早稲田大学大学院理工学研究科

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博士論文審査報告書

論   文   題   目

Properties of Nano-Organizations Constructed by Molecular Assembly and the Control of

their Functions

分子集合により構築したナノ組織体の特徴と その機能制御

申  請  者 寺 村 裕 治

Yuji    TERAMURA

    応用化学専攻 ݗ分子化学研究

      2004 年  2 月 氏  名

専攻・研究指導 (Ӏ程内のみ)

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  両 親 媒 性 分 子 や 機 能 性 蛋 白ࡐを 分 子 集 合 さ せ て 構 築 し た ナ ノ 組 織 体 は 、ݗ 性 能 分 子 デ バ イ ス と し てؼ年 注 目 を 集 め て い る 。 例 え ば 、ঢ় ڥ球 （ 直 径 8μ m） よ り も 小 さ い リ ン 脂ࡐ小 胞 体 （2 5 0 n m） にݗ濃 度 ヘ モ グ ロ ビ ン （H b） を 内 包 さ せ た H b 小 胞 体 は 、 酸 素 運 搬 能 を 代 替 す る だ け で な く 、ڥ管 内 の 梗 塞

൉位 や 腫 瘍 組 織 な ど のײ ڥ ൉位 へ の 酸 素 供 給 が 可 能 と な る 。 ま た 、ڥ管 損 傷

൉位 やڥ小 板 表 面 を 認ࡀす る൉位 を 担 持 し た ナ ノ 粒 子 で は 、 出ڥ ൉位 に 集 積 し 、 止ڥに 必 要 なڥ ๎形 成 の 誘 導 が 期 待 で き る た め 、ڥ小 板 代 替 物 が 構 築 で き る 。 本 論 文 は 、 こ れ ら の 実 現 に 向 け て 、ݗ度 に 機 能 化 さ れ た ナ ノ 組 織 体 の 構 築 に つ い て 普 遍 的 な 基 礎 知 見 と 、 生 体 内 で 有 効 に 機 能 し 得 る ナ ノ 組 織 体 に つ い て ま と め た も の で あ る 。 具 体 的 に は 、H b 小 胞 体 の レ ド ッ ク ス 過 程 を 詳 し く 調 べ 、 生 体 内 に お け る 酸 素 運 搬 能 の 制 御 法 を 提 案 し て い る 。 ま た 、 認ࡀ 分 子 を 結 合 し た 担 体 の 構 築 と 機 能 に つ い て 、 分 子 認ࡀ過 程 やڥ小 板 を 巻 込 ん だ 集 積 挙 動 の 詳 細ӕ析 を 行 な い 、担 体 の 物 性 と 発 現 機 能 の 相 関 を 明 ら か に し 、 止ڥ能 を 有 す るڥ小 板 代 替 物 の০ ڐ指 針 に 繋 げ る 知 見 が 述 べ ら れ て い る 。   本 論 文 は 、8 章 よ り 構 成 さ れ て い る 。 以 下 に 各 章 の 要 点 と 評 価 を 述 べ る 。 第 1 章 は 、 構 造 の 異 な る 両 親 媒 性 分 子 の 自 己 集 合 現 象 に 関 し て 、 分 子 間 相 互 作 用 の 微 妙 な 相 違 が 形 成 さ れ る 集 合 体 の 構 造 や 物 理 化 学 性ࡐに 及 ぼ す 影؜ に つ い て 申 請 者 独 自 の 切 り 口 で 整 理 さ れ て お り 、 薬 物 送 達 系 や ナ ノ ・ バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー 用 材 料 と し て の 要 件 やӀ題 に つ い て 概 説 さ れ て い る 。 具 体 例 と し て 、 従 来 よ り 所 属 研 究 室 に て 展 開 さ れ て き た H b 小 胞 体 の 分 子 集 合 構 造 と 酸 素 運 搬 能 をӕ説 し 、 人 工ঢ় ڥ球 （ঢ় ڥ球 代 替 物 ） の 内 外 研 究 動 向 を 評 価 も 交 え な が ら 詳 細 に ま と め ら れ て い る 。

  第 2 章 で は 、 活 性 酸 素 種 が H b 小 胞 体 に 及 ぼ す 影؜を レ ド ッ ク ス 過 程 か ら 明 ら か に し た 成 果 が 記 述 さ れ て い る 。 生 体 内 に お い て 、 特 に 炎 症 時 に 多 く 発 生 し て い る 過 酸 化 水 素 （H₂O₂） な ど の 活 性 酸 素 種 が 、H b や 小 胞 体 中 の H b と 反 応 す る 過 程 に つ い て 詳 細 な 比Ԕ ӕ析 を 行 な っ て い る 。H₂O₂ と の 反 応 で 生 じ る フ ェ リ ル H b は 不 飽 和 脂ࡐを 過 酸 化 し 、 更 に 変 性 H b か ら 遊 離 し た 鉄 イ オ ン は F e n t o n 反 応 に よ り ヒ ド ロ キ シ ラ ジ カ ル を 生 じ 、 過 酸 化 を 触 媒 す る 。 他 方 、 小 胞 体 中 の H b は 、 二 分 子 膜 を 透 過 し た H₂O₂ と 反 応 し て フ ェ リ ル H b や 鉄 イ オ ン の 遊 離 を 引 き֬こ す も の の 、 化 学 的 に 安 定 な 飽 和 型 脂ࡐの 二 分 子 膜 に て 隔 離 さ れ て い る た め 、 不 飽 和 脂ࡐの 過 酸 化 が 抑 制 さ れ る こ と を 実 証 し て お り 、 生 理 活 性 のݗい H b を 小 胞 体 に 内 包 す るঢ় ڥ球 様 構 造 の 生 理 的 意 義 を 見 事 に 証 明 し て い る 点 はݗく 評 価 で き る 。

  第 3 章 で は 、H b 小 胞 体 の 酸 素 運 搬 機 能 の 持 続 方 法 に つ い て 、 種 々 のࠟみ

と 、i n v i t r o 系 と i n v i v o 系 の 実 験 結 果 が 述 べ ら れ て い る 。H b は 鉄 が 二 価 状

態 で 酸 素 と 可 逆 的 結 合 す る が 、 自 動 酸 化 や 活 性 酸 素 種 に よ り 鉄 が 三 価 に 酸 化

（ メ ト 化 ） さ れ る と 酸 素 運 搬 能 が 失 わ れ る た め 、ঢ় ڥ球 で は メ ト 化 抑 制 系 や 還 元 系 が 備 わ っ て い る 。第 2 章 の 知 見 か ら 、申 請 者 は 膜 透 過 性 を 有 す る H₂O₂ が H b 小 胞 体 に 対 す る 主 な メ ト 化 促 進 因 子 と 仮 定 し た 。 実 際 に カ タ ラ ー ゼ を

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内 包 し た H b 小 胞 体 で は 、 未 内 包 群 よ り も メ ト 化 速 度 が 低 下 し 、 動 物 実 験 か ら 酸 素 運 搬 寿 命 が 3 倍 ま で 延ସす る こ と を 実 証 し た 。 ま た 、ڥ中 の H₂O₂ を 還 元 消 去 す る た め に 、 ア ス コ ル ビ ン 酸 をৌ脈 投 与 す る だ け で 酸 素 運 搬 寿 命 が 2 倍 ま で 延ସで き る こ と を i n v i v o 系 に て 実 証 し た 点 は 、H b 小 胞 体 の 投 与 プ ロ ト コ ー ル০定 に お い て 意 義 深 い 成 果 で あ る 。 更 に 申 請 者 は 、 膜 透 過 性 のݗ い シ ス テ イ ン を 併 用 す る こ と で 、 小 胞 体 内 の メ ト H b の 還 元 ま で 行 な う ア イ デ ア を 、 生 体 系 に 応 用 で き る 新 し い メ ト H b 還 元 系 と し て 提 案 し て い る 。   第 4 章 で は 、 生 体 投 与 可 能 な 担 体 と し て 、Ћ伝 子 組 換 え ヒ トڥ清 ア ル ブ ミ ン の 新֩な 多 量 体 合 成 法 と 認ࡀ蛋 白ࡐの 簡 便 な 結 合 法 が 述 べ ら れ て い る 。 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 を 形 成 し て い な い ア ミ ノ 酸 配 列 3 4 番 目 の シ ス テ イ ン

（^{3 4}C y s） を 1 , 6 -ビ ス マ レ イ ミ ド ヘ キ サ ン で 架 橋 し て 二 量 化 し 、 反 応 条 件 の 厳 密 制 御 に よ りݗ収 率 合 成 に 成 功 し て い る 。 ま た 、p H と 温 度 制 御 の み で 、 ア ル ブ ミ ンݗ次 構 造 を 変 化 さ せ ^{3 4}C y s を༳出 さ せ て 、 チ オ ー ル ・ ジ ス ル フ ィ ド 交 換 反 応 に よ り 分 子 内 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 を 分 子 間 に 変 換 さ せ る 重 合 反 応 を 利 用 し て 、 粒 径 5 0 n m か ら 5mm 程 度 ま で 制 御 す る ナ ノ 粒 子 の 大 量 合 成 に 成 功 し た 。 更 に 、 架 橋 剤 N -ス ク シ ン イ ミ ジ ル 3 - ( 2 -ピ リ ジ ル ジ チ オ プ ロ ピ オ ネ ー ト)を 用 い た 最 小 限 の 化 学 修 飾 に よ り 、 機 能 を 保 持 さ せ た ま ま 認ࡀ蛋 白ࡐ を ア ル ブ ミ ン 重 合 体 に 結 合 す る 手 法 を 用 い て 、 認ࡀ蛋 白ࡐを 定 量 的 に ア ル ブ ミ ン 重 合 体 へ 結 合 す る こ と に 成 功 し た 点 は 新 し い 薬 物 送 達 系 用 担 体 と し て の 道 を 開 く 成 果 で あ り 、 波 及 効 果 が 極 め てݗい も の と し て 評 価 で き る 。

  第 5 章 は 、 第 4 章 で 確 立 し た 手 法 に よ りڥ小 板 膜 蛋 白ࡐのЋ伝 子 組 換 体

（r G P I ba、r G P I a / I I a） やڥ液 凝 固 蛋 白ࡐで あ る フ ィ ブ リ ノ − ゲ ン を ア ル ブ ミ ン 重 合 体 に 結 合 さ せ 、i n v i t r o 系 と i n v i v o 系 で の 分 子 認ࡀ評 価 か らڥ小 板 代 替 物 と し て の 可 能 性 が 議 論 さ れ て い る 。ڥ液 流 動 下 に て 、 そ れ ぞ れ の 受 容 体 で あ る フ ォ ン ビ ル ブ ラ ン ド 因 子 （v W f）、 コ ラ ー ゲ ン あ る い は 活 性 化ڥ小 板 を 固 定 化 し た 基 板 へ の 粘 着 挙 動 を 、 蛍 光 顕 微؛観 察 と 画 像 処 理 か ら 定 量 的 に 明 ら か に し て い る 。 ま た 、ڥ小 板 数 を 正 常 値 の 2 割 ま で 減 少 さ せ た マ ウ ス を 用 い た 動 物 実 験 か ら 、r G P I a / I I a -ア ル ブ ミ ン 重 合 体 の 投 与 に よ り 出ڥ時 間 が お よ そ 3 倍 短 縮 す る こ と に 成 功 し て い る 。 こ れ は 、 生 体 内 に お い て も 出ڥ ൉位 に༳出 し た コ ラ ー ゲ ン を 認ࡀし 集 積 す る 機 能 が 、 止ڥ機 能 に 繋 が る こ と を 示 し た 初 め て の 成 果 と し てݗく 評 価 で き る 。 こ の 結 果 は 、 認ࡀ蛋 白ࡐ の 結 合 数 、 投 与 量 、 粘 着 挙 動 に 関 し て 詳 細 に 検 討 し た i n v i t r o 系 で の 評 価 結 果 と ほ ぼ 合 致 し て お り 、ڥ小 板 代 替 物 の 機 能 評 価 に お け る 有 力 な i n v i t r o 評 価 法 で あ る こ と を 実 証 し て い る 。

  第 6 章 は 、 ア ミ ノ 酸 をݱ格 と し た 新֩デ ン ド ロ ン 型 両 親 媒 性 脂ࡐの 合 成 と リ ン 脂ࡐ小 胞 体 へ の 認ࡀ ൉位 の 結 合 法 に 関 す る 記 述 で あ る 。 不 安 定 な フ ィ ブ リ ノ ー ゲ ン の 代 わ り に 、g鎖 C 末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 を 有 す る ド デ カ ペ プ チ ド

（H 1 2） を 選 択 し 、 こ れ を グ ル タ ミ ン 酸 ݱ格 の ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル

（P E G） 結 合 型 脂ࡐの P E G 鎖 末 端 に 結 合 し て H 1 2 - P E G 脂ࡐを 新֩に 合 成

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し た 。 小 胞 体 表 面 に お け る H 1 2 の 認ࡀ能 は 、ڥ中 滞 留 時 間 保 持 の た め に 共 修 飾 さ れ て い る P E G 鎖 に よ るਰ害 が 懸 念 さ れ た が 、P E G 鎖 の 分 子 量 と 表 面 修 飾 率 の 制 御 に よ り 回 避 さ れ る こ と が 明 ら か に さ れ て い る 。 活 性 化ڥ小 板 に 対 す る 認ࡀ能 は H 1 2 の 表 面 修 飾 率 の 増 加 に 伴 っ てݗく な り 、 流 動ڥ小 板 が 効 果 的 に 凝 集 塊 に 巻 込 ま れ て い た 。 さ ら にݗ分 子 量 の 認ࡀ ൉位 を 小 胞 体 に 担 持 さ せ る に は 、 親 − 疎 水 バ ラ ン ス を 考 慮 す る と よ り 大 き な 疎 水൉が 必 要 と な る 。 申 請 者 は 、 リ シ ン をݱ格 と し た 二 世 代 デ ン ド ロ ン 型 脂ࡐを 提 案 し 、 チ ト ク ロ ム c（ 分 子 量 1 2 . 5 k D a） の 安 定 担 持 に 成 功 し 、 小 胞 体 に 蛋 白ࡐを 安 定 担 持 さ せ る 独 創 的 な 方 法 を 提 案 で き た 点 は 意 義 あ る 成 果 で あ る 。

  第 7 章 で は 、 担 体 の 物 理 化 学 的 性ࡐの 相 違 が 発 現 機 能 の 相 違 に 繋 が る 実 例 を 、ڥ小 板 代 替 物 と し て の 評 価 か ら ま と め て い る 。流 動 下 に お い て r G P I ba を 担 持 し た 小 胞 体 （r G P I ba-小 胞 体 ） は 、ڥ小 板 と 同 様 に v W f 固 定 化 基 板 上 を 流 動 方 向 に 沿 っ て 転 が る が 、 そ の 転 が り 速 度 が 二 分 子 膜 の 柔ఫ性 と 相 関 し て い る こ と を 見 出 し て い る 。 即 ち 、 不 飽 和 型 リ ン 脂ࡐか ら な る 柔 ら か い 小 胞 体 で は そ の 速 度 は 減 少 し 、 飽 和 型 リ ン 脂ࡐか ら な る 硬 い 小 胞 体 の 場 合 に は 増 大 す る 結 果 を 得 、 接 触 面 積 の 相 違 か ら 考 察 し て い る 。 他 方 、r G P I ba-ア ル ブ ミ ン 重 合 体 で は 基 板 上 を 転 が る こ と な く 粘 着 し て 止 ま る 現 象 が 認 め ら れ 、 四 酸 化 オ ス ミ ウ ム で 細 胞 膜 を 固 定 化 し たڥ小 板 や r G P I ba-ラ テ ッ ク ス ビ ー ズ も 同 様 で あ っ た こ と か ら 、r G P I baが 結 合 し た 重 合 系 に 共 通 の 現 象 で あ る と 推 察 し て い る 。 以 上 の 成 果 は 、 接 着 分 子 を 担 持 し たڥ球 細 胞 の ロ ー リ ン グ や 接 着 の 分 子 機 構 のӕ明 や 、ڥ小 板 代 替 物 あ る い は 薬 物 担 体 の০ ڐ指 針 に 繋 が る 。   第 8 章 で は 、 以 上 の 研 究 成 果 を 総 括 し 、 自 己 集 合 を ナ ノ レ ベ ル で 厳 密 に 制 御 し た マ テ リ ア ル の 将 来 展 望 に つ い てۗ及 し て い る 。 薬 物 運 搬 系 や ナ ノ ・ バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー に 関 す る 新 し い 提 案 に 触 れ て い る 。

  以 上 述 べ て き た よ う に 、 本 論 文 は 種 々 の 両 親 媒 性 分 子 や 機 能 分 子 か ら 構 築 さ れ る 、ݗ度 に 機 能 化 さ れ た ナ ノ 組 織 体 の 特 徴 と そ の 機 能 制 御 に つ い て 明 ら か に し 、ঢ় ڥ球 代 替 物 やڥ小 板 代 替 物 な ど の 生 体 投 与 可 能 な ナ ノ 組 織 体 の 応 用 開 発 に 繋 が る 内 容 が ま と め ら れ て い る 。 こ れ ら の 成 果 は 、 分 子 集 合 を 利 用 し た ナ ノ 組 織 体 の 構 築 に 新 し い 指 針 を 与 え る ば か り で な く 、 広 くݗ分 子 の 化 学 と 工 学 に 寄 与 す る と こ ろ 多 大 で あ る 。 よ っ て 本 論 文 は 博 士 （ 工 学 ） の 学 位 論 文 と し て 価 値 が あ る も の と 認 め る 。

2 0 0 4 年 1 月

審 査 員   （ 主 査 ） 早 稲 田 大 学   助 教 授   工 学 博 士 （ 早 稲 田 大 学 ）   武 岡 真 司       早 稲 田 大 学   教 授     工 学 博 士 （ 早 稲 田 大 学 ）   西 出 宏 之       早 稲 田 大 学   教 授     工 学 博 士 （ 早 稲 田 大 学 ）  ࢁ井 清 孝