た.酵 素 量 が 更 に 多 くな る と反 応 液 が 稠 密 に な り操 作 に もい ろ い ろ の不 都 合 を来 す が 特 に 液 の清 澄 に際 し沈 澱 蛋 白 へ のNO2の genate或. 吸 着 が 非 常 に 多 くな る虞 れ も生ず る.10%homo‑. は そ の 遠 沈 一L層液 では3〜5ml即. ち 原 肝 臓 組 織0.3〜0.59が. 最 も 操作 し. 易 い 事は 従 来 屡 ζ経 験 し牛 及 び 廿 日鼠 で は 専 ら此 の 量 を 用 い て 来 た が 難 の場 合 も同様 で あ つ た. 酵 素 作 用 が 反応 時 間 に も比 例 す る事 は 第2図 か ら明 らか で あ るが,NOSの. 比色測定精度. に鑑 み て 常 法 通 り2時 間 を用 い た. NO;,濃 度 の影 響 は 第2表. に 示 す.濃. す る.併 し同 様 にGriess試 従 来 通 りで あ つ た.. 度 が 高 い程 還 元 生 成 物 の量 は増 大 す るが 還 元率 は. 薬 に よ る発 色 度 よ り2〜1×10‑2Mを. 用 い て 十分 な 事は 低下.
(4) Fig.. Fig.. Table. 2.加. 熱の影響. 1:. 2:. Enzyme-activity. 2.. Reaction. 酵 素 液5ml(肝. 後 残 存 す る活 性 を比 較 した(第3表).. Effect. curve.. time-activity. of. concentration. 臓0.59に. curve.. of. NO3,. 相 当)を 夫 々の温 度 に… 定 時 間 浸 漬 した.
(5) Table. 3.. Effect. of. Fig.. heating. 3:. at. various. Inactivation. of. temperatures. enzyme. by. on. NO3. reductase.. heating.. 次 い で 同様 に"抽 出 酵 素 液"を 各温 度 に種 々の時 間 浸 漬 して活 性 の低 下 を追 及 し そ の結 果 を第3図. に示 す.90。. では2分,80.で. 20分 間 熱 し て も 尚15%の は30分. 間 で 約20%の. は5分 で殆 ど完全 に不 活 性 化 され るが,70"で. 酵 素 力 を保 存 し既 に10分. で略 ・ ・ 定 値 に達 して い る.叉60°. は で. 活 性 減 少 を来 した.何 れ の温 度 に於 て も最 初 は ほぼ 直 線 的 に活 性. を低下 し爾後 徐 々 に或 る終 値 に近 づ く傾 向 を示 す.而. し て変 曲 点 の位 置,そ れ迄 の時 間鼓. に最 終 値 は 温 度 が 高 い程 速 か で 且 つ 低 い事 は 容 易 に 予 想 され る所 で あ る. 3。 最 適PH"抽 に相 当 す る2mlの. 出 酵 素 液"のpH一. 活 性 曲線 を 第4図 に 示 す.此. 酵 素 液 を種 々 のpHのM/lo緩. た.難 肝 酵 素 に於 て も廿 日鼠,牛. 衝 液5mlに. の場 合 と同様 にpH5.8附. の 場 合 組 織0.59. 添加 して活性測定 に用い. 近 に最 適 値 が あ り且 つ醋酸 緩. 衝 液 の場 合 燐酸 塩 よ り高 い活 性 値 を示 した.併. し作 用pH範. で はpH6乃. を示 した が 中性 点 を越 え る事 は な か つ た.. 至7の 間 に ほ ぼ 平 坦 な最 適pH域. 囲 は 更 に広 く特 に燐 酸緩 衝 液.
(6) Fig.. 4.水 素供 与体NOs還. 4 :. pH-activity. curve.. 元 反応 も 他 の 生 体 内 反応 と 同様 に 単 独 で 起 る もの で は な く. 多 くの反 応 特 に脱 水 素 酵 素 系 と密 接 に共 ・ 麗す る事 は 既 に家 蚕(1954‑a),十 (1954‑b)に. 日鼠 蛇 に牛 肝. 就 て報 告 した が難 肝 臓 の場 合 も例 外 で は あ り得 な い と推 定 され る・ 従 つ て関. 連 す る諸 酵 素 系 及 び そ のt質 並 に 其 の 他 の 因 子 を 含 ん だ粗 酵 素 液 を 用 い て の研 究 が 組 織 内 反 応 の状 況 を追 究 す る に無 意 味 では な い と思 わ れ る.併 固有 の 基 質 が 優先 して 反 応 す る為. し此 の 場合,組 織 自身 に含 まれ る. 家 蚕 鼓 に廿 日鼠 の よ うに組 織 を 磨 砕 抽 出 し て大 部 分 の. 基質 を除 い た 為 活 性 が 著 し く低 下 した̀̀残 渣 酵 素 液"に 種 々の 水素 供 与 体 を 添 加 して酵 素 力 のi復 を 見 るか,或 は牛 肝 の様 に"H酵. 素 液"に 活 性 を残 さな い 場 合"抽. 出酵 素 液"に. 著 し く多 量 の物 質 を加 え てそ の影 響 を検 討 し共 擁 す る水 素供 与 系 を推 定 した.併. し鶏肝 臓. では 両 酵 素 液 に5倍 及び3倍 量 の糖 類 或 は 種 々 の酸 を加}た が 従 来 の 場合 程 明 白 な 結 果 が 顕 れ なか つ た.此. の 事 は之 迄 試 験 した 各 組 織 中難 肝 の場 合 が 最 も優 先 し て固有 の 水素 供 与. 体 が作 用 し て居 て他 の介 入 を許 さ な いか 或 は 試 験 した 基 質 に対 応 す る以 外 の 特 殊 の酵 素 系 のみ が 関 与 し て い る事 が 想 像 され る.従 つ て他 の手 段 を用 い る事 が 必 要 で あ つ た. そ こで 透 析 に よつ て 之等 固有 の 基質 を除 く事 を企 て た.新 て調 製 した"抽 出酵 素 液"90m1の. ・1180m1を. * Corrected. 4.. to. values. the. Effect. of. dialysis. corresponding. り常 法 に よつ. セ ・フ ァ ン膜 を用 い て 一 晩 流 水 透 析 した後. 遠 心 分 離 して析 出蛋 白 を除 き ほぼ 透 明 な上澄 液90m1を Table. 鮮 組 織9gよ. on. to. 得 た.叉 沈 澱 も水 に懸 濁10mlと. "Extract-enzyme".. 0 .5 g. of. fresh. liver. tissues..
(7) しそ の 各5m1に. 就 て 酵 素 力 を 試 験 した,尚. 0。5g相 当 量 に 補正 した.第4表. 使 用 した 酵 素 量 が 異 る の で 活 性 は 原 組 織. の 結 果 か ら判 る様 に 明 か に 透 析 に よ り 活 性 は著 し く低 下. す るが 透 析 外 液 或 は 肝 臓 加 熱 抽 出 液 に よ り或 る程 度 活 性 を 恢 復 した.叉. 沈 澱 蛋 白 に は殆 ど. 活 性 が 認 め られ なか つ た.本 試 験 に 用 いた 透 析 外 液 は 別 に90mlの"抽出酵素 の蒸 溜 水 に対 し氷室 中 で 一晩 透 析 し外 液 を50。 で 減 圧 濃縮16m1と 液 は 難 肝 臓5gを. 乳 鉢 中で よ く 磨 砕 し 水 を加 え て10ml懸. 濁 液 とす る 。 之 を 沸騰 水 に. 5分 間 浸 漬 した 後 凝 固 蛋 白を 遠 沈 除 去 し黄 色L澄 を10mlと 加 した.従 つ て透 析 外 液 は5g加熱. 抽 出 液 は1gの. 液"を21. した.叉 肝臓 加熱 抽 出. し て調 製 しそ の各1mlを. 添. 新 鮮 肝 臓 に相 当 す る訳 で あ るが,之 等. が 少 く も… 部 の水 素 供 与 体 を含 む 事 は 推 定 され る.AcetaldehydeはM/5溶. 液1m1を. 加. え た が そ の顕 著 な賦 活 効 果 に つ い て は後 に述 べ る. 種 々の 有 機 酸 に よ る透 析 酵 素 液 の 活 性 復 元 効 果 を第5表 に 示 す.此 透 析 した"抽. 出酵 素 液"にM/10溶. 液 を1m1宛. 添 加 した.林. の 場 合42時. 間 流水. 檎 酸,Glutarnin酸,及. び琥珀酸 が特 に強 い促 進 効 果 を示 した が,更 に共 の他 の酸 も順 序 こそ異 るが 水素 供 与 体 と Table. * AA. :. 5,. Reactivation. Acetaldehyde. of dialysed. NO3reductase. by various. substances.. .. し て 有 効 な 事 は 哺 乳 動 物 に つ い て 観 察 さ れ た 事 と 同 様 で あ る.併 Mannose,Galactose,Xylose,Rhamnose,Arabinose等. しGlucose,Fructose,. の糖 類 或 は牛 肝 で効 力 を認 め. たGlycine,Alanine,Asparagine,Ethano1等. 何 れ も明 白 な影 響 を認 め る 事は 出来 な. か つ た. 前 報 で 示 し た 様 に 牛 肝 に 於 て は 特 にAcetaldehydeの. 促 進 効 果 が顕 著 で あ るが 廿 日鼠 と. 共 に 難 肝 で も寧 ろ 阻 害 的 に 作 用 す る か 或 は 殆 ど無 関 係 で あ つ た.此. の 場 合 も試 料 に よ つ て. 個 差 が あ り促 進 的 に 作 用 す る 事 も あ つ た が そ の 際 で も程 度 は 極 め て 僅 少 で あ つ た.併 析 液 で は 第4,5表. に 既 に 示 し た 様 にAcetaldehydeの. 原 液 の 活 性 を 遙 か に 超 過 す る 事 も あ つ た.併. Table. AA:. 6.. Mutual. Acetaldehyde.. effect. of. ** FLD. dialysate. : Fowl. and. liver. 効 果 が常 に顕 著 に顕 れ る様 に な り. し 固 有 の 水 素 供 与 体 を 含 む"抽. acetaldehyde. dialysate.. し透. on. *''-* CLD. dialysed. : Cattle. NO3. liver. 出 酵 素 液"に 対. reductase.. dialysate..
(8) して も6乃 至8倍 つ た.透. の賦 活 作 用 を示 した 牛 の 場 合 程 は著 し くな く最 も強 い 時 で も 約3倍. であ. 析 外 液 ・1・ に 水 素 供 与 体 が 出 て来 る事 は既 に示 した が,之 が 共 存 す る とAldehyde. の効 果が 抑 え られ る様 な傾 向 を示 した(第6表). 此 の場 合 の酵 素 液 は 箒4表 記 載 に 準 じて 調 製 した が"原 抽 出 液"は15,000r.P.m.で60 分 高 速 遠 沈 を行 つ て得 た 透 明 なL澄 液 を 用 い 透 析 は21の. 蒸 溜 水 に対 し氷 室 中 で一 晩 行 つ. た.透 析 外 液 は 難 肝 並 に 牛 肝 共 に前 回 同様 に調 製 した 濃 縮 液 を 用 い試 験 には そ の1mlを 加 え た.尚 難 肝 透 析 酵 素 に 牛肝 外 液 の有 効 な 事 も従 来 の経 験 か ら予 想 され た が 事 実 結 果 は 之 を示 した. 之 等 の 事か ら肝 臓 内 に含 まれ る物 質 に よつ て そ の代 謝 系 はAcetaldehydeが 少 と も水素 受容 体 と し て作 用 しNOSと. む し ろ多. 拮 抗 す る状 態 に な つ てい る と推 定 され る.併. 等 低 分 子物 質 が 除 去 され る と種 々の酵 素 系 は 変 動 しAldehydeが. し之. 逆 に供 与 体 と して の 役. 割 を果 す代 謝 系 に な る と思 わ れ る. 何 れ に して も肝 臓 内 に含 有 され る低分 子 物 質 が 特 に優 先 し て 水 素 供与 体 と して 作 用 し て い る 事は 容 易 に推 定 され るが 事実"抽 持 つ.併. 出 酵 素 液"は か な り強 いMethyleneblue脱. し水素 供 与 を仲 介 す る酵 素 がNO;還. く,使 用 した 粗 酵 素 液 に於 て強 力 なNO3還 持 つ とは 限 らな い事 は 風 体 の 新 鮮 肝 臓0.59に. 経 験 した.そ. Table. * MB. 7.. に示 す が酵 素 は何 れ も夫 々異 る個 は10‑3M. 用 いた 外 は反 応 条 件 は総 て 同… で あ つ た.. Methylene. ; Methylene. 元 力 を 示 す もの が必 ず し も強 い 水 素供 与 能 を の一 例 を第7表. 相 当 す る"抽 出酵 素 液"で あ つ て 夫 々2×10‑'MNO叉. Methylenebluelmlを. 色能を. 元 を 触 燥 す る酵 素 と同 一 の もの とは謂 い難. blue. decoloration. and. NO3. reduction. of. "Extract. enzyme.". blue .. 広 く概 観 す れ ばMethyleneblue脱 色 能 とNO:t還 元 力 とは 平 行 す る様 で あ つ て(実 験 1〜5)ほ ぼ 同 一一 の還 元能 を持 つ もの は 大 体 同 じ時 間 に色 素 を 脱 色 す る(実 験4〜7).併 し 実 験9及 blue脱. び10の. 様 に全 くそ の 逆 を 示 す もの もあ り,NO2生. 色 時 間 は 異 る もの(実 験10及11).或. 験11と12,及. び13と14に. 成量 は 同 一 で もMethylene. は逆 に 同 一の脱 色 時 間 で あ るに も拘 らず実. 見 られ る様 にNO3還. 元 力 の異 る 事 も あ る.又 反 応 液 中10‑gM. の色 素 が比 較 的短 時 間 に 完全 に脱 色 され る 事か ら少 くもそ れ 以 上 の 水 素 が2時 間 で は提 供 され て い る訳 で あ るが還 元 され るNO3の. 量 は 遙 に 少 い.即. ち仮 令 脱 水 素酵 素 力 は他 の酵. 素 の もの に比 べ て 弱 くて もNO,s還 元 酵 素 に よつ て利 用 され る量 は 十 分 に多 い事 を示 し,従 つ て"抽 出酵 素 液"の 場 合 水素 供 与 量 の 多 い 条件 で 反 応 が 行 わ れ て い る と思 わ れ る. Xanthine或. はAldehyde酸. 化 酵 素 がNO3を. 還 元 す る事 は 既 に 述 べ た様 に 古 くか ら. 主 張 され た 所 で あ つ て 透 析 酵 素 に 於 け るAcetaldehyde添. 加 の著 しい効 果 は此 の事 実 を. 示 唆す る.生 体 内 に 於 て は 種 々の 水 素 伝 達 系 が あ り従 つ て上 記"抽. 出酵 素 液"に 於 てMe一.
(9) thyleneblueの. 脱 色 に 関 与 す る も の はAldehydeを. あ り此 の 中NO:;還. 含 む 種 々 のDehydrogenase系. 元 に 与 る も の はAldehydedehydrogenase共. あ る と す れ ば,Methyleneblueの. 脱 色 時 間 とNO:,還. 他二三の酵素だけで 元 力 が 必 ず し も平 行 しな い 事 は 矛. 盾 せ ず,且 つ 短 時 間 に 多 量 の 水 素 が 提 供 さ れ て い る に も拘 ら ずNO3還 は そ の 一 部 に 過 ぎ な い 事 実 も 了 解 さ れ る.而 genase活. 性 とNO:;還. 透 析 後 有 効 なGlutamin酸 し透 析 し た"抽. も 単 に 硫 安 沈 澱 を 行 つ た 程 度 の 極 く初. 加 え な け れ ばNOsの. 還 元 は 起 ら ず"抽. 出 酵 素"で. 等 は 効 果 が な い 事 等 は 此 の 事 を 裏 付 け る根 拠 と な つ て い る.併. 出 酵 素 液"は. 既 に 述 べ た 様 に 活 性 を 低 下 す る が 之 と共 にMethyleneblue. の 脱 色 能 も著 し く減 退 し2時 加 に よ つ てNO3還. 元 に 用 い られ る も の. し て 酵 素 の 精 製 に 当 りAldehydedehydro‑. 元 力 とが 常 に 相 伴 う事,然. 期 の 精 製 段 階 で もAcetaldehydeを. で. 間 で も 殆 ど色 調 の 衰 槌 を 来 さ な い が,Acetaldchydeの. 元 力 の 増 加 と 共 にMethyleneblue脱. Aldehydedehydrogenaseの. 添. 色 能 も恢 復 し明 か に 此 の場 合. 活 動 に よつ て 両 作 用 が 行 わ れ て い る 事 を 示 唆 す る.併. の 場 合 も両 作 用 力 が 必 ず し も平 行 し な い 事 は 第8表. に 示 す 通 り で あ る.試. し此. 験は勿論別個 の. 組 織 よ り調 製 し た 酵 素 液 を 用 い た 他 は 測 定 条 件 等 総 て 同 一 に した. Table. 8.. Relation NO3. * MB. :. Methylene. between reduction. aldehyde of. dehydrogenase. "Dialysed. activity. blue. 叉 一 晩流 水透 析 後 更 に蒸 溜 水 に対 し 一 日透 析 した"抽. 出酵 素 液"各10m1に. 活 性炭 を加 え よ く振盪 して吸 着 させ た後 遠 心 分 離 した 上澄 液 のNOs還 blue脱. 色 との関 係 を第9表. Table. MB. :. Methylene. 9.. Effect of charcoal MB decoloration. treatment on NO3 reduction of "Dialysed extract.". 元 とMethylenc. and. blue.. 実 験3の. よ うにMethyleneblue脱. 元 力 は 比 較 的 弱 い も の 或 は実験1と5,4と5の. 力 を 示 し て もMethyleneblue脱 は 差 が な く て もNO:,還. 種 々の 量 の. に示 す.. 一 応 両 活 性 は 平 行 す る傾 向 を 示 す が 第8表 強 くて もNO3還. and. extract.". よ うに 同 一・ のNO3還. 色 能 は 著 し く異 り又 逆 にMethyleneblue脱. 元 量 は 数 倍 も 異 る 事 実,或. は 第9表. 色能は. の 活 性 炭1・0gと1・5g処. 元. 色時間に 理.
(10) に よ りMethyleneblue脱. 色 力 が 先 づ 影 響 を 受 け 易 い 事 等 の 点 か ら,NO,;還. hydedehydrogenaseが. に よ る 反 応 とい う 事 は 疑 問 で あ り,仮. に 同 一 酵 素 で あ る とす れ ば 反応 に 関与 す る 部 分 が 異. る も の と推 定 さ れ 廿 日鼠 肝 臓 酵 素 のNO3還 た 推 論(未. 発 表)を. 5.Flavin類. 元 にAlde‑. 重 要 な役 割 を演 じて い る事 は 自 明 の事 で あ つ て も 同一 酵 素 蛋 白. 元 能 に つ い てPurine類. 支 持 す る.. の影 響. 大 腸 菌 のNO,置. 還 元 酵 素 に 於 て はFAD或. の 添 加 に よ る 活 性 増 強 が 観 察 さ れ て 居 り(江上,佐 dehydrogenase等. の 阻 害 試 験 か ら得. がFADを. 藤,1948),叉Xanthine酵. 含 む 事 はWesterfeld等. と し て 関 与 し て い る 事 が 推 定 さ れ る が,肝. 素,Aldehyde. も 示 し て い てFADが. 補酵素. 臓 の 場 合 非 常 に 堅 く結 合 し て い て 透 析 に よ つ て. は 失 わ れ な い ら し い 事 は 透 析 酵 素 液 にAcetaldehydeだ は 之 を 凌 駕 す る程 のNO3還. はMethyleneblue. け を 添 加 し て 原 酵 素 液 に 近 く或. 元 力 を 恢 復 す る 事 か ら 推 定 さ れ る.併. し一 応 そ の影 響 を 試 験. し た. 牛 肝 臓709を. 細 か く切 り200m1の. でhomogenizeし. 更 に50m1の. 水 と共 に800に30分. 水 を 加 え80り で30分. 同 様 の 抽 出 操 作 を 数 回 反 復 し 濾 液 を 集 め460m1を 遠 沈 除 去 す る.ヒ Pheno1層. 澄 に50m1のPhenolを. 約30m1か. 層 約10mlを 4:1:5の. は 八 木 法(1953)に. く振 罷 し て 静 置 す る.得. 倣 つ たFlavin抽. togramに FADの. 出 液 と し た.全. 出 で あ り,Butanol・醋酸. 肝‑Flavin抽. よつ て 三 成 分 を 含 む 事 を 確 め た が,螢 順 で あ つ た.牛. びFADを. く 同 様 に し て 難 肝909よ. 経 て 水 に 転 溶,約20m1の鶏. 肝 一Flavin抽. 後 減 圧 濃 縮 約5m1の. て 約5mlの黄. り 温 水 抽 出 液560ml,Pheno1層. 光 の 強 さ は 何 れ もFMN,Riboflavin, 用 い前 記. Table. 10.. Effect. of. が 牛 肝FAD溶. つ い て も同様 に 温 水抽 出 濃 縮 し. 液 を 調 製 し た.之. 等を透析酵素液に加えてその. に 示 す. crude. flavin. * FL-FE: Fowl liver flavin extract. *** CL-FAD: Cattle liver FAD extract. extract. .. "'"". of. liver. **. CL-FE. を 濾過. 液 で あ つ てChromatogram. 確 認 し た.FMNに. 色 水 溶 液 即 ち 牛 肝FMN溶. 影 響 を 検 し た 結 果 を 第10表. 着 濾 紙15枚. 抽 出,之 を 数 回 繰 返 し 浸 出 液 約200m1を. 淡 黄 色 水 溶 液 を 得 た.之 のSpotを. を牛. 出 液 を 調 製 し た.同様にChroma‑. 出 液 を 東 洋 濾 紙No.2のChromatopileを. 温 水 で 約20分. でRfO.025〜0.03に1っ. ・水. 含 ん で い た.之. 溶 媒 に よ つ て 三 成 分 を 分 ち 各 区 を 抜 き 取 り暗 室 で 風 乾 後 保 存 し た.FAD吸 ・J・ さ く切 片 に 切 り50m1の. 黄色 の 水. 行 い 螢 光 分 析 に よ つ てRfO,31,010,. 0.03の 三 成 分 が 検 出 さ れ 明 ら か にRiboflavin,FMN及. 60m1を. られ た 濃 黄色. 液 で 振 嵌 抽 出 す る 事2回,濃. 溶 媒 を 用 い て 濾 紙Chromatographyを. 肝 一Flavin抽. 渣について. 得,之 を 硫 安 で 飽 和 し て 蛋 白 を 沈 澱 さ せ. 添 加,よ. らEther100ml,水5ml混. 得 る.之. 加 熱 し 之 をWarlingblender 抽 出 吸 引 濾 過 す る.残. on. CL-FMN:. "Dialysed. : Cattle Cattle. NO3. liver liver. reductase.". flavin FMN. extract extract. . ..
(11) 尚 比 較 の た めAldehyde区 にFMN溶. も設 定 した が,Flavin抽. 液 は そ の ま ま各1m1宛. 出液 或 はFADが. 出液 は そ の10倍. を添 加 した.試. 活 性 に 関係 す る ら しい様 子 が推 定 され た.. 次 い で 近 藤,奥 田両 氏 か ら夫 々恵 贈 され た結 晶FMN及 を25γ. 稀 釈 液,FAD並. 験 は 定 性 の 域 を 出な い がFlavin抽. 宛 透 析 酵 素 に加 え た が 少 くもFADは. 弱 であ り又FMNは. びFAD並. に市 販Riboflavin. 有 効 であ る と思 はれ る.併. 寧 ろや や 阻 害 的 に作 用 し た.肝. 臓 一Flavin抽. しそ の程 度 は微. 出 液が 相 当 の効 果 を示. し た が三 成 分 混 合 物 で は無 効 で あ り,量的 の問 題 或 は 酸 化 型,還 元 型 の問 題 等 も関4す. ると. 思 わ れ る. Table. * RF :. 6.阻. 11.. Effect. Riboflavin. 害剤の影響. of various. .. flavins. ** CL-FE. on "Dialysed. :. Cattle. flavin. extract.. 各 種 阻 害 剤 の"抽 出酵 素 液"に 対 す る影 響 を第12表 Table 12. Effect of inhibitors of "Extract enzyme",in. **. liver. NO3 reductase.". * Oxine : 8-Hydroxyquinoline.** PCMB: p-Chloromercuribenzoic. 尚此 の他 にUrethane,NaF等 KCN,PCMB,或 はCut'+,Ag+等. acid.. ****. に 総 括 す る.. on NO3 reduction inhibition. EDTA: MIAA:. Ethylene diamine tetra Monoiodacetic acid.. %.. acetic. acid.. も試 験 した が 影 響 は 認 め られ なか つ た ・ 之 等 阻害 剤 に は の よ うに 濃 度 の 減 少 と共 に 阻 寄 効果 を 急 速 に 失 うも. の,阻 害 作 用は そ れ 程 強 くな くて もか な りの低 濃 度 迄 効 果 を保 持 す る も の(EDTA,Thio・ urea)が. あ り,MIAAやNH,OHは. して も之 等 の結 果 か ら金 属 並 にSH其. 比 較 的高 濃 度 に於 て 阻害 作 用 を示 した.併. し何 れ に. が活 性 に 関与 す る事 は推 定 され る・. 此 の場 合 も脱 水素 酵 素 の阻 害 即 ち 水素 供 与 の抑 制 に 基 く二次 的 な影 響 とい う事 も 考 え ら れ る.そ こで.1一 記 阻 害 剤 中代 表 的 な もの のMethyleneblue脱 色 へ の影 響 を試 験 した ・既 に述 べ た様 に試 料 に よつ て脱 色 能 は 異 るが 第13表 は 勿論 であ る.. の 各項 は 同 一酵 素 に よ る もの で あ る事.
(12) Table. 13.. Effect. of. some of. inhibitors "Extract. 大 部 分 の阻 害 剤 は 同時 にMethyleneblue脱 ureaの. よ うにMethyleneblue脱. 害 す る点,或 はNaN;;の. on. methylene. blue. decoloration. Enzyme".. 色 を も遅 延 させ る事 が 観 察 され るが,Thio・. 色Yこは 影 響 しな い に も拘 らずNO:3還. 様 に完 全 にNO:,還. 元を 強力に阻. 元 を 阻止 して もMethyleneblue脱. 色 はそ. れ 程 影 響 され な い事 か ら少 くも金 属 が 関与 す る事 は 確 実 で あ る と思 わ れ る。 併 しPCMB の様 にNO;;還. 元 に影 響 の な い 濃 度 で も尚 脱 水 素 酵 素 系 に 多 少 と も影 響 す る場 合 は 判 断 の. 根 拠 に な り得 な い事 は 当然 で あ るが,水 素 供 与 系 を含 め たover‑a11の SH基. 所謂NO3還. 元系 に. が 関与 して い る事 は 勿 論 で あ る.. 此 の他Purine類. に よる阻 害 が3L.興味 あ る事 実 を示 す が 之 に就 て は別 に報 告 す る. 総. (1)難. 肝homogenateに. 括. 硝 酸 還 元 酵 素 作 用 を確 認 した.. (2)酵 素 力 は80'以上 では5分 以 内 で完 全 に 不 活 性 化 され るが70'で は20分 で 約15 00残 存 し60。 で も30分 に 約20%の 減 少 を来 した .而 し て そ の不 活 性 化 は初 期 に於 て は 加 熱 時 間 に比 例 し爾 後 徐 々に終 極 値 に近 づ く傾 向 を示 した. (3)酵 pH域. 素 作 用 の最 適pHは5.8附. 近 に あ つ て 哺 乳 動 物 の もの と 大 体 一致 す るが 作 用. は 更 に広 か つ た.. (4)酵. 素 は透 析 に よ り活 性 を か な り低 下す る が透 析 外 液 或 は 加 熱 肝 臓 抽 出液 に よ り一一. 部 族 復 し た. (5)酵. 素 作 用 は種 々の 水素 供 与 体 に よつ て影 響 され な いが 透 析 す れ ば林 檎 酸,Gluta‑. min酸,琥珀酸,酒. 石 酸,Fumar酸,乳. 酸,Malein酸,Malon酸,枸櫞酸. に よ り促 進 さ.
(13) れ る様 に な り,之 等 の脱 水 素 酵 素 が共軛 す る事 を 示 した.併. し糖類 は殆 ど影 響 が認 め られ. な か つ た.一 方 原 液 に 於 て 多 少 阻 害 的 に働 くか 殆 ど 影響 しな か つ たAcetaldehydeの. 促. 進 作 用 が 著 し く顕 著 に な つ た. (6)原. 酵 素 液 に於 け る肝 臓 固 有 の 水 素 供 与 体 或 は 透 析 酵 素 に 於 け るAcetaldehydeに. よ るMethyleneblue脱 (7)酵. 色 能 とNO,;還. 素 活 性 にFADは. 元 力 とは 必 ず し も平 行 し なか つ た.. 有 効 で あ るが,FMN或. はRiboflavinは. 効 果 が な い事 が示. 唆 され た. (8)少. くもhomogenateに. よ るNO:;還. 元 系 に金 属 並 にSH基. の関 与 す る事 が 推 定. され た.. 本 研 究 に協 力 され た 高 橋 平 八 郎,西 村 浩,重 松 晴喜,並 にFMN,FADを 城 大 学 農 学 部 近 藤 弘 及 び 名 古 屋 大 学 医 学 部 奥 田潤 の各 氏 に感 謝 す る.尚. 恵 贈 され た 名 研 究 費 の… 部 は 文. 部 省科 学 研 究 助 成 費 に よつ た.. 文 Bernheim,. 献. F. and Dixon, M., (1928) : Biochem. J., 22, 125.. Dixon, M. and Thurlow, 江 上 不 二 夫 ・佐 藤. S., (1924) : Biochem. J., 18, 989.. 了,(1948);日. 化,69,160.. Kielley, R. K., (1955) : J. Biol. Chem., 216, 405. Nicholas,. J. D. and Nason, A. (1954) : J. Biol. Chem., 211. 183.. Nicholas, J. D., Nason, A. and McElroy, W. D., (1953), Nature, 大 村 浩 久,(1954‑a):九. 大 農 学 芸,14,415.. 大 村 浩 久,(1954‑b):九. 大 農 学 芸,14,423.. 172, 34.. 大 村 浩 久,(1956):J.Fac.Agr.KyushuUniv.,10,365. 大 村 浩 久,(1957):Bull.Agr.Chem.Soc.Japan,21,126.. Remy, C. N., Richert, D. A., Doisy, R. J., Wells, I. C. and Westerfeld, Chem., 217, 293. Richert, WacKler,. D. A. and Westerfeld,. W. W., (1955) : J. Biol.. W. W., (1954) : J. Biol. Chem., 209, 179.. B., Mahler, H. R. and Green, D. E , (1954) : J. Biol. Chem., 210, 149.. Westerfeld, W. W., Richert, D. A. and Higgins, E. S., (1956) : " A Symposium on Inorganic Nitrogen Metabolism" (Edited by McElroy, W. D. and Glass, B.), p. 429. The Johns Hopkins Press, Baltimore. 八 木 国 夫,(1953):江. 上 等 編"標. 礁 生 化 学 実 験",P.158,文. 光 堂,東. 京..
(14) Summary The. activity. mated.. of nitrate. reductase. It was completely. 80"C for 5 minutes. was retained activity. at 60'C.. at the initial. final values reductase though. inactivated. However, The. stage. according. pII existed. between. phosphate The. in which. at 90'C for 2 minutes was observed. had a tendency. and at. The. linearly. gradually. optimum. activity. when the enzyme. to decrease. and then to reach. temperatures.. of both mammalian. was esti-. 15 per cent of the original. diminution. of heating. to the. the pH range. by heating. enzyme. was about 5.S coinciding. than that. fowl liver homogenate. approximately. at 70'C and the slight. had been heated. in the. its. to certain. pH of the. nitrate. with those of mouse and cattle liver enzymes,. the nitrate. reductase. reductases.. 6 and 7 when. the. is acting was much broader. Especially, enzyme. wide plateau. assays. were. of optimum. carried. out using. buffer. enzymatic. with the dialysate recovered. some. fumarate,. lactate,. are acting. activity. was fallen. and boiled extract extent. by addition. maleiate,. by dialysis. and restored. of liver.. Moreover,. the activity. of malate,. glutamate,. succinate,. malonate,. most predominatingly. off considerably. and citrate,. as hydrogen. since native. was also tartarate,. substances. which. donator in the liver had been lost. by dialysis. However, reactivation with sugars was not observed. The rate of nitrate reduction of the dialysed enzyme was accelerated exceedingly by acetaldehyde the. which. original. was. has almost. homogenate.. demonstrated. so far. cussions were performed It was observed by the conjunction nents. From. reactivation. the. fact that. the participation. of metal. and SIi group. therefore,. some. contains. was. dis-. attained. three. it was also suggested. EDTA,. of. which. nitrate. reductase. of liver which. Moreover, oxine,. nitrate, nitrate. but both the laters. thiourea,. dehydrogenase. reducing. of dialysed. Agfi, and hydroxylamine. effect on the reductase. aldehyde. principal. of raw flavin extract. with reduction. acid, Cu-",. inhibitory with. to be able to reduce on the active. FAD, FMN, and ribpflavin.. may concern acetic. that. no or slight In connection. compo-. that. FAD. not. NaN3, KCN, PCMB,. inhibited in the reaction. the reduction. monoiod. of nitrate,. was presumed..
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