早稲田大学大学院理工学研究科

早稲田大学大学院理工学研究科

博 士 論 文 概 要

論   文   題   目

Properties of Nano-Organizations Constructed by Molecular Assembly and the Control of

their Functions

分子集合により構築したナノ組織体の特徴と その機能制御

申  請  者    寺 村   裕 治    Yuji TERAMURA

    応用化学専攻 ݗ分子化学研究

2003 年  11 月 氏  名

専攻・研究指導 (Ӏ程内のみ)

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  両 親 媒 性 分 子 間 、 あ る い は レ セ プ タ ー と リ ガ ン ド 間 の 分 子 集 合 を 厳 密 に 制 御 し て 構 築 さ れ た ナ ノ 組 織 体 で は 、 機 能 分 子 と 複 合 さ せ る こ と に よ り 、 新 し い 分 子 デ バ イ ス と し て の 機 能 が 期 待 さ れ る た め 、ؼ年 活 発 に 研 究 が 行 な わ れ て い る 。 リ ン 脂ࡐと 生 体ݗ分 子 を 用 い た 例 と し て 、ঢ় ڥ球 よ り も サ イ ズ の 小 さ い リ ン 脂ࡐ小 胞 体 に ヘ モ グ ロ ビ ン （H b） を 内 包 さ せ た H b 小 胞 体 は 、 単 な るঢ় ڥ球 の 代 替 物 と し て 機 能 す る だ け で な く 、ڥ管 内 に お け る 梗 塞൉分 や 腫 瘍 組 織 な ど のײ ڥ ൉位 へ の 酸 素 供 給 が 可 能 と な る 。 ま た 、ڥ管 損 傷൉位 やڥ小 板 表 面 の 認ࡀ分 子 に て 小 胞 体 や 微 粒 子 の 表 面 修 飾 を 行 な え ば 、 出ڥ ൉位 へ 特 異 的 に 集 積 し 、ڥ栓 形 成 誘 導 の֬ 点 と な る た め 、ڥ小 板 代 替 物 と し て の 展 開 が 期 待 で き る 。 本 論 文 で は 、 こ の よ う にݗ度 に 機 能 化 さ れ た ナ ノ 組 織 体 の 構 築 に つ い て 普 遍 的 な 基 礎 知 見 を 確 立 す る と 共 に 、 具 体 例 を 提 示 し な が ら 薬 物 運 搬 用 担 体 ま で を 視 野 に 入 れ た 、 生 体 投 与 可 能 な ナ ノ 組 織 体 の 構 築 に 関 し て 述 べ た も の で あ る 。 先 ず 、H b 小 胞 体 の レ ド ッ ク ス 過 程 を 詳 し く 調 べ 、 生 体 内 に お け る 酸 素 運 搬 能 の 持 続 の た め の 制 御 シ ス テ ム を 提 案 し た 。 次 い で 、 認ࡀ分 子 を 結 合 し た 担 体 の 構 築 と そ の 機 能 に つ い て 、 認ࡀ過 程 の 動 的ӕ析 やڥ小 板 を 巻 込 ん だ 集 積 挙 動 の 詳 細ӕ析 か ら 、 担 体 の 物 性 と 発 現 機 能 の 相 関 を 明 ら か に し 、 生 体 内 に て 止ڥ能 を 有 す るڥ小 板 代 替 物 の০ ڐに 繋 げ る 内 容 を ま と め た 。

  本 論 文 は 、 八 章 よ り 構 成 さ れ て い る 。 第 一 章 は 、 両 親 媒 性 分 子 の 分 子 間 相 互 作 用 と 自 己 集 合 現 象 に 関 す る 従 来 知 見 か ら 分 子 集 合 体 の 物 理 化 学 性ࡐや 構 造 に つ い て の 総 論 で あ る 。 薬 物 運 搬 系 や ナ ノ ・ バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー に お け る マ テ リ ア ル と し て の 要 件 や 問 題 点 に つ い て 概 説 し た 。 具 体 例 と し て 、H b 小 胞 体 の 分 子০ ڐと そ の 酸 素 運 搬 能 をӕ説 し 、 人 工ঢ় ڥ球 （ঢ় ڥ球 代 替 物 ） の 研 究 動 向 を ま と め た 。   第 二 章 で は 、H b 小 胞 体 と 活 性 酸 素 種 と の レ ド ッ ク ス 過 程 に 関 す る 詳 細 知 見 を ま と め た 。 生 体 内 に お い て 、 特 に 炎 症 時 に 多 く 発 生 し て い る ス ー パ ー オ キ シ ド ア ニ オ ン 、 ヒ ド ロ キ シ ラ ジ カ ル や 過 酸 化 水 素 （H₂O₂） な ど の 活 性 酸 素 種 と H b や 小 胞 体 中 の H b と の 反 応 を 詳 細ӕ析 し た 。H b は 擬 ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 活 性 を 示 し て H₂O₂を 触 媒 的 に 分ӕし 、そ の 速 度 は カ タ ラ ー ゼ の 1 0⁴倍 程 度 小 さ い 1 . 8 x 1 0³ M^{- 1}s^{- 1} で あ っ た 。 中 間 体 で あ る フ ェ リ ル H b は 不 飽 和 脂ࡐを 過 酸 化 し 、 続 く 変 性 H b か ら 遊 離 し た 鉄 イ オ ン は F e n t o n 反 応 に よ り H₂O₂か ら ヒ ド ロ キ シ ラ ジ カ ル を 生 じ 、 不 飽 和 脂ࡐの 過 酸 化 の 原 因 と な る 。 他 方 小 胞 体 中 の H b で は 、 二 分 子 膜 を 透 過 し た H₂O₂ が 同 様 に H b と 反 応 し て 、 フ ェ リ ル H b や 鉄 イ オ ン の 遊 離 を 引 き֬こ す も の の 、 化 学 的 に 安 定 な 飽 和 型 脂ࡐの 二 分 子 膜 に て 隔 離 さ れ て い る た め 、 外 水 相 に 存 在 す る 卵Ҏレ シ チ ン 小 胞 体 の 過 酸 化 が 抑 制 さ れ る こ と を 実 証 し た 。以 上 よ り 、 生 理 活 性 のݗい H bを 小 胞 体 に 内 包 す るঢ় ڥ球 様 構 造 の 生 理 的 意 義 を 証 明 で き た 。   第 三 章 で は 、H b 小 胞 体 の 酸 素 運 搬 能 の 持 続 法 に つ い て 、 種 々 の ア プ ロ ー チ を 検 討 し 、i n v i t r o 系 と i n v i v o 系 に お け る 実 験 結 果 の 評 価 と そ の 応 用 を 述 べ た 。H b は 鉄 が 二 価 状 態 で 酸 素 と 可 逆 的 結 合 す る が 、 自 動 酸 化 や 活 性 酸 素 種 に よ り 三 価 の

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状 態 に 酸 化 （ メ ト 化 ） さ れ る と 酸 素 運 搬 能 が 失 わ れ る た め 、 メ ト 化 抑 制 系 や 還 元 系 の 構 築 が 必 要 で あ る 。 第 二 章 で 述 べ た よ う に 、ݗい 膜 透 過 性 を 有 す る H₂O₂ は H b 小 胞 体 に お い て 最 大 の メ ト 化 促 進 因 子 で あ る 。 実 際 に H₂O₂ 消 去ݏ素 で あ る カ タ ラ ー ゼ を 内 包 し た H b 小 胞 体 で は 、 カ タ ラ ー ゼ 未 内 包 群 よ り も 大 幅 に メ ト 化 速 度 が 低 下 し 、 動 物 実 験 か ら 酸 素 運 搬 寿 命 が 3 倍 ま で 延ସす る こ と を 実 証 し た 。 こ れ は 膜 透 過 し た H₂O₂が 、H b を メ ト 化 す る 前 に 消 去 さ れ た た め で あ る 。 ま た 、 ア ス コ ル ビ ン 酸 のৌ脈 投 与 に よ りڥ流 中 の H₂O₂ を 還 元 消 去 し て も 、 酸 素 運 搬 寿 命 を 2 倍 ま で 延ସで き る こ と を 明 ら か に し 、H₂O₂ に 対 す る 消 去 系 の 構 築 に よ り H b 小 胞 体 の 酸 素 運 搬 寿 命 が 延ସで き る こ と を 見 出 し た 。 た だ し 、 ア ス コ ル ビ ン 酸 で は 膜 透 過 性 が 極 め て 低 く 、 小 胞 体 内 の メ ト H b の 還 元 ま で は 不 可 能 で あ っ た が 、 膜 透 過 性 がݗい シ ス テ イ ン を 還 元 剤 と し て 利 用 す る こ と で 、 小 胞 体 内 の メ ト H b は 還 元 可 能 で あ っ た 。 さ ら に 、 フ ェ ナ ジ ン メ ト 硫 酸 な ど の 中 間஢子 媒 体 を 利 用 す る こ と で 、 低 酸 素 分 圧 下 （ৌ脈ڥ相 当 ） で の 小 胞 体 内 の メ ト H b 還 元 反 応 の 促 進 に 成 功 し 、 生 体 系 で の 新 し い メ ト H b 還 元 系 を 提 案 し た 。

  第 四 章 で は 、Ћ伝 子 組 換 え ヒ トڥ清 ア ル ブ ミ ン の 多 量 体 合 成 法 と 認ࡀ蛋 白ࡐの 結 合 法 を 新֩に 提 案 し た 。 ジ ス ル フ ィ ド 結 合 し て い な い ア ミ ノ 酸 配 列 3 4 番 目 の シ ス テ イ ン （^{3 4}C y s） を 標 的 と し て 、1 , 6 -ビ ス マ レ イ ミ ド ヘ キ サ ン 架 橋 に よ り ア ル ブ ミ ン の 二 量 化 を 検 討 し た 結 果 、 反 応 条 件 の 厳 密 な 制 御 に よ り 二 量 体 のݗ収 率 合 成 に 成 功 し た 。 ま た p H と 温 度 の 制 御 に よ り 、 ア ル ブ ミ ンݗ次 構 造 の 変 化 が 生 じ て ^{3 4}C y s が༳出 し 、 チ オ ー ル ・ ジ ス ル フ ィ ド 交 換 反 応 が 生֬す る た め に ア ル ブ ミ ン 分 子 間 で の 重 合 が 進 行 す る 。 そ の 粒 径 を 5 0 n m か ら 5mm 程 度 ま で 任 意 に 制 御 で き る 方 法 を 確 立 し た 。 更 に 、 架 橋 剤 N -ス ク シ ン イ ミ ジ ル 3 - ( 2 -ピ リ ジ ル ジ チ オ プ ロ ピ オ ネ ー ト)を 用 い た 最 小 限 の 化 学 修 飾 に よ り 、 機 能 を 保 持 さ せ た ま ま 認 ࡀ蛋 白ࡐを ア ル ブ ミ ン 重 合 体 の 表 面 に 結 合 す る 手 法 を 用 い て 、 任 意 の 分 子 量 の 認 ࡀ蛋 白ࡐを 定 量 的 に ア ル ブ ミ ン 重 合 体 へ 結 合 す る こ と に 成 功 し た 。 結 合 認ࡀ蛋 白 ࡐの 機 能 の 保 持 は 、 免 疫 化 学 的 手 法 を 用 い て 確 認 し た 。

  第 五 章 は 、 第 四 章 で 確 立 し た 手 法 に よ り ڥ 小 板 膜 蛋 白 ࡐ のЋ 伝 子 組 換 体

（r G P I ba、r G P I a / I I a） やڥ液 凝 固 蛋 白 ࡐで あ る フ ィ ブ リ ノ − ゲ ン を ア ル ブ ミ ン 重 合 体 に 結 合 さ せ 、i n v i t r o 系 と i n v i v o 系 に て 機 能 評 価 し た 結 果 の ま と め で あ る 。 ڥ液 流 動 下 に て 、 そ れ ぞ れ の 受 容 体 で あ る フ ォ ン ビ ル ブ ラ ン ド 因 子 （v W f）、 コ ラ ー ゲ ン あ る い は 活 性 化ڥ小 板 を 固 定 化 し た 基 板 へ の 特 異 的 な 粘 着 挙 動 を 、 蛍 光 顕 微؛観 察 と 画 像 処 理 か ら 定 量 的 に 明 ら か に し た 。 ま た 、ڥ小 板 数 を 正 常 値 の 2 割 ま で 減 少 さ せ た マ ウ ス を 用 い た 動 物 実 験 か ら 、r G P I a / I I a -ア ル ブ ミ ン 重 合 体 の 投 与 に よ り 出ڥ時 間 が お よ そ 3 倍 短 縮 す る こ と に 成 功 し た 。 こ れ は 、 生 体 内 に お い て も 出ڥ ൉位 で༳出 し た コ ラ ー ゲ ン を 認ࡀし 集 積 す る 機 能 が 、 止ڥ機 能 に 繋 が る こ と を 示 し た 初 め て の 成 果 で あ る 。 こ の 結 果 は 、 認ࡀ蛋 白ࡐの 結 合 数 、 投 与 量 、 粘 着 挙 動 に 関 し て 詳 細 に 検 討 し た i n v i t r o 系 で の 評 価 結 果 と ほ ぼ 合 致 し て お

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り 、ڥ小 板 代 替 物 の 機 能 評 価 に お け る 有 力 な i n v i t r o 評 価 シ ス テ ム で あ る こ と を 証 明 し た 。

  第 六 章 は 、 ア ミ ノ 酸 をݱ格 と し た 新֩デ ン ド ロ ン 型 の 両 親 媒 性 脂ࡐの 合 成 と リ ン 脂ࡐ小 胞 体 へ の 認ࡀ ൉位 の 結 合 法 に 関 す る 新 し いࠟみ の ま と め で あ る 。 グ ル タ ミ ン 酸 をݱ格 と し た ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル （P E G） 結 合 型 脂ࡐと フ ィ ブ リ ノ ー ゲ ンg鎖 C 末 端 ア ミ ノ 酸 配 列 を 有 す る ド デ カ ペ プ チ ド （H 1 2） を P E G 鎖 末 端 に 結 合 し た H 1 2 - P E G 脂ࡐを 用 い て 表 面 修 飾 し た 小 胞 体 の 調 製 をࠟみ た 。 小 胞 体 表 面 上 に お け る H 1 2 の 認ࡀ能 は 、ڥ中 滞 留 時 間 の 保 持 の た め に 共 修 飾 さ れ て い る P E G 鎖 の 排 除 体 積 に よ るਰ害 が 懸 念 さ れ た が 、 そ れ ぞ れ の P E G 脂ࡐの 分 子 量 と 表 面 修 飾 率 の 制 御 に よ り 回 避 で き た 。 活 性 化ڥ小 板 に 対 す る 認ࡀ能 は H 1 2 の 表 面 修 飾 率 の 増 加 に 伴 っ てݗく な り 、 流 動ڥ小 板 の 認ࡀ能 も 確 認 で き た 。 さ ら に 分 子 量 の 大 き な 認ࡀ ൉位 を 小 胞 体 に 担 持 さ せ る た め に は 、 親 疎 水 バ ラ ン ス を 考 慮 す る と よ り 大 き な 疎 水൉の 構 築 が 必 要 と な る 。 そ こ で リ シ ン をݱ格 と し た 二 世 代 デ ン ド ロ ン 型 脂ࡐを 提 案 し 、 チ ト ク ロ ム c（ 分 子 量 1 2 . 5 k D a） の 安 定 担 持 に 成 功 し た 。   第 七 章 で は 、 担 体 の 物 理 化 学 的 性ࡐと 発 現 機 能 の 相 関 に 関 し て 、ڥ小 板 代 替 物 を 実 例 と し て 展 開 し た 内 容 で あ る 。 流 動 下 に お い て r G P I baを 担 持 し た 小 胞 体

（r G P I ba-小 胞 体 ） は 、ڥ小 板 と 同 様 に v W f 固 定 化 基 板 上 を 流 動 方 向 に 沿 っ て 転 が る 挙 動 を 示 す 。 そ の 転 が り 速 度 は 二 分 子 膜 の 柔ఫ性 に 相 関 し て い る こ と を 明 ら か に し た 。 具 体 的 に は 不 飽 和 型 リ ン 脂ࡐを 構 成 成 分 と し た 柔 ら か い 小 胞 体 で は そ の 転 が り 速 度 は 小 さ く な り 、 飽 和 型 リ ン 脂ࡐか ら な る 硬 い 小 胞 体 の 場 合 に は 転 が り 速 度 は 増 大 し た 。こ れ は 、柔 ら か い 小 胞 体 で は 変 形 し 易 く 固 定 化 v W f と r G P I ba- 小 胞 体 間 の 接 触 面 積 が 増 大 す る た め と 説 明 で き る 。 他 方 、r G P I ba-ア ル ブ ミ ン 重 合 体 で は v W f 基 板 上 を 転 が る こ と な く 粘 着 し て 止 ま る 現 象 が み ら れ た 。 四 酸 化 オ ス ミ ウ ム で 細 胞 膜 を 固 定 化 し たڥ小 板 や r G P I ba-ラ テ ッ ク ス ビ ー ズ で も 同 様 に 止 ま る 現 象 が 認 め ら れ た こ と か ら 、r G P I baが 結 合 し た 重 合 系 に 共 通 の 現 象 で あ る と 考 察 さ れ た 。 従 っ て 、r G P I baを 結 合 し た 担 体 の 機 能 は 、 担 体 の 相 互 作 用 力 、 膜 流 動 性 や 変 形 性 に 相 関 す る こ と を 初 め て 明 ら か に し た 。

  第 八 章 で は 、 自 己 集 合 を ナ ノ レ ベ ル で 厳 密 に 制 御 し た マ テ リ ア ル の 将 来 展 望 で あ る 。 コ ン ピ ュ ー タ ー シ ミ ュ レ ー シ ョ ン を 駆 使 し た 次 世 代 型 ナ ノ 組 織 体 の 可 能 性 に つ い て もۗ及 し 、 薬 物 運 搬 系 や ナ ノ ・ バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー に 関 す る 新 し い 提 案 に つ い て ま と め た も の で あ る 。

  以 上 本 論 文 は 、 種 々 の 両 親 媒 性 分 子 や 機 能 分 子 か ら 構 築 さ れ る 、ݗ度 に 機 能 化 さ れ た ナ ノ 組 織 体 の 特 徴 と そ の 機 能 制 御 に つ い て 明 ら か に し 、ঢ় ڥ球 代 替 物 やڥ 小 板 代 替 物 な ど の 生 体 投 与 可 能 な ナ ノ 組 織 体 の 応 用 開 発 に 繋 が る 内 容 を ま と め た も の で あ る 。