プラスミドベクターの作製

＜pCMV/EGFPの作製＞

pCMV/EGFPのコンストラクトとその作製手順をFig. 26に示す。まず、す

でに構築されたプラスミド p[polyA]を制限酵素 NheI 及び HindIII で切断し、目 的 DNA 断片を得た。同様にして、プラスミド p[EGFP]を制限酵素 XbaI および

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HindIIIで切断し、目的DNA断片を得た。取得した2つのDNA断片についてラ

イゲーション反応を行い、p[EGFP/polyA]を作製した。精製したプラスミド

p[EGFP/polyA]を制限酵素XhoIおよび KpnI で切断し、目的 DNA 断片を得た。

一方で、プラスミドp[PCMV]を制限酵素XhoIおよびKpnIで切断し、目的DNA 断片を得た。取得した 2 つの DNA 断片についてライゲーション反応を行い、

p[PCMV/EGFP/polyA]を作製した。作製したプラスミド p[PCMV/EGFP/polyA]を

制限酵素SacIIおよびNheIで切断し、目的DNA断片を得た。一方で、レンチウ

イルス生産用プラスミドであるFUGWを制限酵素XbaIおよびSalIとSacIIおよ びXhoIで切断し、2つのDNA断片を得た。以上取得した3つの遺伝子断片につ いてライゲーション反応を行い、pCMV/EGFPを作製した。作製したpCMV/EGFP は、カラム抽出により精製した。

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Fig. 26 Flowchart for the construction of pCMV/EGFP plasmid.

＜pRTP801/EGFPの作製＞

pRTP801/EGFPのコンストラクトとその作製手順をFig. 27に示す。まず、作

製したプラスミドpCMV/EGFPを制限酵素XbaIおよびSalIとXbaIおよびEcoRI で切断し、2つのDNA断片を得た。同様にして、プラスミドp[PRTP801]を制限

酵素XhoIおよびEcoRIで切断し、目的DNA断片を得た。取得した 3つの遺伝

子断片についてライゲーション反応を行い、pRTP801/EGFPを作製した。作製し

たpRTP801/EGFPは、カラム抽出により精製した。

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Fig. 27 Flowchart for the construction of pRTP801/EGFP plasmid.

＜pTRE/EGFPの作製＞

pTRE/EGFPのコンストラクトとその作製手順をFig. 28に示す。まず、作製し

たプラスミドpCMV/EGFPを制限酵素SalIおよびXbaIとXbaIおよび EcoRI で 切断し、2つのDNA断片を得た。同様にして、プラスミドp[PTRE]を制限酵素

SalIおよびEcoRIで切断し、目的DNA断片を得た。取得した3つの遺伝子断片

に つ いて ライ ゲー ショ ン 反応 を行 い、pTRE/EGFP を 作 製し た。 作 製し た

pTRE/EGFPは、カラム抽出により精製した。

Fig. 28 Flowchart for the construction of pTRE/EGFP plasmid.

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＜pRTP801/TAの作製＞

pRTP801/TAのコンストラクトとその作製手順を Fig. 29 に示す。まず、すで

に構築されたプラスミド p[vp16]を制限酵素 XhoI 及び BamHI で切断し、目的 DNA断片を得た。同様にして、プラスミドp[tetR]を制限酵素XhoIおよびBamHI で切断し、目的DNA断片を得た。取得した2つの遺伝子断片についてライゲー ション反応を行い、p[tetR/vp16]を作製した。精製したプラスミド p[tetR/vp16]を

制限酵素SalIおよびHindIIIで切断し、目的 DNA断片を得た。一方で、プラス

ミドp[polyA]を制限酵素 XhoIおよび HindIII で切断し、目的DNA 断片を得た。

取 得 し た 2 つ の 遺 伝 子 断 片 に つ い て ラ イ ゲ ー シ ョ ン 反 応 を 行 い 、 p[tetR/vp16/polyA]を作製した。作製したプラスミド p[tetR/vp16/polyA]を制限酵 素XhoIおよびSpeIで切断し、目的DNA断片を得た。一方で、すでに作製した プラスミドpCMV/EGFPを制限酵素XbaIおよびEcoRIで切断し、目的DNA断 片を得た。同様にして、プラスミドp[PRTP801]を制限酵素XhoIおよびEcoRIで 切断し、目的DNA断片を得た。取得した3つの遺伝子断片についてライゲーシ ョン反応を行ない、pRTP801/TAを作製した。作製したpRTP801/TAは、カラム 抽出により精製した。

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Fig. 29 Flowchart for the construction of pRTP801/TA plasmid.

p[teR/vp16/polyA]

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＜pRTP801/TA-ODDの作製＞

pRTP801/TA-ODDのコンストラクトとその作製手順をFig. 30に示す。まず、す

でに構築されたプラスミドp[vp16]を制限酵素MluI及びBamHIで切断し、目的 DNA断片を得た。同様にして、プラスミドp[ODD]を制限酵素MluIおよびBamHI で切断し、目的DNA断片を得た。取得した2つの遺伝子断片についてライゲー ション反応を行い、p[ODD/vp16]を作製した。精製したプラスミドp[ODD/vp16]

を制限酵素BamHIおよびHindIIIで切断し、目的DNA断片を得た。一方で、プ

ラスミドp[polyA]を制限酵素XhoIおよびHindIIIで切断し、目的DNA断片を得

た。また、プラスミドp[tetR]を制限酵素XhoIおよびBamHIで切断し、目的DNA 断片を得た。取得した 3 つの遺伝子断片についてライゲーション反応を行い、

p[tetR/ODD/vp16/polyA]を作製した。作製したプラスミドp[tetR/ODD/vp16/polyA]

を制限酵素XhoIおよびSpeIで切断し、目的DNA断片を得た。一方で、すでに 作製したプラスミドpCMV/EGFPを制限酵素XbaIおよびEcoRIで切断し、目的 DNA断片を得た。同様にして、プラスミド p[PRTP801]を制限酵素 XhoI および

EcoRIで切断し、目的DNA断片を得た。取得した3つの遺伝子断片についてラ

イ ゲ ー シ ョ ン 反 応 を 行 な い 、pRTP801/TA-ODD を 作 製 し た 。 作 製 し た

pRTP801/TA-ODDは、カラム抽出により精製した。

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Fig. 30 Flowchart for the construction of pRTP801/TA-ODD plasmid.

p[ODD/vp16]

p[tetR/ODD/vp16/polyA]

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