様々な酸素濃度における低酸素応答細胞株の評価

作製した低酸素応答細胞株は細胞ゲノムに低酸素応答型遺伝子発現システム が組み込まれているが、挿入位置・挿入遺伝子のコピー数によりEGFP蛍光度、

応答スピードなど細胞センサーにおける差が生じると考えられる。そこで、各酸 素濃度におけるそれぞれの細胞株の応答性を調べた。細胞を播種した後に酸素

濃度（O2 : 19、10、5、1%）を変えたインキュベーター内で48時間培養した。そ

の後、蛍光画像を撮影し（Fig. 33A）、EGFP陽性細胞率と相対EGFP蛍光強度を 算出した（Fig. 33B, C）。低酸素濃度（O2 : 1%）で培養したところ、すべての細 胞株においてほぼ100%のEGFP 陽性細胞率であった。しかし、EGFP蛍光強度 はそれぞれ異なり#24において最も高いEGFP蛍光強度を示した。すべての細胞 株において、酸素濃度が低くなるにつれ、高いEGFP陽性細胞率と相対EGFP蛍 光強度を示した。今後は相対EGFP蛍光強度が高かった#24についてさらなる解 析を行った。

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Fig. 33 Functional analysis of transgenic cell clones equipped with the hypoxia-responsive transgene expression system mediated by TA-ODD. (A) Fluorescent micrographs of cell clones after a 48-h incubation period under the indicated O2 concentration. +Dox, cells were cultured in medium containing 1 mg/mL of doxycycline. Scale bars: 400 µm. (B) Proportion of EGFP-positive cells. Cells were incubated for 48 h under 19% O2 (open columns), 10% O2 (dotted columns), 5% O2 (shaded columns), or 1% O2 (closed columns). Data are expressed as mean ± SD (n = 3). (C) Relative EGFP intensity. Cells were incubated for 48 h under 19% O2 (open columns), 10% O2 (dotted columns), 5%

O2 (shaded columns), or 1% O2 (closed columns). Data are expressed as mean ± SD (n = 3).

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3.2.3.5 #24細胞の三次元組織状態での低酸素応答性

本研究では組織工学的に作製した三次元組織の低酸素センサーとなることを 期待しているため、ここでは三次元培養における#24細胞株の酸素応答性を評価 した。そこで、今回作製した#24 細胞を用いて細胞シートを形成させることで、

三次元培養における低酸素応答性を調べた。実験スキームとしては、ガラスボト ムディッシュに#24細胞株を3.0×10⁵ cells播種し、磁石上に設置し、通常酸素濃 度下で培養した。培養3日後に共焦点顕微鏡で観察を行った。そして、撮影した 画像をディッシュ底面から 10 µm ごとに層として分割し、各層の相対蛍光強度 を測定した。Fig. 34A は細胞シートの外観を示しており、細胞シート様構造が形 成されていることがわかった。Fig. 34B は HE染色後の顕微鏡観察写真であり、

細胞シートは約40 µmの厚さであることがわかった。

Fig. 34 Functional analysis of transgenic cell clone in 3D cell culture. (A) A representative macroscopic image of a cell sheet. Scale bar: 10 mm. (B) Micrographs of cell sheets. Upper images, monocultured cell sheets; lower images, cocultured cell sheets; left images, bright-field micrographs of a hematoxylin and eosin-stained cross section of cell sheets; right images, fluorescent micrographs of cell sheets. Scale bars: 50 µm.

Fig. 35A, B は#24 のみで作製した細胞シートの共焦点顕微鏡観察による三次

元蛍光写真である。Fig. 35Aは酸素非透過性培養皿に作製した細胞シートを、Fig.

35Bは、酸素透過性培養皿に作製した細胞シートを示している。また、緑色は低 酸素に応答して発現したEGFP蛍光を、赤色はCellTracker Orange CMTMRによ る染色（#24全細胞）を示している。Fig. 35A, Bより、酸素供給量のより少ない 酸素非透過性培養皿条件において、より強いEGFP蛍光が観察された。また酸素

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非透過性培養皿において相対蛍光強度は、底面からの距離が短い層でより強い 強度が示された（Fig. 35E）。C2C12 細胞との共培養における実験においても同 様の結果が得られた（Fig. 35C-E）。これらの結果より、#24は三次元組織中にお ける低酸素環境の検出にも利用可能であり細胞センサーとしての有用性が示さ れた。

Fig. 35 (A, B) Fluorescent micrographs of monocultured cell sheets. Cell sheets cultured on a glass-bottomed dish (A); cell sheets cultured on a film-glass-bottomed plate (B). Scale bars: 50 µm. (C, D) Fluorescent micrographs of cocultured cell sheets. Cell sheets cultured on a glass-bottomed dish (C);

cell sheets cultured on a film-bottomed plate (D). Scale bars: 50 µm. Green, EGFP fluorescence expressed by clone no. 24 cells; red, clone no. 24 cells labeled with CellTracker Orange CMTMR dye (Thermo Fisher Scientific K.K.). (E) Relative EGFP intensity of each 10-mm region from the bottom of the cell sheets. Open columns, glass-bottomed dish; closed columns, film-bottomed plate. Data are expressed as mean ± SD (n = 3).

B A

D C

E

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