考察

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5.3.2 PKCα の二相性トランスロケーションと

Ca

・ DAG の関係

先行研究において，PKCαトランスロケーションの動態を改変したベイトマン 方程式にフィッティングすることでパラメータ化した研究がある[34][100]．

𝑅 = 𝑅₀+ 𝑆𝑘_𝑜𝑛⁄（𝑘_𝑜𝑛− 𝑘_𝑜𝑓𝑓）（𝑒^{−𝑘𝑜𝑓𝑓𝑡}− 𝑒^{−𝑘𝑜𝑛𝑡}） （1）

上記（1）式のRはPKCαの輝度が増加した部分（刺激位置，刺激位置近傍の細 胞膜）を細胞質で割った蛍光輝度比であり，R0は刺激前の蛍光輝度比を表して いる．Sは定数であり，tは時間を表す．KonとKoffはそれぞれPKCα活性化の 反応速度定数，PKCα 非活性化の反応速度定数を表す．Sinnecker と Schaefer ら はkon  koffは低いDAG濃度を意味し，kon  koffは高いDAG濃度を意味すると報 告している[100]．本実験で観察されたPKCαの 1 次反応（Control，小胞体内の Ca²⁺を枯渇，細胞外の Ca²⁺を除去した条件）と 2 次反応（Control，小胞体内の Ca²⁺を枯渇）を（1）式にフィッティングした（Table. 5-1）．PKCaの1次反応に 関しては3つの条件で有意な差はなく，Ca²⁺の増加と同時にPKCαは活性化され

た．Schaeferらはヒト胎児由来腎臓細胞において，Carbachol（20 μM）負荷中で

Ca²⁺オシレーションとほぼ同時に PKCa がトランスロケーションすると報告し ている[34]．さらに，本研究で得られたKonと Koffに有意差はなく，それぞれ 0.17 s⁻¹–0.20 s⁻¹ と0.16 s⁻¹–0.18 s⁻¹であるが，これは薬理学的な結果と似ている

ことから[100]，局所的な力学刺激における PKCα の 1 次反応が，GPCR を含む

薬理学的な反応と同じ経路である可能性を示唆する．

細胞外の Ca²⁺を除去した実験でも細胞内の Ca²⁺濃度上昇観察されたが，これ はTsukamotoらの実験でも報告されている[72]．Tsukamotoらの実験ではPLCの 活性化は局所的な力学刺激によって小胞体内の Ca²⁺が放出されることと，細胞 内のCa²⁺伝播が関与していると報告している．このことはDAGが産生されてい る可能性を示唆している．本実験からもDAG結合ドメインを阻害時にはCa²⁺濃 度上昇が起こったにもかかわらず，PKCαの1次反応は見られなかった．これら の結果から，PKCαの 1 次反応には細胞内の Ca²⁺濃度上昇と DAG 依存性の C1 ドメインが必要であることが示唆された．一方，PKCαの2次反応は Controlと 小胞体内のCa²⁺を枯渇させた条件でKonとKoffに有意差はなく，1次反応に比 べて有意に小さい値になったことから，1次と2次のトランスロケーション機構 は異なる可能性が示された．Maaschらは局所的なCa²⁺がPKCαの膜への親和性 を増加させると報告している[56]．また Medkova らは cPKC はまず Ca²⁺依存性 のC2ドメインを介して細胞膜表面に結合し，次にC1ドメインの1部分である

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C1aドメインが膜へ挿入されるように構造変化することでDAGに結合すると提 案している[101] [102]．さらに，NalefskiとNewtonらも，Ca²⁺のC2ドメインへ の結合が細胞膜に対する親和性を有意に高くし，Ca²⁺濃度が高いままである限り DAGを細胞膜上で探索すると提案している[54]．また，産生されたPIP2やDAG は細胞膜上を拡散することがわかっている[103][104]．このメカニズムに基づく と，PKCαの 1 次反応は細胞に広がる Ca²⁺濃度上昇によって引き起こされ，細 胞膜へトランスロケーションすることが可能になる．しかし，局所的な力学刺激 では薬理学的な刺激よりも DAG の産生が低いだろうと考えられる．Tsukamoto らの実験ではPLCの活性化はCa²⁺伝播と平行して細胞質全体で生じ，特に刺激 位置付近では高い活性化をしてる[72]．本実験からも細胞全体にCa²⁺伝播しても，

刺激位置から遠い細胞膜付近では PKCα の輝度上昇が変化しないか，減少して いる．一方で，PKCαの2次反応は細胞外からのCa²⁺流入によって引き起こされ るので，刺激位置へPKCαが局在し得る．また2次反応はC1ドメインが阻害さ れたことで起こらなくなるので DAGが必要だと示唆される．PKCα は PMA や PDBuによる薬理学的な手法によって C1ドメインのみで，持続的な活性化を引 き起こすことが報告されている[54][105]．しかしながら，DAG は可逆的な複合 体を介して作用し[102]，その活性化はDAGが迅速に代謝されるため[106]，2次 反応にDAGが必要かどうか，刺激位置にDAGが局在しているのかは不明であ る．C1ドメインとDAGを含む細胞膜の親和性は非常に高く，PKCを細胞膜へ 動員するための分子接着剤として働いていることから[107]，力学刺激における 応答時間がCa²⁺に関係する1次反応よりも長くなる可能性がある．

Table. 5-2 The association（kon）and dissociation（koff）of initial and secondary translocations of PKCα. Data are averaged values ± S.E. ^#P < 0.05 vs control.

Initial translocation Secondary translocation

kon koff kon koff

Control 0.180 ± 0.012 0.181 ± 0.011 0.084 ± 0.006^# 0.084 ± 0.006^#

Thapsigargin 0.168 ± 0.010 0.164 ± 0.011 0.082 ± 0.008^# 0.087 ± 0.010^#

Removal of

extracellular Ca²⁺ 0.197 ± 0.015 0.161 ± 0.022 - -

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5.3.3 PKCα の二相性トランスロケーションと

メカノセンサーの関係

本実験において，Go6976を負荷するとPKCαの1次反応は引き起こされたが，

2次反応は抑制された．Go6976はRTKであるJanus Activating Kinase 2（JAK2） とFms like Tyrosine Kinase 3（FLT3）を阻害するとの報告がある[108]．FLT3は RTKであるPlatelet-Derived Growth Factor-Receptor（PDGF-R）に分類される1種

であり[109]，PDGF-RはPDGF-ABの負荷によってPKCαトランスロケーション

を引き起こすことが報告されている[27]．さらに，PDGF-RによるPKCαトラン スロケーションは GPCR の活性化による PKCα トランスロケーションよりも遅 く反応すると報告がある．このことから本実験における力学刺激がRTKを活性 化し，PKCα の 2 次反応を引き起こしている可能性がある． 1 次反応時間が他 の条件より長く持続したのは Go6976 などの ATP 競合性のある薬剤によって cPKCが細胞膜に長く留まるとの報告と一致する[110][111]．

本研究結果からは，GPCRとRTKが力学刺激によってどのように活性化され ているかは明らかにできていない．従来研究より，伸展刺激によって ATP が放 出されることが報告されている[112]．このATPの放出はヘミチャネルがメカノ センサーとして働くことで行われ，さらに放出された ATP はオートクラインに よってGPCR を活性化すると報告されている[11]．一方，Hayakawaらはアクチ ンストレスファイバーの張力の増加が MS チャネルを活性化すること示し，細 胞骨格であるアクチンはインテグリンと MS チャンルとの間で力の伝達を担っ ていると報告している[113]．近年，Transient Receptor Potential（TRP）チャネル などの Ca²⁺透過性イオンチャネルが MS チャネルとして働くことが報告されて おり[114][115]，これらのCa²⁺透過性イオンチャネルはGd^3＋によって阻害される．

本実験において，Gd^3＋によって Ca²⁺透過性のMSチャネルを阻害すると Ca²⁺濃 度上昇は抑制され，PKCαの1次・2次反応共に見られなかった（Fig. 5-18）．こ のことからGPCRやRTKがMSチャネルを介して力学刺激によって活性化され ている可能性が示唆された．

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