ミルクコーヒー液中の AA 付加物の探索のためのデータ解析

Compound discoverer (CD) 3.0ソフトウェア (Thermo Fisher Scientific) をデータ 解析に使用した．このソフトは，ピークアラインメント，ピーク検出，バックグラウ ンド減算処理，データのグループピング，およびギャップフィリング機能を備えてい る (Takahashi, M., 2018)．データ解析に用いるCDソフトのパラメータは表3-3に示 した．

3.2.9.に記載されている表3-1のmethod 3を用いて得られたAA無添加，AA添加，

13C3-AA 添加ミルクコーヒーの分析結果から，AA 無添加サンプルをブランクに設定 し，CDソフトによるAA添加と¹³C3-AA添加の差異解析を行った．PPF法は，非標 識AA添加サンプルと¹³C3-AA添加サンプルからAAと¹³C3-AAの付加体を見つけ出 すために用いた．PPF法は，溶媒，マトリックス，またはノイズに由来する偽陽性ピ ークを検出することなく，AA付加体の非標識体と¹³C3標識体のペアを高精度に検出 できる (Takahashi, M., 2018)．非標識AAと¹³C3標識AAに由来するAA付加体のペ アは，次のクライテリアを用いて特定した：1) 同位体元素との m/z の差とその標識 数に依存したm/zの差が3.0102 (Δm/z = 1.0034 × 3)，2) 質量誤差が5 ppm，および 3) 保持時間の差が0.1分未満．

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表3-3. 未知AA付加体とアクリル酸付加アミノ酸を検出するためのCD解析条件

CD conditions Align retention times

Alignment model Adaptive curve

Max. shift 0.2 min

Mass tolerance 10 ppm

Detect compounds

Mass tolerance 10 ppm

Intensity tolerance 30%

S/N threshold 1

Min. peak intensity 100000

ions [M + H]⁺, [M − H]⁻

Min. element counts C H O

Max. element counts C40 H100 N10 O15 P3 S15

Filter peaks True

Max. peak width 0.5 min

Remove singlets True

Min. # scans per peak 3

Min. # isotopes 1

Group compounds

Mass tolerance 5 ppm

RT tolerance 0.1 min

Fill gaps

Mass tolerance 5 ppm

S/N threshold 10

3.2.11. ミルクコーヒータンパク質の加水分解によって生じる AA 付加アミノ酸の

探索

4か月間保存したAA無添加，AA添加，¹³C3-AA添加のミルクコーヒーサンプル各 15 mLに，4 °Cに冷却した5% (w/v) トリクロロ酢酸水溶液15 mLとメタノール10 mLを加え，5分間振とうした．その混合物を遠心分離し (4 °C，2380 g，5分)，上清 を除去した．得られた沈殿を4 °Cのメタノール10 mLで2回洗浄し，続いて4 °Cの メタノール：水 (1:1 v/v) 10 mLで1回洗浄した．沈殿を1.5 mLの7 M塩酸グアニジ ンと10 mM EDTAを含有する500 mM Tris-HCl (pH 8.5) 溶液に溶解し，3.5 Kの透析

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チューブに移し，一晩透析を行った．透析液を5 μmのメンブレンフィルターでろ過 し，凍結乾燥後，約100 mgのミルクコーヒータンパク質を得た．

タンパク質の酸加水分解を行うことで，遊離型のアミノ酸サンプルを調製した．具 体的には，酸加水分解によるタンパク質のアミド結合の分解と同時に，AA のアミド 結合も分解されるためアクリル酸付加アミノ酸が生成される．まず過ギ酸酸化を行う ために，各抽出タンパク質 (2.5 mg) を4 mLの過ギ酸に溶解した．4 °Cで16時間酸

化後，45 °Cに設定した遠心エバポレーターを用いて過ギ酸を除去した．次に，その

乾固物を 6 M塩酸 4 mLに溶解し，加水分解管 (Wilmad-LabGlass, NJ, USA) に移

し，6 M塩酸 2 mLで2回洗いこみを行った．過ギ酸酸化を行わず直接酸加水分解を

行う場合は，タンパク質2.5 mgを直接加水分解管に採取し，6 M塩酸 8 mLを加え た．その後，両サンプルともに加水分解管の脱気を行い，110 °Cのブロックヒーター で24時間加水分解を行った．加水分解液を15 mL PPチューブに移し，MeOH 950 μLで3回洗浄した．45 °Cに設定した遠心エバポレーターで溶媒除去後，0.5% (v/v)

ギ酸含有70% (v/v) アセトニトリル水溶液1 mLに乾固物を再溶解し，0.2 μmのメン

ブレンフィルターでろ過し，HILIC/HRMS分析 (method 4) に供した．得られたデー タを用いて，AA無添加サンプルをブランクに設定し，AA添加と¹³C3-AA添加のCD による差異解析を行いアクリル酸付加アミノ酸の探索を行った．Method 4 は，

Poroshell 120 HILIC-Z PEEK-lined (100 mm × 2.1 mm i.d. , particle size 2.7 μm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) カラムを用いた．移動相 (A) は0.1% (v/v) ギ 酸含有60 mMギ酸アンモニウム水溶液，移動相 (B) は0.1% (v/v) ギ酸アセトニトリ ル溶液を用いた．HILIC分析のグラジエント条件は，0 min (90% B)，10 min (60% B)， 10.1–13 min (20% B)，13.1–17 min (90% B) に設定した．他のHILICとHRMSの分 析条件は表3-1のmethod 4に示す．アクリル酸付加アミノ酸分析のHRMS/MS分析 のプロダクトイオンスキャン条件は表3-2のmethod 4に示す．

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