細胞内・外 Ca 2+ 阻害時の細胞内 Ca 2+ 伝播と PKCα - DG の蛍光変化

Fig. 5-19~22はThapsigarginによって小胞体内のCa²⁺を枯渇させたときの実験 結果を示す．Ca²⁺濃度上昇は刺激を加えた細胞のみで起こり，隣接細胞への伝播 はしなかった（Fig. 5-19）．PKCαは刺激位置と刺激位置に近い細胞膜で輝度の増 加が見られた（Fig. 5-21）．Fig. 5-22はCa²⁺とPKCαの平均蛍光強度比を示す．

細胞外溶液からの Ca²⁺流入によって Ca²⁺濃度上昇が観察され，刺激位置におけ るCa²⁺蛍光の最大輝度はControlと有意な差はなかった．PKCαの最大蛍光輝度 は刺激位置，刺激位置近くの細胞膜でそれぞれ21.9 ± 2.0 s と7.8 ± 0.7 sのとき

に，2.11 ± 0.07と1.52 ± 0.07になった．最大輝度と時間は細胞膜よりも刺激位置

で有意に高く，遅かった．これはControlと同様にPKCαが二相性の反応をして いる可能性を示唆した．

Fig. 5-19 局所力学刺激によるCa²⁺輝度変化（Thapsigargin）

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Fig. 5-20 局所力学刺激によるPKCα輝度変化（Thapsigargin）

Fig. 5-21 局所力学刺激によるPKCα輝度変化（Thapsigargin：差分画像）

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Fig. 5-22 Ca²⁺とPKCαの蛍光輝度比グラフ（Thapsigargin，N=5，n=15）

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Fig. 5-26~29に細胞外溶液のCa²⁺を除去したときの実験結果を示す．力学刺激

によってCa²⁺濃度上昇が見られた．しかし，Ca²⁺の増加はControlとThapsigargin 負荷時の実験に比べて有意に低かった．差分画像から刺激位置近くの細胞膜で PKCαの蛍光輝度が増加しているのが見られた（Fig. 5-28）．この蛍光は8.1 ± 1.3 sで最大値1.38 ± 0.05に達した．細胞外のCa²⁺が除去されても，PKCαの1次反 応が起こることが示された．

Fig. 5-26 局所力学刺激によるCa²⁺輝度変化（Ca²⁺ free）

Fig. 5-27 局所力学刺激によるPKCα輝度変化（Ca²⁺ free）

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Fig. 5-28 局所力学刺激によるPKCα輝度変化（Ca²⁺ free：差分画像）

Fig. 5-29 Ca²⁺とPKCαの蛍光輝度比グラフ（Ca²⁺ free，N=5，n=16）

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5.2.8 蛍光変化からのマイクロピペットの

押し込み量と力の推定

PKCα-DGの蛍光変化からマイクロピペットの細胞への押し込み量と，細胞に

与えている力を推定した．細胞高さは10 μmと仮定した．微小変形による押し 込み量は，押し込みによる蛍光輝度比の変化から2.1 μm –3.7 μmと推定した．微 小変形による力（F）はHertz modelを用いて（2）式より算出した[92]．

𝐹 =⁴_31−𝜈^𝐸 ₂√𝑅𝛿³ （2）

ヤング率（E）は1.37 kPaとし，ポアソン比（ν）は0.37とした[93]．本実験で はピペットの先端の直径は3 μmであることから半径Rは1.5 μmとした．（2） 式から本研究で加えた微小変形による力（F）は7.89-18.45 nNと推定された．

また，DGのみ（DG-MN1）を遺伝子導入した細胞に局所力学刺激を加え，刺

激後に細胞膜が創傷していないことを観察した（Fig. 5-30）．さらに，Fig. 5-30B

のようにROI A，ROI B と領域を設定し，DG-MN1と Ca²⁺の輝度変化を測定し

た．DG-MN1 の蛍光は刺激前後で概ね同じであった（Fig. 5-31）．Ca²⁺の輝度変

化からは，刺激位置の輝度（ROI A）が暗くなったのちにROI Bの輝度が暗くな

り，ROI BはROI Aより輝度の回復が早いことが観察された（Fig. 5-32）．

Fig. 5-30 DG-MN1 導入細胞への局所力学刺激による蛍光変化．（A）刺激前，

（B）刺激中，（C）刺激後

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Fig. 5-31 DG-MN1導入細胞への局所力学刺激によるDG-MN1の蛍光変化．

Fig. 5-32 DG-MN1導入細胞への局所力学刺激によるCa²⁺の蛍光変化

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5.2.9 局所力学刺激時の PKC α１次・２次反応まとめ

本実験で得られたPKCαの1次反応と2次反応の有無を表としてまとめた．

Control，Thapsigargin の条件では1次・2次反応共に起こった．Go6976，細胞 外溶液Ca²⁺を除去（Ca²⁺ free）の条件では1次反応のみ起こった．Bryostatin， Gd³⁺の条件では1次・2次反応共に起こらなかった（Table. 5-1）．

Table. 5-1 局所力学刺激時のPKCα 1次・2次反応まとめ

＊Bryostatin ：PKCαのDAG結合ドメイン阻害剤 Go6976 ：PKCα阻害剤，RTK阻害剤

Gd³⁺ ：Ca^2＋透過性MSチャネル阻害剤 Thapsigargin：小胞体内Ca²⁺阻害剤

Ca²⁺ free ：細胞外溶液Ca²⁺を除去 Initial translocation

（M near SP）

Secondary translocation

（Stimulate Point）

Control ○ ○

Bryostatin ― ―

Go6976 ○ ―

Gd³⁺ ― ―

Thapsigargin ○ ○

Ca²⁺ free ○ ―