1． 緒⾔
研究課題 4 では、短期間の持久性トレーニング期間中における中程度の鉄サプリメント の摂取は安静時における⾎清ヘプシジン濃度を増加させることが明らかとなった。このこ とは、持久性トレーニング期間中の鉄サプリメント摂取は、鉄⽋乏の予防に必ずしも適切で ない可能性を⽰すものと考えられる。
2015年に、Relative energy deficient in sports (RED-S)の概念が提唱されて、スポーツ競技者 における相対的エネルギー不⾜でのトレーニングはコンディショニングやパフォーマンス に悪影響を及ぼすことが⽰された(Mountjoy et al. 2015)。動物実験を⽤いた近年の報告によ ると、ヘプシジンの産⽣は絶⾷に伴い亢進する(Vecchi et al. 2014)。さらにヒトを対象とした 研究では、⼀過性の持久性トレーニング時の負のエネルギー収⽀バランスは、ヘプシジンの 分泌増⼤と関連することが⽰されている(Pasiakos et al. 2016)。さらに、研究課題3では、翌 朝の⾎清ヘプシジン濃度の上昇がレプチン濃度と負の相関関係を⽰したことから、エネル ギーバランスの変化がヘプシジンの分泌増⼤に関与しているものと推察される。
筋グリコーゲン量が低下した状態での運動ではIL-6の産⽣が亢進する(Pedersen et al.
2001)。したがって、LEA (利⽤可能なエネルギー量の低下した状態)でのトレーニングは、
利⽤可能なエネルギー量が通常状態でのトレーニングと⽐較してヘプシジンの分泌を亢進 させる可能性が⾼い。⼀⽅で、連⽇実施する持久性トレーニング時におけるエネルギーバ ランスの違いがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響は明らかにされていない。そのために は、持久性トレーニング期間中におけるエネルギー消費量およびエネルギー摂取量を管理 した上で、異なるエネルギーバランスでトレーニングを実施する際のヘプシジンの分泌応 答を⽐較することが有⽤であると考えられる。そこで、本研究では異なるEAでの3⽇間 連続した持久性トレーニングが筋グリコーゲン量およびヘプシジンの分泌応答に及ぼす影 響を検討することを⽬的とした。ここではLEA状態でのトレーニングは筋グリコーゲン量
61
を減少させ、ヘプシジンの分泌を亢進させるという仮説を設けた。
2． ⽅法
（1） 被験者
男⼦陸上⻑距離選⼿7名を対象とした｛年齢：19.8 ± 0.4 yrs, ⾝⻑：1.75 ± 0.02 m, 体重：
61.4 ± 2.0 kg, 最⼤酸素摂取量 (AEV・EAOR2maxR)：67.5 ± 1.63mL/kg/min｝。実験に参加したすべての被 験者は健康であり、週 6⽇以上定期的にトレーニングを実施していた (4 時間/⽇)。すべて の被験者に対し、研究の⽬的、測定内容および参加に伴う危険性について⼗分に説明し、書
⾯にて協⼒への同意が得られた者のみを対象とした。なお、本研究は、国⽴スポーツ科学セ ンターに帰属する倫理委員会の承認を得て実施した (IRB-2016-023)。
（2） 実験デザイン
被験者は、事前に測定したAEV・EAO₂RmaxRの70 ％に相当する⾛速度での75分間のランニング運 動を、3⽇間連続で実施した。EAは、エネルギー摂取量 (Energy Intake ; EI)からエネルギー 消費量 (Energy Expenditure ; EE)を引いたものを除脂肪体重 (Lean Body Mass ; LBM)で除す ことにより算出した｛EA (kcal/kg LBM) ＝ (EI – EE)/LBM｝。その際、エネルギー消費量に 対して、エネルギー摂取量を⼗分に確保したNeutral Energy Availability (NEA)条件およびEA が低いLEA条件の2条件を設け、両条件をランダムに実施した。条件間には、約2週間を 設けた。
トレーニング開始1⽇⽬ (Day 1)、2⽇⽬(Day 2)、3⽇⽬ (Day 3）、4⽇⽬(Day 4、トレー ニング終了翌⽇)の早朝空腹時に採⾎および筋グリコーゲン量の測定を実施した。さらに、
トレーニング後におけるヘプシジンの⼀過性の分泌応答を評価するために各条件のトレー ニング3⽇⽬の運動直後 (Day 3 Post 0 h)、3時間後 (Day 3 Post 3 h)に採⾎を実施した。ま た、早朝空腹時およびトレーニングの前後においてVisual analog scale (VAS)を⽤いて、疲労 および筋痛の程度を評価した (Fig. 14)。
すべての被験者は、1⽇⽬〜4⽇⽬の8:00に研究室に集合し、安静後に体組成の計測、採
⾎およびVASを⽤いた主観的疲労度および筋痛の評価を⾏った。トレーニング時の飲み物
62
は⽔のみとし、飲⽔量は1条件⽬のトレーニング時に計量し、2条件⽬では1条件⽬とでき る限り同量を飲むように指⽰した。飲⽔のタイミングは、被験者の⾃由とした。
Figure 14. Experimental design during training period.
トレーニングの内容
持久性トレーニングとして、70 ％AEV・EAOR2maxRに相当する⾛速度で 75 分間のランニングを実 施した。運動時は、連続的に⼼拍数 (RCX5、ポラール・エレクトロ・ジャパン株式会社) を測定した。連⽇のトレーニングによる疲労の蓄積が原因で規定の⾛速度に追随できなか った場合には、⾛速度を低下させトレーニングを継続させた。
規定⾷の設定
IOCは、EAが45 kcal/kg FFM以上であれば、運動後によるエネルギー消費量とエネルギ
ー摂取量のバランスがとれ、体重の維持ができるとしている。⼀⽅、EAが30kcal/kg FFMを 下回った際、代謝に関連する内分泌動態に影響がみられ、⼥性では⽉経異常を誘発する可能 性があるとされている(Mountjoy et al. 2014)。これらを踏まえ、本研究では、先⾏研究を参考 にNEA条件ではEAを45 kcal/kg FFM以上、LEA条件ではEAを20 kcal/kg FFM以下に設
63
定した(Koehler et al. 2016)。75分間のランニング時のEEは、｛3.9 × AEV・EAOR2R (L / min)＋1.1 × (AEV・E
ACOR2 RL / min) × 0.7 × 75 min｝として算出した。各条件のEAを満たすように、管理栄養⼠が 被験者毎に規定⾷を調整した。
（3） 測定項⽬
⾛速度の決定
多段階漸増負荷法により AEV・EAOR2maxRを評価した。A EV・EAOR2maxRの測定には、トレッドミル
(ORK-7000, ⼤⽵ルート⼯業，岩⼿)を使⽤した。最⼤下運動として 3 分間の漸増負荷テストを 6
ステージ⾏なった後、5 分間の休憩をはさみ、AEV・EAOR2maxRの測定を実施した。最⼤下運動では、
速度の設定は 12.6 km/h または 13.8 km/h を初速として、ステージが上がる毎に 1.2 km/h ずつ漸増させた。6ステージの終了後に、5分間の安静を経て、毎分0.6 km/hずつ⾛速度を 漸増させ疲労困憊に⾄るまで運動を継続した。
呼気ガスパラメータの測定には、代謝分析測定機 (AE310-S、ミナト医科学株式会社、⼤
阪)を⽤いた。得られたデータから30秒毎の平均値を算出した。測定開始前には、既知の酸 素濃度および⼆酸化炭素濃度の混合ガスを⽤いて、酸素および⼆酸化濃度計の校正を⾏っ た。得られたデータから、70 %AEV・EAOR2maxRに相当する⾛速度を算出した。
⾎液指標
トレーニング期間中 (1⽇⽬〜4⽇⽬)の早朝安静時、3⽇⽬の運動直後および運動3時間 後に採⾎を実施した。得られた⾎液から、末梢⾎液検査の⼀般項⽬として⾎中ヘモグロビン
(Hb)濃度を測定した (株式会社 LSI メディエンス、東京)。それ以外の⾎液は、4 ℃、3000
rpm で10 分間遠⼼分離し、⾎清および⾎漿を得た。得られた⾎清および⾎漿は解析までの 間、−80 ℃の超低温冷凍庫で保存した。
⾎清からは、フェリチン、鉄濃度およびTIBC を測定した (株式会社 LSIメディエンス、
東京)。⾎清ヘプシジンおよび⾎漿IL-6濃度は、市販のキット (R＆D Systems Inc., Minneapolis,
MN, USA)を⽤いたELISA 法によって解析した。ELISA 法を⽤いた解析では、全てのサン
プルを2 回分析し、その平均値を算出した。ELISA法の解析に伴う CV 値は、5.2 ％
(IL-64
6)、3.4 ％ (ヘプシジン)であった。
主観的疲労度および筋痛
主観的疲労度および筋⾁痛は、VAS を⽤いて評価した。VAS の⾃⼰評価スコアは、100 mm の線分とし、左端 (0)には「全く疲れていない」、右端 (100)には「とても疲れている」
状態と表記し、今の状態のレベルがどこに位置するかその線分上に印を記⼊させた。筋痛は、
左端には「全く痛みがない」、右端には「とても痛い」と教⽰し、疲労度と同様に記⼊させ た。
筋グリコーゲン量
炭素磁気共鳴分光法 (P13PC-MRS)を⽤いて、右下腿三頭筋より筋グリコーゲン量を測定した。
被験者は MRI 装置内で仰臥位になり、直径10 cmのP13PC-P1PH 表⾯コイルを⽤いて右下腿三 頭筋中央部におけるP13PC-MRS スペクトルを収集した (1回あたり 15分間測定)。収集した データは 120 mmol/L のグルコース溶液のファントムデータと⽐較を⾏い、筋グリコーゲン 量を算出した。なお、各被験者のファントムサイズは実験の前⽇にあらかじめ撮影した下腿 三頭筋断⾯画像より、被験者ごとに決定した(Takahashi et al. 2015)。
（4） 統計解析
すべての測定値は、平均値 ± 標準誤差 (Means ± SE)で⽰した。条件間における各変数の 平均値の差の検定には、反復測定による⼆元配置の分散分析 (two-way ANOVA)を⽤い、交 互作⽤および主効果の有無を検定した｛条件 (NEA条件、LEA 条件) × 期間 (1⽇⽬〜4 ⽇
⽬)、条件 (NEA条件、LEA条件) × 時間 (3⽇⽬安静時、Post 0 h、Post 3h)｝。⼆元配置の分 散分析においては、Mauchly の球⾯性の検定を⾏い、球⾯性が仮定できなかったときには
Greenhouse-Geisser のイプシロンを⽤いて、⾃由度を修正した。ANOVA により交互作⽤ま
たは主効果が認められた場合は、Tukey法により多重⽐較検定を⾏った。統 計 解 析には、
SPSS software ver. 22.0 (International Business Machines Co., USA)を⽤いて、有意⽔準は危険率 5 ％未満に設定した。
65 3． 結果
（1） トレーニング期間中の栄養摂取状況
Table 16 には、各被験者のトレーニング当⽇における栄養摂取状況およびEA を⽰した。
1⽇あたりのエネルギー、炭⽔化物摂取量およびEAは、LEA条件が有意に低値を⽰した (p
< 0.05, vs. NEA trial)。
Table 16. Total energy and macronutrients intake during training period.
Condition Day 1 Day 2 Day 3
Energy intake (kcal)
NEA 3921 ± 60 3906 ± 64 4073 ± 145
LEA 2053 ± 64 P
† 2105 ± 58 P
† 2085 ± 61 P
†
Protein
(g) (%)
NEA 159.5 ± 3.8 161.1 ± 5.5 159.3 ± 6.6 LEA 104.6 ± 8.0 P
† 116.8 ± 4.2 P
† 111.8 ± 6.1 P
†
NEA 16.3 ± 0.3 16.5 ± 0.4 15.7 ± 0.5
LEA 20.3 ± 1.3 22.2 ± 0.4 21.4 ± 0.9
Fat
(g) (%)
NEA 116.3 ± 8.1 116.3 ± 7.3 117.9 ± 4.7
LEA 52.8 ± 3.5 P
† 58.5 ± 3.0 P
† 60.5 ± 5.4 P
†
NEA 26.6 ± 1.7 26.7 ± 1.5 26.0 ± 0.4
LEA 23.0 ± 1.0 24.9 ± 0.8 26.0 ± 2.1
CHO
(g) (%)
NEA 550.1 ± 35.4 545.0 ± 13 581.6 ± 21.6 LEA 285.7 ± 8.8 P
† 276.6 ± 6.3 P
† 270.7 ± 15.3 P
†
NEA 57.0 ± 1.6 56.8 ± 1.6 58.3 ± 0.7
LEA 56.7 ± 1.8 52.9 ± 1.0 52.6 ± 2.7
CHO/BW
(g/kg)
NEA 9.2 ± 0.5 8.9 ± 0.3 9.5 ± 0.3
LEA 4.7 ± 0.2 P
† 4.5 ± 0.1 P
† 4.5 ± 0.3 P
† EA
(kcal/FFM)
NEA 50.6 ± 2.3 50.1 ± 2.3 53.1 ± 2.0
LEA 16.3 ± 0.7 P
† 17.7 ± 0.8 P
† 17.9 ± 0.9 P
† Value are means ± SE. P†P; p < 0.05 (vs. NEA)
66
（2） ⾛⾏距離および⼼拍数
Table 17には、3⽇間のトレーニング期間中の⾛⾏距離を⽰した。条件間において、有意
差は認められなかった。
Table 17. Running distance and heart rate during training period.
Value are means ± SE.
Condition Day 1 Day 2 Day 3
Running distance (km/day)
NEA trial 19.5 ± 0.4 19.1 ± 0.03 19.1 ± 0.4 LEA trial 19.5 ± 0.4 19.2 ± 0.3 18.3 ± 0.5 Heart rate
(bpm)
NEA trial 155.0 ± 3.5 149.1 ± 2.6 149.7 ± 12.6 LEA trial 152.3 ± 4.9 151.8 ± 4.1 151.3 ± 0.7
67
（3） 体組成
Table 18には、1⽇⽬から4⽇⽬における早朝空腹時の⾝体組成の変化を⽰した。体重、
除脂肪体重、⾻格筋量の変化には有意な交互作⽤、条件および時間の主効果が認められ、
LEA条件で、体重および体脂肪が2⽇⽬および4⽇⽬において有意な減少を⽰した (vs. Day 1, p < 0.05)。
Table 18. Body weight, lean body mass, skeletal muscle and fat mass during training period.
Condition Day1 Day 2 Day 3 Day 4
Body Weight NEA 61.9 ± 2.0 62.2 ± 2.1 62.1 ± 2.1 62.2 ± 2.1
(kg) LEA 61.9 ± 2.0 61.1 ± 2.0 P
*† 61.0 ± 2.1 P
*† 60.7 ± 2.1 P
*†
Lean body mass
(kg)
NEA 55.2 ± 2.0 55.6 ± 2.1 55.3 ± 2.0 55.7 ± 2.0 LEA 55.5 ± 2.0 54.6 ± 2.0 P
*† 55.0 ± 2.1 54.5 ± 2.1 P
*†
Skeletal muscle
(kg)
NEA 31.4 ± 1.2 31.6 ± 1.3 31.4 ± 1.2 31.6 ± 1.3 LEA 31.6 ± 1.2 31.3 ± 1.2 P
*† 31.3 ± 1.3 30.9 ± 1.3 P
*†
Fat mass (kg)
NEA 6.8 ± 0.8 6.7 ± 0.7 6.8 ± 0.8 6.5 ± 0.8
LEA 6.4 ± 0.8 6.4 ± 0.7 6.0 ± 0.7 P
† 6.2 ± 0.7 Value are means ± SE. *; Significant difference from resting on Day1.
P
†
P; Significant difference from NEA trial.
68
(mm)
Fatigue
0 20 40 60 80
100 NEA
LEA
*
*
*
（4） 疲労度および筋痛
Figure 15には、1⽇⽬から4⽇⽬における疲労度および筋痛の変化を⽰した。疲労度およ
び筋痛には、有意な交互作⽤および条件の主効果はみられず、時間の有意な主効果のみ認め られた。
（A）
(B)
Figure 15. Scores of fatigue(A) and muscle soreness(B) during training period Value are means ± SE. *; Significant difference from resting on Day1.
0 20 40 60 80 100
NEA LEA
Muscle soreness
(mm)
* *
*
69
（5） ⾎液指標 末梢⾎液⼀般
Table 19には、1⽇⽬および4⽇⽬における末梢⾎液⼀般の結果を⽰した。鉄⽋乏性貧⾎
(⾎中ヘモグロビン濃度 12g/dL以下)に該当するものは、みられなかった。
Table 19. Hemoglobin, MCV, MCH and MCHC during training period.
Value are means ± SE.
Condition Day 1 Day 4
Hemoglobin (g/dL) NEA 14.4 ± 0.4 13.9 ± 0.7
LEA 14.5 ± 0.2 14.4 ± 0.7
MCV (fL) NEA 91.6 ± 3.6 92.0 ± 4.4
LEA 92.6 ± 5.8 91.3 ± 4.9
MCH (pg) NEA 29.8 ± 1.5 29.9 ± 1.5
LEA 29.9 ± 1.7 29.8 ± 1.3
MCHC (%) NEA 32.5 ± 0.7 32.4 ± 0.7
LEA 32.4 ± 0.7 32.7 ± 0.9
70 鉄関連指標
Table 20には、⾎清フェリチン、鉄濃度およびTIBC濃度の結果を⽰した。⾎清鉄濃度お
よびTIBCには、有意な交互作⽤および条件の主効果は⽰されず、時間の有意な主効果のみ が認められた。⾎清フェリチン濃度には、交互作⽤、条件および時間の主効果が認められ、
4⽇⽬においてLEA条件が有意に⾼値を⽰した (p < 0.05, vs. Day1)。
Table 20. Serum ferritin, iron and TIBC levels during training period.
Condition Day 1 Day 2 Day 3 Day 4
Ferritin (ng/mL)
NEA 31.5 ± 17.4 --- --- 36.0 ± 24.2
LEA 36.2 ± 21.9 --- --- 50.2 ± 27.9 P
*†
Fe (μg/dL)
NEA 136 ± 92 135 ± 55 94 ± 20 126 ± 22
LEA 119 ± 68 157 ± 44 * 131 ± 30 152 ± 33 *
TIBC (μg/dL)
NEA 354 ± 26 347 ± 29 348 ± 27 347 ± 28
LEA 352 ± 35 361 ± 34 355 ± 35 348 ± 33
Value are means ± SE. *; Significant difference from resting on Day1.
P
†
P; Significant difference from NEA trial.
71 (ng/mL)
0 10 20 30 40 50
60 p< 0.05
LEA NEA
⾎清ヘプシジン濃度
Figure 16には、⾎清ヘプシジン濃度を⽰した。1⽇⽬から4⽇⽬までの安静時における⾎
清ヘプシジン濃度の変化には、有意な交互作⽤および条件に対する主効果は認められず、時 間に対する有意な主効果のみが認められた。⼀⽅で、濃度曲線下⾯積は、LEA 条件が有意 に⾼値を⽰した (p < 0.05)。運動前後における⾎清ヘプシジン濃度の変化には、交互作⽤お よび主効果は認められず、時間に対する主効果が認められた。濃度曲線下⾯積は、LEA 条 件が⾼値傾向を⽰した (p = 0.065)。
（A） （B）
（C） （D）
Figure 16. Serum hepcidin levels at rest on Days 1-4(A, B) and before and after exercise on Day3 (C, D).
Value are means ± SE. *; Significant difference from before exercise.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
LEA NEA
(ng/mL) p= 0.063
Day 1 Day 2 Day 3 Day 4
0 5 10 15 20 25 30
(ng/mL)
p
NEA trial LEA trial
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Rest Post 0 h Post 3 h
(ng/mL)
*
*
*
NEA trial LEA trial