第３章 実験方法
3.2 実験方法
3.2.10 薬剤負荷方法
実験に使用した試薬および購入先と，阻害剤に関しては負荷時間・濃度を以下 表にまとめた．阻害剤の性質確認は付録に記載．
試薬 効果 負荷方法
Adenosine triphosphate
（ATP）
（Sigma:
A2383）
P2 プリン作動 性アゴニスト
ATP（1.1 mg）にHBS 1000 μl を加えて2 mMにし，細胞には終濃度200 μMになる ように添加した．ATPは作製後すぐに使用 した．
Ethylenediaminet etraacetic acid
（EGTA）
（ Dojindo:
G002 ）
Ca2+ 除去
EGTA（3.8 mg）にHBS（Ca2+ free 500 μl）を 加えて20 mMにし，100 μlずつに分注し－
20℃へ保存しストックソリューションを作 製した．細胞には終濃度200 μMになるよう にHBS（Ca2+ free）に入れて使用した．
Phorbol Myristate Acetate
（PMA）
（Sigma:
A8139）
PKCのC1ドメ イ ン ア ゴ ニ ス ト
PMA（1mg）にDMSO 326 μl を加えて5 mM にし，30 μlずつに分注し－20℃へ保存しス トックソリューションを作製した．細胞に はHBS 999 μlに上記を1 μl入れて5 μMに 調整し，調整したもの100 μl をHBS 900 μl に入れることで 500 nM に調整して負荷し た．
Phorbol 12,13-dibutyrate
（PDBu）
（Sigma:
P1269）
PKCのC1ドメ イ ン ア ゴ ニ ス ト
PDBu（1mg）にDMSO 991 μl を加えて2 mM にし，90 μlずつに分注し－20℃へ保存しス トックソリューションを作製した．細胞に はHBS 995 μlに上記を5 μl入れて10 μMに 調整し，調整したもの100 μl をHBS 900 μl に入れることで1 μM に調整して負荷した．
Ionomycin
（wako: 091-05831）
Ca2+イ オ ノ フ ォア．強制的に 細 胞 内 に Ca2+
を流入させる．
Ionomycin（1mg）にDMSO 141 μl を加えて 10 mMにし，10 μlずつに分注し－20℃へ保 存しストックソリューションを作製した．
Ionomycin は遮光して保存した．細胞には
HBS 999 μlに上記を1 μl入れて10 μMに調 整し，調整したもの10 μl をHBS 990 μlに 入れることで100 nM に調整して負荷した．
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阻害剤 効果 負荷方法
Bryostatin 1
（Sigma: B7431）
PKCαのC1ドメ イン（DAG結合）
阻害
Bryostatin 1（10 μg）にDMSO 110 μl を加 えて 100 μM にし，10 μl ずつに分注し－
20℃へ保存しストックソリューションを 作製した．細胞にはDMEM 792 μl に上記 を8 μl入れて1 μMに調整し6時間負荷し た．その後 HBS に入れ替え実験に使用し た．
18α-Glycyrrhetinic
acid
（18α-GA）
（Sigma: G8503）
ヘミチャネルと GAP結合阻害
18α-GA（4.7 mg）にDMSO 500 μlを加えて 20 mMにし，50μlずつに分注し－20℃へ保 存しストックソリューションを作製した．
細胞にはHBS 997.5 μlに上記を2.5 μl入れ
て50 μMに調整し30分負荷した．その後
負荷したまま実験に使用した．
GAP27
（ApexBio:
A1045）
GAP結合阻害
GAP27（5 mg）にHBS 1275 μlを加えて3 mMにし，100 μlずつに分注し－20℃へ保 存しストックソリューションを作製した．
細胞にはHBS 900 μlに上記を100 μl入れ
て300 μMに調整し2時間負荷した．その
後負荷したまま実験に使用した．
Gadolinium Chloride Hexahydrate
（Gd3+）
（Wako: 074-02663）
Ca2＋透過性 MS チャネル阻害
Gd3+（3.72 mg）にdH2O 1000 μlを加えて10 mMにし，100 μlずつに分注し－20℃へ保 存しストックソリューションを作製した．
細胞にはHBS 1996 μlに上記を4 μl入れて
20 μM に調整し 30 分負荷した．その後負
荷したまま実験に使用した．
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Go6976
（sigma : G1171）
PKCα 阻 害 剤． RTKsであるJanus Activating Kinase 2
（JAK2）と fms-like tyrosine kinase 3 （FTL3）阻害剤 でもあり，FTL3は
PDGFR に分類さ
れる．
Go6976（1mg）にDMSO（265 μl）を加え て10 mMにし，50 μlずつに分注し－20℃ へ保存しストックソリューションを作製 した．細胞にはHBS 999 μlに上記を1 μl入
れて10 μMに調整し60分負荷した．その
後HBSに入れ替えて実験に使用した．
Suramin
（sigma : S2671）
P2X，P2Yプリン 受 容 体 阻 害
（GPCR阻害）
Suramin （5.72mg）にHBS1 mlを加えて4 mMにし，200 μlずつに分注し－20℃へ保 存しストックソリューションを作製した．
細胞にはHBS 900 μlに上記を100 μl入れ て400 μMに調整し60分負荷した．その後 負荷したまま実験に使用した．
Thapsigargin
（sigma : T9033） 小胞体Ca2+阻害
Thapsigargin（1 mg）にDMSO（154 μl）を 加えて 1 mM にし，15 μl ずつに分注し－
20℃へ保存しストックソリューションを 作製した．細胞にはまずHBS 999 μlに上記 を1 μl入れて1 μMに調整し，調整したも の200 μl をHBS 800 μlに入れることで200 nMに調整して60分負荷した．その後HBS に入れ替えて実験に使用した．
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