抗鮭 瘍 剤 細胞同調 究

4 3 4 金沢 大 学十 全 医 学 会 雑誌 第9 2巻 第3号 4 3 4‑ 45 1 (_{1 98 3})

抗 鮭瘍剤 ^によ る細 胞 同 調^の 研究

金 沢 大 学 医学 部 内 科 学 第三講 座(主

,^{任: 服 部 絢一 教 授)}

大 竹 茂 樹

(昭和^{5 8}年³月^{2 6}日受 付)

抗腫 瘍 剤^によ る細 胞 同 調 (syn chr o niz atio n) を行^い, そ の成立機序を明ら^かに す る た め^に E hrlich 腹 水 癌 細 胞 移 植^マウス を用^いて, トP ^‑D^‑a r ab i^{n o}fu r a n o sylcy t^{o s}in e (Ar a^‑C), N⁴‑^{behe n o}yl‑^1qβ^‑D^‑

a r abin ofu r a n o sylcy to sin e(B H ^‑A C), m ethotr e x ate(M T X), Vin c ristin e(V C R), およ び da u n o r ub icin

(D N R) ^{に つ い}て検 討し た. syn chr o niz atio n 時の細 胞 回転の動 態 (c ell cycle p^{r o}g^{r e s s}io n) を³H‑^thymi‑

din e標識 率 (L I),

′ゝ

裂 指 数 (M I) およ び a uto r ad iog^{r a}ph_y とcy t^ophoto metry を併 用し て得た D N A ヒ ストグラ^ム を用^いて解 析し た. D N A 合 成 期 (S 期) 流入量 (S ^‑inf) お よ び S 期 流 出量 (S^‑eff) は半 定量 的^に求め た^. Ar a^‑C(0.5 m g/kg), B H ^‑A C(0^.1 m g/kg) お よ び M T X (0^･2 5 ^m g/k_g) は ^一 過 性の L I の 上 昇^によ り S 期^に, V C R (0^.0 0 2 5^〜0^.25 m g/kg) は M I の 上昇^によ り細 胞 分 裂期 (M 期) ^に, D N R (1･O

m g/kg) は分裂 前体 止 期 (G2期) ^にSy^{n C}hr o niz e す ること が 示 さ れ た^{. こ}の時の投与 量では殺 細 胞 効 果は 見ら れ な か^った. Ar a^‑C, B H ^‑A C お よ び M T X は投与 後0 ^〜8 時 間の間S^‑eff を強く抑制し た が,S^‑inf は 0 ^〜 4 時 間の間抑 制さ れ, 4 ^〜 8 時 間後^には対 照 値を越え て 回復し た. V C R は m etapha s e a r r e st を 示 し,

S ^‑eff には影響を与え な か^った. 分 裂 終 期像が な く S^‑inf は求め ら れ な かった が, D N A ^{ヒ ス}ト グ ラム の変 化か ら, S 期の流入量^には変化が な^いようであった. D N R は S ^‑inf, S ^‑eff を と も^に変 化さ せず, M I の減 少があり, D N A ^{ヒ ス}トグラムで は G2期の増 加が み ら れ た. 以上^によ りsy^{n c}hr o niz atio n はある細 胞 周 期

への流入量と流 出 量の不 均 衡^によ り引き起^こさ れ ること が 示 さ れ た. し た がって,Syn Chr o niz atio n の成 立

す る要 因は, 薬 剤^によ る c ell cycle pr ogr e s sio n の変 化のみ な らず, 腫 瘍細 胞 自 身の細 胞 動 態^にも左右さ

れ ること が 示唆さ れ た^.

E _町 ^{W O r}d^s C dl sym ^Chr o niz atio n, Cell cy^cle p^{r o}g^{r e s s}io n, C_{y t}ok in etic a n al_ysis, A nti_{n e op}la stic ag^{e n}ts.

急性 白 血 病を は じ め 悪性 腫 瘍の化 学療 法^に関す る研 究は, S k ip pe r ら^l)の^マウ^ス白 血 病L 1 2 1 0細 胞を 用^い た実琴^{的 研 究 結果よ り導入 さ れ た ̀ ̀totalc e11 kill'' の} 治 療理念を基 礎と し て進め ら れ て お り, 着 実な成 果を あ げ^{つ つ}ある｡

一 方, ヒト悪性 腫 瘍 細 胞で は, L 1 210細 胞と異な り, 成 長分 画 (gr o wth fr a ctio n) の小さ^{い こ} と や, 世 代 時 間は正常 骨 髄細 胞の そ れ よ り長く, 特に 休 止 期にある G｡細 胞が多^{い こ}と が明ら か に なっ て^い る²⁾. ま た, 現 在 広く使 用さ れ て^いる抗 腫 瘍 剤の作用様 式は悪 性 腫瘍 細 胞に特 異 的^に作 用す る^ので は な く, 正 常 細胞を も同 等^に障 害す る. し か も, そ の致 死効 果が 細 胞回転 (c ell cyclek in etic s) に依 存し て大きく 変動 し, 増殖 期と安定 期の細 胞で は薬 剤 感受 性が大きく 異 な る^こと (^cy^cle dep^{e n}de n cy) ^3ト5)や, そ れ ぞ れ の薬

割^において細 胞 周期上 の あ る特 定の相にの み致 死的 効 果の あ る^こと(aga r e spo n s e) ^6)〜9)が知ら れ て^いる. こ れ ら の事 実は^マ ウス で の実 験 結果を臨 床^に応用 す る^に あたって多く の障 害を も た ら し て^いる. ま た, 抗腫瘍 剤 投 与^によ^っ て細胞回転の進 行 (c ell cy^cle pr ogr e s^‑ sio n) が影響を受け ること も知ら れ て^いる^{1 0)1 1)}

悪 性 腫瘍^の治療にお^いて治 療 前の増 殖 分 画^の多寡と 治 療 効 果の相 関は, ^一 部の報 告^{1 2ト1 4)}を除^いて お お むね 増 殖 分画^の多^いもの^{1 5ト1 8)}や治 療 経 過 中^に増 殖 分 画^の 増 加す る も の が^{1 9ト2 1)}, 治 療^に良 く 反 応す る^こと が報告 さ れ て^いる^{. こ の こ}とから薬 剤を 用^{い て}腫 瘍 細胞を細 胞 周 期のある相^に同調さ せ( 細胞 同調, 以 下sy^{n c}hr o^･ niz atio n), その相^に強^い致死効 果を 示 す抗腫 瘍 剤を投 与す る^ことによ り治療 効 果を よ り^いっ そ う高め よ う と C_{y t}okin etic A n al_ysis of Cell S_yn chr o niz atio n b _y A ntin e opla stic A_ge nts in T au o▲ S hi^‑ g^ek i O h tak^e, Dep^{a r}tm e nt of Inte r n al M ed icin e (^m)^, (^{D ir e cto r : Pr of･ K ･ H atto ri}), Scho ol

of M ed icin e, K a n a z a w a U niv e r si_{t y}.

抗腫 瘍 割^によ る細胞 同調の研 究

す る試み が急 性 白血 病を中 心^に他の 悪性腫 瘍で も報 告 さ れ て^いる^{1 5)1 9)2 D)2 2ト2 7)}

著 者ら も サ イ ト^{シ ン}ア ラ ピノ シド(1^‑β‑^{D‑a r abin o‑}

fu r a n o sylcy t^{o s}in e, 以下Ar a‑C と略)や その誘 導体で あ る ど^へノイ ^{ー ル}サ イ トシ ンア ラ ピノ シド(N^4‑be^‑

he n oyl^‑1‑β^‑D‑a r ab in ofu r an O Sylcy to sin e, 以 下B H^‑ A C と略) を用^{い て}, 急性 非リ^{ン パ}性 白 血病^{に お い}て,

D N A 合成(S) 期部 分 同 調(S pha s e pa rtialsyn chr o ni^‑

z atio n)を行^い, 寛 解 導入効 果を検 討し て き た^{2 8)2 9)}. こ の中^で, Sy^{n C}hr o niz atio n は個^{々 の}症 例^によ り異な り^, 必 ずし も時期 的^にも量 的^にも画^一 的には起ら ない こと やsyn ch^{r o n}iz atio n後の化学 療 法の効 果が ^一定^でな^い な どの点が明ら か に なって き た. これ は in viv o にお いて抗腰 瘍 剤^によ^って引き起^こさ れ るc e11 cycle pr o^･

g^{r e s s}io n の変 化が明ら か で なく, し た が^っ てsyn chr o^･

niz atio n の成 立す る時 点の細 胞回転の詳 細な動 態が

不明 確で あ り, ま た, Syn Chr o niz atio n が悪 性腫 瘍 細 胞 と正常骨 髄細 胞で同 等^に起^こる た め^に, 化 学療 法 係 数 を改 善し得な^いた め と考え ら れ た.

本 実験^では,E hrlich 腹 水癌 細 胞を 用^いて, 各種 抗 腫 瘍 剤に よ るsy^{n c}hr o niz atio n の過 程を経 時 的^に観 察 し, C ellcycle pr ogr e s sio n の変化^{に つ い}て³H ^‑thymi^‑ d in e標 織 法と D N A ^{ヒ ス} トグラ^ム を組み合わ せ るこ

とによ り解 析を試み たので報 告す る.

材 料お よ び方法 1 ^. 動 物

全実験を通じ て体 重 約3 0g(6 ^〜7 適 齢) ^{の d d Y} 系 雄 白 色^マ ウス(^三協ラ ボ) を使用 し た^. 5 匹 を 1群と し

て実験し た^. 2 ^. 腫瘍

金沢 大学 医 学部 薬理学 教室よ り分 与を う け当 教室^に て毎週 継代 移 植さ れ ている E hrlich 腹 水癌 細 胞を 用^い た. 本 腰瘍は 4倍 体 細 胞で リ^{ン パ}球, 中皮 細 胞な ど の 正常細 胞と は, その大き さ お よ び形 態か ら容 易^に分別 可能^であっ た^. 腹 腔 内移 植後 第7 日目^に癌 性 腹 水を採 取し, 0^.3% チ ト ラ ^ー ト加 生理食塩水にて生 細 胞 数^を 2^.5^×1 0⁷/ml に調 整し, 5 ×1 0⁶個 (0.2 ml) づつを腹 腔内移 植し た^.本 腫 瘍は K lein ら の報 告^{3 0)の}ご と く,総 細胞数の立方 根^に比例し て増加し,第10 日目にプ ラ ト

ーと なった.各 実験は腹 腔 内移 植 後 第4 日目^に行^っ た^. この時^の平均 世 代 時 間は約28 時 間と推 定さ れ た.

3 ^. 抗 腫瘍 剤

S_yn chr o niz atio n 作用 がある と報 告さ れ て^いる Ar a

‑^C, B H‑^{A C, メ ソ トレ}キ^{セ ー} ト( ^{m et}hotr e x ate, 以 下M T X と略), ビンク リスチ^ン (vin c ristin e, 以 下 V C R と略) お よ び, ダウ ノ^)t/ビシ ン(da u n o r ubicin,

4 3 5

以下D N R と略) を 用いて実験し た. 各 薬 剤は所 定^の様 式^に従って溶 解 後, 生理食塩 水^にて希 釈し, 各 濃 度と も 0 ^.1ml/1 0 _gbod_y wt.の投与 量と な る よ う^に腹 陛内投 与した. 対 照群には生理食塩 水を 0^.1 ml/1 0_g body wt.腹腔 内投 与し た^.

4 ^. in vitr o ³H ^‑th_ymi d in e 標識 法

各 薬 剤 投与 直 前お よ び投 与 後 ^一 定 時 間^{ご とに}腹 腔 穿 刺を行^い, 腹 水を 0 ^.0 2 ml づつ採 取し,

3H ^‑thymi^･ din e(³H ^‑T d R) 標 識 率 (labelinginde x, 以 下L I と 略), およ び分 裂 指 数 (mitoticinde x, 以下^{M I と}略) の測 定^を行った. L I は R P M I 1 64 0 培養 液1ml に採取 細 胞を浮 遊さ せ³H ^‑T d R (^sp^{e c}ific a ctivi_{t y} 5 C i/

m m ol, 日本ア イ ソ ト^ー プ協 会) を 1 0J^LCi注入 し, 3 0 分 間^{3 70C で}貯置し た後, 3 回洗 浄し塗 抹 模本を作 製し

a uto r adiogr aphy を行^っ た. M I は腹 水 採取 後す ぐ^に 塗抹 標 本を作 製し, ギ^ムザ染 色を行った. L I, M I と も に1,0 0 0個 以上 の細胞を観 察し そ の百分 率であら わ し た^.

5 ^. in viv o 標識 法

マウス腹 腔 内^{に3H ‑T d R を 1}F^LC i/g bod_y wt.注 入 しin viv o 標 識を行^い, 3 0分後に各 薬剤を投 与し た.

薬剤 投 与 直 前, 投 与 後4 時間お よ び 8 時 間後^に腹 腔 穿 刺に よ り腹 水を採 取し, 生理食 塩 水^にて 3 回 洗浄し塗 抹標 本を作 製し た^{. 一} 部の細胞はtry pa n blu e 色 素 排 泄能よ り生 細胞 率を算 定し た.

6 ^･ a utO r ad iogr aphy

塗抹 標 本を メ タ ^{ノ ー ル で}3 0分 間 固 定 後, ba ck

gr o u nd減 少^のた め冷 遇 塩 素 酸 液^に浸 透 後, 流 水で よ

く洗 浄し た. これ を良く乾 燥さ せ,d ip ping 法にて 4 倍 稀 釈し た N T B 2 乳 剤 (Ea stm a n Kodak) を塗布し,

in vitr o labeling法で は 1 週 間, in viv olabeling 法 で は 1 ケ月 間 暗箱の中で露出し た. D19現 像 液(^1:1)

にて 1 5⁰C 3 分 間現 像し, 冷蒸 留 水^にて停止, フジフ ィ ック^ス ( 富士フ イ ル ム) で6分 間定 着を行^い, 乾 燥 後 ギ^ムザ染 色を施し観 察し た. 銀 粒子 5個 以上 を標 識 細 胞と し た.

7 ^. D N A ヒ スト グ ラム

in viv olabeling を行った標 本は, 写真 撮 影を行^い,

標 識お よ び非 標 識細 胞を区別し て, そ の位 置を記 録し た (photogr aph m ap ping, F ig^.1). こ の標 本を 5 % 三塩 化酢 酸 (C C 13C O O Ⅲ) ^に浸し た の ち, メタ^{ノ ー ル} に1 0 分 間 浸 透し, ギムザ染色を脱色し た^{3 1)}. 10分 間蒸 留 水 中^に浸し た後7^.5% ^{フ ェ}リ^シア^ン化カ リ ウム (K3

Fe(C N)8) ^に3 分 間浸し, 次^に2 0% チ オ硫酸ナ ト リ ウ ム(Na2S20｡) に3 ^〜 5 分 間浸^{し た の ち}, 3回 水 洗し

a uto r adiogr aphy の銀 粒子 を除 去し た^{3 2).} この標 本^に Fe ulge n 染色を施し た. Fe ul_ge n 染 色は, 標 本を 6 0⁰C

4 3 6 大 竹 ^ノ

(^a) (b)

F ig^.1^. (^a) A _pa rt of photog^{r a}phic m ap fo r cy t^ophot_{o me}try ^sho w in_g 3 1^abeled a nd 4

unlabeled c ells.(b) T he s a m e vis u al fiel d afte r r e m o v al of G ie m s a stain a nd a uto r adio^‑ gr aphic silv e r gr ain s a nd stain ed by Fe ulge n r e a ctio n.

S ^min S m ax S min S m a x

F ig^.2^. Sche m atic r epr e s e ntatio n of puls e labeling a nd s ubs equ e nt m o v e m e nt of labeled a nd u nlabeled c ells du ring a w aiting tim e(Ta)^.(^a) D istributio n s of D N A

C O nte ntS Of labeled(shaded) a nd u nlabeled(u n shaded) c ells atT｡.(b)Co r r e spo nd ing distributio n s of D N A c o nte nts afte r a w aiting tim e (Ta)^. Bo rde rlin e Qf D N A

C O nte ntbetw e e n Gl a nd S pha s e(S‑^min) a ndthatbetw e e n S a nd G2pha s e(Sp^{m a x})

W e r e C O n V e nie ntlydefin ed.S‑^{min isthe v alu e of m e a n} plu s sta nda rd de viatio n of the D N A c o nte nt of e a ch da ugh ^te r n u clei of a n a^‑O r telopha sic c ells.Sr^{m a x is the}

valu e of m e a n min u s sta ndr ad de viatio n of the D N A c o nte nt of mitotic c ells^. S Pha s ein8u x(^S‑inf) ^{w a s c o m} p^uted a sthe a v e r ag^ein c r e m e nt pe rho u rin u nlabeled S pha sic c ellsdu ring ^{a w a}iting tim e,a nd S _pha s e efnu x(S‑^eff)^{w a s c o m} puted a sthe

a v e r agein c r e m e nt p^{e r}ho u rinlabeled G2, M a nd Gl pha sic c ells.