PKCα - GFP の性質確認

作製したPKCα-GFP がPKCαの性質を保っているかATP，PMAを負荷し共焦 点顕微鏡を用いて確認した．Fig.4-4，Fig.4-5からPKCα-GFP が細胞質から細胞 膜へトランスロケーションされていることが確認されたことから，作製した

PKCα-GFP は性質を保っていることが分かった．

Fig. 4-4 ATP負荷によるPKCα-GFP の膜へのトランスロケーション

Fig. 4-5 PMA負荷によるPKCα-GFP の膜へのトランスロケーション

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4.2.4 ATP 負荷による細胞内 Ca

濃度変化と PKCα - GFP の蛍光変化

ATP（200 μM）を負荷した時の細胞内Ca²⁺濃度変化とPKCαの輝度変化をFig.

4-6 ~ 9に示す．ATP負荷によってFura2-AMの輝度が減少したことから，細胞

内のCa²⁺濃度は上昇した（Fig. 4-6, 9）．ATP負荷時のPKCαの蛍光変化をFig.

4-7, 8 に示す．Fig. 4-8 は創傷前の平均画像を各画像から減算したものである．

ATP負荷によって細胞質に分布していた PKCαは細胞の縁に移動した（Fig. 4-7, 8）．今後，Ca²⁺濃度上昇と同時に引き起こるPKCαの反応を1次反応とする．

細胞の縁から5 μmまでの領域でCa²⁺と PKCα輝度変化をグラフ化したものを

Fig. 4-9に示す．ATPの負荷によってFura2-AMの蛍光は1 s以内に有意に減少

（Ca²⁺濃度は上昇）した．Ca²⁺のピークは ATP 負荷後 5.9 s 後に観察された．

PKCα-GFP の蛍光は ATP負荷後 1.5 s 後から上昇し，8.5 s 後にピークを迎え た．この蛍光輝度上昇は30 sまで持続した．

Fig. 4-6 ATP負荷時のCa²⁺輝度変化

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Fig. 4-7 ATP負荷時のPKCα-GFP 輝度変化

Fig. 4-8 ATP負荷時のPKCα-GFP 輝度変化（差分画像）

Fig. 4-9 ATP負荷による細胞内Ca²⁺とPKCα-GFPの蛍光輝度比グラフ N=9, n= 36. Mean ± standard error of the mean. *P<0.05 vs.0 s.

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4.2.5 隣接細胞創傷時の細胞内 Ca

濃度変化と PKCα - GFP の蛍光変化

隣接細胞を創傷したときの細胞内Ca²⁺とPKCα-GFP の輝度変化をFig. 4-10 ~

12に示す．Fig. 4-10 ~ 12の×印はマイクロピペットの先端が当たった箇所を示

す．創傷細胞の Ca²⁺蛍光は全く回復してこなったことから，死んでいることを 示している（Fig. 4-10）．創傷直後に Ca²⁺の蛍光輝度が減少したことが観察され た．PKCαは創傷後約10 sで細胞質から細胞膜へと移動した（Fig. 4-11 ~ 12）． この変化はFig. 4-7 ~ 8に示したATP負荷と同様な1次反応だった．

ATP 負荷時の反応とは異なり，10 s 以降 PKCα の蛍光輝度が創傷側でのみ上 昇が確認された（Fig. 4-11 ~ 12の矢印箇所）．この蛍光輝度上昇は約60 s間持続

し，100 s後には創傷前と同様な値に戻った．以後Ca²⁺濃度上昇から遅れて反応

するPKCαの応答を2次反応とする．Fig. 3-5に示すnear，farの位置で輝度変化 を測定し，グラフ化したものをFig. 4-13 ~ 14に示す．Ca²⁺の輝度は創傷後near で1.2 s，far で2.1 s 後に有意な減少が見られた．PKCαの輝度は創傷後nearで 4.4 s，farで5.6s後に有意な増加が見られた．farでは16 s後に有意差は見られな くなり，約38 sで創傷前と同じ輝度に戻ったが，nearでは輝度上昇が約34 sま で続きピークを迎え，約60 sまで有意差が見られた．その後約100 s後に創傷前 と同じ輝度に戻った．

Fig. 4-10 細胞創傷時のCa²⁺輝度変化

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Fig. 4-11 細胞創傷時のPKCα-GFP輝度変化

Fig. 4-12 細胞創傷時のPKCα-GFP輝度変化（差分画像）

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Fig. 4-13 隣接細胞創傷時のnearにおけるCa²⁺とPKCα-GFPの輝度比グラフ，

N = 10, n = 14. Mean ± standard error of the mean. *P<0.05 vs. 0 s.

Fig. 4-14 隣接細胞創傷時のfarにおけるCa²⁺とPKCα-GFPの輝度比グラフ，

N = 10, n = 14. Mean ± standard error of the mean. *P<0.05 vs. 0 s.

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4.2.6 共焦点顕微鏡を用いた隣接細胞創傷時の

Ca

濃度変化と PKCα - GFP の蛍光変化

焦点顕微鏡を用いて隣接細胞を創傷させたときの細胞内 Ca²⁺と PKCα-GFP の 輝度変化を観察した．細胞創傷によってCa²⁺濃度上昇が起こり，細胞内のPKCα が細胞質から細胞膜へ移動していることが観察された（Fig. 4-15~16）．このこと からPKCαはトランスロケーションしていることが確認された．×印は創傷した 細胞を示す．

Fig. 4-15 共焦点顕微鏡による細胞を創傷させたときのCa²⁺輝度変化

Fig. 4-16 共焦点顕微鏡による細胞を創傷させたときのPKCα-GFP輝度変化

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4.2.7 創傷領域への細胞遊走

隣接細胞を創傷したときに細胞内 PKCα が 2 次反応を起こした細胞の遊走を 3時間観察した（Fig. 4-17）．細胞は時間の経過と伴に創傷領域へと遊走すること が観察された．Fig. 4-18はFura2-AMの蛍光画像で細胞遊走を観察した画像であ

る．Fig. 4-19は創傷前と創傷後3時間の名視野画像である．

Fig. 4-17 隣接細胞創傷による細胞内PKCαの2次反応とその後の細胞遊走（A）

創傷前，（B）隣接細胞創傷によるPKCαの2次反応（矢印はPKCαの2 次反応 している箇所を示す），（C）創傷後1時間，（D）創傷後3時間．点線は創傷前の 細胞の輪郭を表す．×はマイクロピペットによる創傷箇所を示す．スケールバー は40 μm．

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Fig. 4-18 隣接細胞創傷による細胞内Ca²⁺伝播とその後の細胞遊走（A）創傷前，

（B）細胞創傷によるCa²⁺伝播，（C）創傷後 1時間，（D）創傷後 3 時間．点線 は創傷前の細胞の輪郭を表す．×はマイクロピペットによる創傷箇所を示す．ス ケールバーは40 μm．

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Fig. 4-19 隣接細胞創傷前後での名視野画像（A）創傷前，（B）創傷後3時間，点

線は創傷前の細胞の輪郭を表す．×はマイクロピペットによる創傷箇所を示す．

スケールバーは40 μm．