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Ⅳ. 短期間のトレーニングがヘプシジンの分泌応答に及ぼす影響
47
討した。ここでは、3 ⽇間の持久性トレーニングが⾎清ヘプシジン濃度を増加させること、
持久性トレーニング期間中の鉄サプリメントの摂取は⾎清ヘプシジン濃度の増加を亢進さ せるという２つの仮説を設けた。
2． ⽅法
（1） 被験者
男⼦⼤学⽣持久性競技者 (陸上競技⻑距離選⼿およびトライアスロン選⼿)14名を対象と した｛年齢：19-22 yrs, ⾝⻑：168 ± 1 cm, 体重：55.9 ± 1.1kg, 最⼤酸素摂取量 (AEV・EAOR2maxR)：59.6
± 0.8mL/kg/分｝。実験に参加したすべての被験者は健康であり、週4⽇以上定期的にトレー
ニングを実施していた。すべての対象者に対し、研究の⽬的、測定内容および参加に伴う危 険性について⼗分に説明し、書⾯にて協⼒への同意が得られた者のみを対象とした。なお、
本研究は、⽴命館⼤学に帰属する倫理委員会の承認を得て実施した (BKC-IRB-2015-023)。
（2） 実験デザイン
14名の被験者を鉄サプリメント群（Fe群; n = 7）またはプラセボ群（CON群; n = 7）のい ずれかに分類した。なお、各群への分類は事前に測定をしたAEV・EAOR2max Rに基づき、Fe群とCON 群においてAEV・EAOR2maxR の平均値が同様になるように配慮した。
各群における被験者は、事前に測定した AEV・EAOR2maxRの75 ％に相当する⾛速度で75分間のラ ンニングを1⽇2回（150分）、3⽇間連続で実施した。この際、Fe群では、1回⽬のトレー ニング前およびトレーニング直後に鉄のサプリメント（12 mg/回，ピロリン酸鉄）を溶かし たドリンク（100 mL）を摂取した（1⽇あたり24 mg）(Rietjens et al. 2002)。⼀⽅、CON群 では、⾵味付きのドリンク（100 mL）を摂取した。提供されたドリンクの種類は、被験者に 開⽰しなかった（シングルブラインド・プラセボ対照試験）。トレーニング期間（1〜3⽇⽬）
およびトレーニング終了翌⽇（4⽇⽬）の早朝空腹時に前腕静脈から採⾎を実施した。なお、
各条件のトレーニング1⽇⽬の2回⽬の運動3時間後においても採⾎を実施した。
すべての被験者は、1⽇⽬〜4⽇⽬の8:00に研究室に集合し、安静後に体組成の計測、採
⾎およびVisual analog scale（VAS）を⽤いた主観的疲労度および筋痛の評価を⾏った。トレ
48
ーニング時の飲み物は⽔のみとし、飲⽔量やタイミングは被験者の⾃由とした。また、3⽇ 間のトレーニング期間中の⾷事は規定⾷とし、各⽇の 11:00、13:30 および 19:00 に提供し た。
トレーニングの内容
1⽇2回の持久性トレーニングとして、午前（Ex 1; 8：30〜10：45）および午後（Ex 2; 13：
00〜14：15）に75 ％AEV・EAOR2maxRに相当する⾛速度で75分間のランニングを実施した。運動時 は、連続的に⼼拍数を測定した。連⽇のトレーニングによる疲労の蓄積が原因で規定の⾛速 度に追随できなかった場合には、⾛速度を低下させ、トレーニングを継続させた。
規定⾷の設定
⾷事からの鉄などの栄養素の摂取量を統⼀させるため、3⽇間のトレーニング時の⾷事は 規定⾷を提供した。トレーニング期間中は毎朝体重を測定し、トレーニング開始⽇より体重 が2 kg以上の増減がないように調整した。
（3） 測定項⽬
⾛速度の決定
3⽇間のトレーニング開始の約2週間前に、多段階漸増負荷法によりAEV・EAOR2maxRを評価した。
AEVE・AOR2maxRの測定には、トレッドミル（Life Fitness 95T, Chicago IL, USA）を使⽤した。最初のス テージの⾛速度は時速6 kmとし、毎分時速2 kmずつ増加させた。⾛速度が時速14.6 kmに 達してからは、毎分時速0.6 kmずつ増加させた。トレッドミルの勾配は0 ％であった。運 動中は、呼気ガスパラメータおよび⼼拍数を連続的に測定した。呼気ガスパラメータの測定 には、代謝分析測定機（AE300S、ミナト医科学株式会社、⼤阪）を⽤いて、breath-by-breath 法により評価した。得られたデータからは30秒毎の平均値を算出した。運動測定開始前に は、既知の酸素濃度および⼆酸化炭素濃度の混合ガス（⾼千穂化学⼯業株式会社、東京）を
⽤いて、酸素および⼆酸化濃度計の校正を⾏った。また、流量（換気量）を計測するための トランスデューサーの校正は、2 L の専⽤シリンジを⽤いて⾏った。得られたデータから、
49 75 %AEV・EAOR2maxRに相当する⾛速度を算出した。
⾎液指標
実験期間中（1〜4⽇⽬）の安静時およびトレーニング1⽇⽬のEx 2の3時間後に採⾎を 実施した。得られた⾎液から、末梢⾎液検査の⼀般項⽬として⾎中ヘモグロビン（Hb）濃度 を測定した。末梢⾎液検査は、臨床検査会社に委託をした（株式会社 ファルコバイオシス テムズ、京都）。それ以外の⾎液は、4 ℃、3000 rpm で10 分間遠⼼分離し、⾎清および⾎
漿を得た。得られた⾎清および⾎漿は解析までの間、-80 ℃の超低温冷凍庫で保存した。
⾎清からは、フェリチン、鉄、TIBCおよびCK、⾼感度C反応性たんぱく質（hsCRP）お よびミオグロビンを測定した（株式会社SRL、東京）。トランスフェリン飽和度（TSAT）は、
⾎清鉄濃度/⾎清TIBC濃度×100 として計算した。⾎漿 IL-6 濃度は、市販のキット（R＆D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA）を⽤いたELISA 法によって解析した。ELISA 法を⽤い た解析では、全てのサンプルを2 回分析し、その平均値を算出した。
⾎ 清 ヘ プ シ ジ ン 濃 度 の 測 定 に は 、 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 質 量 分 析 法 ｛Liquid chromatography (LC)-mass spectrometry (MS)/MS｝を⽤いた。⾎液解析に伴うCV値は、0.6 ％
（Hb）、3.8 ％（フェリチン）、1.4 ％（鉄）、1.6％（TIBC）、2.3 ％（CK）、3.2 ％（hsCRP）、
3.4 ％（ミオグロビン）、 5.2 ％（IL-6）であった。
主観的疲労度および筋痛
主観的疲労度および筋⾁痛は、VAS を⽤いて評価した。VAS の⾃⼰評価スコアは、100 mm の線分とし、左端（0）には「全く疲れていない」、右端（100）には「とても疲れてい る」状態と表記し、測定時の主観に応じて線上に印を記⼊させた。筋痛は、左端には「全く 痛みがない」、右端には「とても痛い」と教⽰し、疲労度と同様に記⼊させた(McCormack et al. 1988)。
50
（4） 統計解析
検定したすべての測定値は、平均値 ± 標準誤差（Means ± SE）で⽰した。群間における 各変数の平均値の差の検定には、反復測定による⼆元配置の分散分析（two-way ANOVA）を
⽤い、交互作⽤および主効果の有無を検定した｛群（Fe群, CON 群）× 期間（1⽇⽬〜4⽇
⽬）｝。⼆元配置の分散分析においては、Mauchlyの球⾯性の検定を⾏い、球⾯性が仮定でき なかったときには Greenhouse-Geisser のイプシロンを⽤いて、⾃由度を修正した。ANOVA により交互作⽤および主効果が認められた場合は、Tukey 法により多重⽐較検定を⾏った。
また、p値に加えて、Cohenのd値（独⽴したt検定）または偏イータ2乗（two-way ANOVA）
により、効果量（Effect Size; ES）を算出した。統 計 解 析には、SPSS software ver. 22.0
（International Business Machines Co., USA）を⽤いて、有意⽔準は危険率 5 ％未満に設定し た。
3． 結果
（1） ⾛⾏距離および⼼拍数
Table 12には、トレーニング時の⾛⾏距離および平均⼼拍数を⽰した。いずれの項⽬にお
いても、群間に有意差はみられなかった。 3⽇間のトレーニング（合計6回のトレーニン グ）における総⾛⾏距離は、Fe群では101.9 ± 2.6 km、CON群では98.0 ± 3.3 kmであり、群 間で有意差はみられなかった（p > 0.05）。
Table 12. Running distances and HR during training period.
Group Day 1 Day 2 Day 3
Running distance Fe 34.5 ± 0.9 34.5 ± 0.9 34.5 ± 0.9
(km) CON 33.3 ± 0.7 33.3 ± 0.7 33.3 ± 0.7
Heart rate (bpm)
Ex1 Fe 158 ± 4 157 ± 4 154 ± 3
CON 156 ± 5 156 ± 4 154 ± 2
Ex2 Fe 158 ± 4 154 ± 4 156 ± 4
CON 159 ± 5 158 ± 3 153 ± 3
Value are means ± SE.
51
（2） ⾎液指標 鉄関連指標
1⽇⽬の⾎中Hb濃度には、群間で有意差はみられなかった（Fe群：15.4 ± 0.3g / dL、CON 群：15.4 ± 0.5g / dL、p > 0.05）。 Table 13には、⾎清フェリチン、鉄濃度およびTSATの1
⽇⽬から4⽇⽬までの変化を⽰した。⾎清フェリチン、鉄濃度およびTSATには、有意な交 互作⽤および群の主効果は⽰されず、時間の有意な主効果のみが認められた。
Table 13. Serum ferritin, iron levels, TSAT during Days 1-4.
Group Day 1 Day 2 Day 3 Day 4
Ferritin Fe 47.9 ± 9.3 52.2 ± 9.3 56.9 ± 9.0 61.4 ± 10.0 (ng/mL) CON 38.0 ± 9.5 39.8 ± 10.8 44.9 ± 11.2 47.6 ± 11.1
Iron Fe 89.1 ± 11.5 115.6 ± 10.0 120.1 ± 9.3 91.3 ± 13.5 (µg/dL) CON 73.3 ± 15.8 143.1 ± 23.3 120.1 ± 13.9 129.7 ± 7.5
TSAT Fe 31.4 ± 5.0 40.9 ± 3.5 44.9 ± 5.6 34.1 ± 6.0 (%) CON 24.4 ± 4.7 50.2 ± 10.1 42.4 ± 6.2 46.5 ± 3.7
The values are means ± SE. Serum ferritin; Interaction (group×time) : p = 0.504 (ES = 0.005), Main effect for group : p = 0.445 (ES = 0.05), Main effect for time: p = 0.008 (ES = 0.47), Serum iron:
Interaction (group × time): p = 0.069 (ES = 0.19), Main effect for group (p = 0.321, ES = 0.08), Main effect for time: p = 0.001 (ES = 0.36), Serum TSAT: Interaction: p = 0.056 (ES = 0.19), Main effect for group : p = 0.598 (ES = 0.02), Main effect for time: p = 0.001 (ES = 0.38)
52 筋損傷および炎症関連指標
Figure 11には、⾎清ミオグロビン、CKおよびhsCRP濃度の1⽇⽬から4⽇⽬までの変
化を⽰した。⾎清ミオグロビン濃度の変化には、有意な交互作⽤および群の主効果はみられ ず、時間の有意な主効果のみが認められた。⾎清CKおよび hsCRP濃度の変化には、交互 作⽤、時間および群に対する有意な主効果はみられなかった。
Figure 12には、⾎漿IL-6濃度の変化を⽰した。1⽇⽬の運動前後での⾎漿IL-6濃度の変
化には、時間の主効果が認められ、両群ともに有意な増加を⽰した。1⽇⽬から4⽇⽬まで の変化には、有意な交互作⽤および群の主効果は⽰されず、時間の有意な主効果のみが認め られた。
Figure 11. Serum myoglobin (A), CK (B) and hsCRP (C) levels during Days 1-4.
Value are means ± SE. *; Significant difference from Day1.
Training period
Training period Training period
0 20 40 60 80 100 120
Day 1 Day 2 Day 3 Day4
(A)
Serum myoglobin (ng/mL) Serum CK (IU)
(B)
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Day 1 Day 2 Day 3 Day 4
Serum hsCRP(mg/dL)
(C)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200
Day 1 Day 2 Day 3 Day 4
*
*
*
* *
* *
*
Interaction (group×time) : p= 0.907 (ES = 0.01) Main effect for condition : p= 0.466 (ES =0.05) Main effect for time : p= 0.006 (ES = 0.38)
Interaction (group ×time) : p= 0.410 (ES = 0.01) Main effect for condition : p= 0.632 (ES = 0.02) Main effect for time : p< 0.001 (ES = 0.33) Fe group
CON group
Interaction (group×time) : p= 0.695 (ES = 0.03) Main effect for condition : p= 0.404 (ES = 0.06) Main effect for time : p= 0.010 (ES = 0.26)
Fe group CON group
Fe group CON group
53
Figure 12. Plasma IL-6 levels before and after exercise on Day1(A) and resting levels during Days 1-4(B).
Value are means ± SE. *; Significant difference from resting on Day1.
Training period 0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
Day 1 Day 2 Day 3 Day 4
Plasma IL-6 (pg/mL)
(B)
*
*
before exercise day1 3 h after exercise on Day 1
(A)
Plasma IL-6 (pg/mL)
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Interaction (group×time) : p = 0.554 (ES = 0.030) Main effect for group : p= 0.980 (ES < 0.001) Main effect for time : p= 0.001 (ES = 0.638)
* Significantly difference from resting on day1.
Interaction (group×time) : p= 0.571 (ES = 0.054) Main effect for group : p=0.148 (ES =0.166) Main effect for time : p= 0.007 (ES = 0.284)
* Significantly difference from day1.
Fe group
CON group Fe group
CON group
54
⾎清ヘプシジン濃度
Figure 13には、⾎清ヘプシジン濃度の変化を⽰した。1⽇⽬の運動前後の⾎清ヘプシジン
濃度の変化には、有意な交互作⽤、時間および群の主効果が⽰され、Fe 群においてのみ運 動前後で有意な増加がみられた。また、1⽇⽬から4 ⽇⽬までの安静時の変化においても、
有意な交互作⽤、時間および群に対する主効果が認められ、Fe群では 1⽇⽬と⽐較して 4
⽇⽬で有意な増加を⽰した。また、4⽇⽬の時点でFe群がCON群に⽐較して有意に⾼値を
⽰した。
Figure 13. Serum hepcidin levels before and after exercise on Day1(A), and resting levels on Days 1-4(B).
Value are means ± SE. *; Significant difference from resting on Day 1.P†P; Significant differentce between group.
Training period 0
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0
Day 1 Day 2 Day 3 Day 4
Serum Hepcidin(ng/mL)
* †
(B)
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0
a
*
* †
(A)Serum Hepcidin(ng/mL)
3 h after exercise on Day 1 Interaction (group×time) : p= 0.048 (ES = 0.311) Main effect for group : p= 0.032 (ES = 0.75) Main effect for time : p= 0.002 (ES = 0.603)
Interaction (group×time) : p= 0.013 (ES = 0.230) Main effect for group : p= 0.025 (ES = 0.90) Main effect for time : p= 0.001 (ES = 0.414) Fe group
CON group
Fe group CON group
55
（3） 疲労度と筋痛
Table 14には、疲労度および筋痛から1⽇⽬〜4⽇⽬までの変化を⽰した。疲労度および
筋痛の変化には、有意な交互作⽤および群の主効果は⽰されず、時間の有意な主効果が認め られた。
Table 14. Score of fatigue and muscle soreness during training period.
Group Day 1 Day 2 Day 3 Day 4
Fatigue (mm)
Fe 25 ± 7 30 ± 7 41 ± 10* 42 ± 6*
CON 26 ± 4 39 ± 9* 43 ± 7* 42 ± 7*
Muscle Soreness Fe 16 ± 5 36 ± 6* 57 ± 9* 55 ± 7*
(mm) CON 23 ± 4 43 ± 9* 59 ± 5* 53 ± 7*
Fatigue; Interaction (group×time): p = 0.889 (ES = 0.02), Main effect for condition: p = 0.690 (ES = 0.01), Main effect for time: p = 0.020 (ES = 0.61). Muscle soreness; interaction (group×time): p = 0.881(ES = 0.02), Main effect for group: p = 0.498 (ES = 0.04), Main effect for time: p < 0.001 (ES = 0.55)
*; Significant difference from resting on Day 1.
56
（4） トレーニング期間中の栄養摂取状
Table 15には、トレーニング期間中の平均⾷事摂取量を⽰した。トレーニング期間中のエ
ネルギー、炭⽔化物、たんぱく質および脂質の摂取量には、群間での有意差はみられなかっ た。3⽇間の平均炭⽔化物摂取量は、7.0 ± 0.2 g/kg（Fe群）および6.9 ± 0.3 g/kg（CON群）
であった。トレーニング期間中の鉄サプリメント摂取により、Fe群は、CON群と⽐較して、
鉄の摂取量が有意に⾼値を⽰した（p <0.001, ES = 2,400）。
Table 15. Total energy and macronutrients intakes during training period.
Group Day 1 Day 2 Day 3
Total energy Fe 10850 ± 130 11005 ± 110 10761 ± 136 (KJ) CON 10560 ± 65 10621 ± 74 10661 ± 71
CHO Fe 395.3 ± 7.8 402.5 ± 7.7 388.2 ± 6.8 (g) CON 378.4 ± 3.4 381.0 ± 3.7 383.7 ± 3.7
Protein Fe 87.0 ± 0.2 87.9 ± 0.8 88.9 ± 1.4 (g) CON 86.8 ± 0.2 88.0 ± 0.7 87.2 ± 0.2
Fat Fe 65.2 ± 0.04 65.9 ± 0.47 65.3 ± 0.04 (g) CON 65.2 ± 0.04 65.2 ± 0.04 65.3 ± 0.04
Iron Fe 30.5 ± 0.01P† 30.5 ± 0.01P† 30.5 ± 0.01P†
(mg) CON 6.5 ± 0.01 6.5 ± 0.01 6.5 ± 0.01
Value are means ± SE.
P
†
P; Significant difference between groups.