像 及 す影 血液 響 抗 腫瘍性溶連 菌 無細胞 抽 出 物 体温及

28 4 金 沢大 学 十 全 医 学会 雑 誌 第8 9巻 第2号 2 8 4 ^‑28 9 (1 98 0)

抗

腫瘍 性 溶 連

無 細 胞

出

体 温及

血 液

及

す 影

金沢大学 医学 部薬^理学 教 室

木 河 西 川 杉 正

照 其 博 京 越

野 尾 尻 山 印

(昭和^{5 5}年³ 月2 1日受付)

S tr ep t^olysin S 産 生 能を有 する溶 連 菌^に抗 腫 瘍 能 が あ ること が実証^{1 )さ れ たこと か ら,}溶 連 菌^によ る ^一連

の実 験 的 制が ん研 究が岡 本らによって行な わ れ, 多く の知 見が発 表さ れ た^{. つ い で}一 研 究は溶 連 菌^の抗 腫 瘍 能 増 強 化と無 毒 化^の方 向に進みt その結 果 抗 腫 瘍 性^の 強^い. 毒 性^の弱^い抗 腫 瘍 佐 藤 連 菌 製 剤 P C^‑B^‑4 5 ^2馴 (O E^‑431 及び その凍結 乾 燥 標 品O K ^‑432) が開 発^‑さ れ た^.

一方^{, こ}れ ら^の研 究と平 行し^て抗 腫 瘍 性 溶 連 菌^の有 効因 子に関 する研 究 も行な わ れ, 溶 連 菌 体をア ル ミナ ま た は金 剛 砂で ホ モジ ネ ^ー 卜してえ ら れ る無 細 胞 抽 出 液に腫 瘍 細 胞 傷 害 作 用が あ ること が報 告さ れ た が, そ の活性は強くな か^っ た^. 本 実 験^では, 溶 連 菌 体^の破 壊

にBr a u n

7

s c ell ho m oge niz e r を用い て無 細 胞 抽 出 液 を作 製し. これについ て腫 瘍 細 胞 傷 害 作 用を試 験す る と と も に, O K ^‑431 でみ ら れ た血 液像^に対す る影 響 性 や発 熱 性な どにつ い ても試 験を行なっ た.

材 料お よび 方 法

1. 使 用 菌 株^:教 室保 存^の溶 連 菌Su 株(Ty pe3,以 下 単^にSu 菌と略 記) を使 用し た. Su 菌^の培 養^には普 通ブ イ^ヨ ン培 養液 (pH 7^.2 ^〜 7.4) を用^いた^.

2 ^. Su 南 無 細 胞抽 出物 (C F E) ^の調 製^: Su 菌^の20 時 間ブ イ^{ヨ ン}培 養液 600 m ほ3 % 酵 母^エ キス 培 養 液

10エに接 種し,37 ℃^で2 4 時 間培 養後 低 温 下^で連 続 遠

茂 茂 友 男 子 達

心^によって生 菌体を集め, 冷 生理食 塩 水^によ^って2回 洗 推し たのち冷 蒸 留 水^に浮 遊し た. これに更に適量^の 蒸 留 水を加えて菌 浮遊 液^の裔 度が O D 6 6 0n m (日立^一 堀 場^spe ctr o nic s2 0 ) ^で4 0 にな る よ うに調 整した.

つ い で, 薗 浮 遊液^{3 0 最 と ガラ ス}粒 ( 直径0.1^{m m}, ブラ ウン社 製)4 0g を 7 0mエ容量^のガラ ス瓶(ブラ ウン社製)

に い れ, 炭 酸 ガ ス 通 気 下 ^{で Br a u n's c ell}

ho m og^{e n}iz e rで3,0 00rp^m2 分 間2 回 計4 分 間振と う し た^{. つい で ホ モ} ジ ネ^ー ト液を ガ^{ラ ス}ろ 過器 (G l)

に てろ過し たのち ろ液を遠心 し, 上 清 液 ( 無 細胞抽出 液^{,C e}11^‑fr e e e xtr a ct) を直ちに凍 結 乾 燥して無品形茶 色 粉 末^の無 細 胞 抽 出物 (^{C F E}) 1.4g を え た. C F E は低 温 下で保 存し, 実 験には そ^の都 度 燐 酸 緩 衝 生理食塩水

(pH 7.2 ) ^でC F E を所 要^の濃 度に溶 解して用^いた.

3^{. エ ー ル}リッ ヒが ん細 胞 浮 遊 液: ^{エ ー} ルリ^ッヒ腹 水が ん細 胞を移 植し た 1 0 日目^{のマ ウ ス} (d d 系, 雄^. 2 0g ^〜 2 2g)^の腹 腔 内よ り腹 水を採 取し,遠 心^によ りが ん細 胞を集め, 冷 生理食塩 水^で2 回洗 椴し たのち洗源 が ん細 胞を燐 酸 緩 衝 生理食 塩 水^に浮 遊し, さ らに適量 の燐 酸 緩 衝 生理食 塩 水を加えて3 .2 ^×1 0⁸ 細 胞/mエ^の が ん細 胞 浮 遊液を作 製し た.

4^. 腰 痛 細胞 傷 害 作 用実 験: 腫 瘍 細 胞 傷 害 作用 を^い わ ゆ る わl ぴgJr o ‑ ^{′佗 びfぴ 0} 法^によ る が ん細 胞^の移 植 増 殖 阻 害作用^によっ て試験し た. す な わ ち, 各濃度^の C F E 液1 容 量と が ん細 胞 浮遊 液1 容量 を 混 じて37 ℃

Influ e n c e of C ell^‑F_{r e e} E xtr a ct of A ntic a n c e r Str ep t^{o c o c c}ii o n the B lo od P i^ctu r e a nd the T e m p^{e r a}tu r e of R ab bits･ S h i_ge r u K i_go sh i_,T e r u sh i_ge K ohn o

, M ato m o N ishio, H i^･

r o o K a w aj^{iri, K}y^oko Sugiy^{a m a a n}d Sl 退t m u S hoin, Dep^{e r}tm e nt of P ha r m a c olog y,Scho ol

of M edcin e, K a n a z a w a U ⁿiv e r si_{t y}. 9 2 0^.J^ap^{a n .}

抗 腫瘍 性溶 連 薗 無 細 胞抽 出物^{の ウ サ ギ}体 温及 び血 液像 2 8 5

で60分 間イ ^ンキ^{エペ ー} 卜 し た^のちtその混 合 液 0 ^･5 血 を そ れ ぞ れ^に対 応し た 1 群10 匹^{のマ ウ ス}腹 腔 内に接 種し^て6 0 日間^{の マ ウ ス の}状 態を観 察し た■対照と し^て は1容量^の燐 酸 緩 衝 生理食 塩 水^に1 容 量^のが ん細 胞 浮 遊液^を加え た も^のを用^いた･

5^. 溶 血 力試 験^{:C F E の}2 Ⅲg/ 両液1 山 に生理食 塩 水^{1 舶 を}加え^てよ く振と う し た^のち･ これの生理食 塩 水^によ る 1 ^m 流^の倍加 稀 釈 液 列を作 製し, これ ら各 管

に3 % ウ^サギ脱 線 維 血球 浮 遊液1^mエ宛を加えて 37 ℃ に2時 間静 置 後^一 各 管^{につ い て}溶血^の有 無^･ 強溺を判 定し. その遠心上 清 液^{につ い て} O D 5 4 0n m で の吸 光 度 を測定し^て, 溶 血 力を 5 0 % 溶 血 単位 (H U) で示し た^･ (50 %溶 血 単 位^{と は}3 % 脱 線 維 血 球 浮 遊 液^{の 5}0 % を

溶血さ せ る力 価を 1 単位と し た も^{の で}あ る^･) ま た^, C F E ^の溶 血 作 用が str eptolysin S 様^の も^の であ る か否か を確か め る た め, 3 % 血 球 浮 遊 液^に予め t^ry pa n b lu e を 1 2^･5FLg/mL^にな る よ うに添 加し た も

のを用^{い て}前 述^の如く溶 血 力試 験を行な^った^･ 6. ウ サギ血 液 像 及び体温^に及ぼす 影 響^{に つ い て}

の実験: 50 mg/mエの C F E2 血 を所 定^の時 刻^{に ウ サ}ギ^の 耳静脈 内^に1 日 1 臥 6 日間 連日投与し･連日 ^一定^の時 刻^に耳 静 脈よ り採 血して, 赤 血 球数⁸及び白血 球 数^g壕 算定し. 血 色 素量を小 官^‑S ab li 法^{1 01に}よ り定 量し た^･ ま た体温 測 定はウ サギ を固定し, 直 腸 体 温 計^によ^{っ て} 測定し た.

7. 呈 色 反 応^{:C F E の 0.1 %} 液^につ い て の呈色 反 応 をタ^{ン パ}ク定 性 試 験と して^ニ ン ヒ ドリ^ン反 応 及びビュ

ウ レット反応^{1 1 )}を, 糖^の定 性 試 験^{と して モ ー リッ シ ュ}

反応^{1 2 )}を, R N A 定 性 試 験と してオル シ ノ ^ー ル反 応を･

D N A 定 性 試 験と してジフユ ニ ^ー ルア ミ ン反 応^1町を行 な^った^.

成 績

1. が ん細 胞 移 植 増 殖 阻 害 実 験^: 腫瘍 細 胞 傷 害作 用 をf^{乃 び}か0 ^一 拍 乙両用 法の移 植 増 殖 阻 害 実 験^によ り 試験し た成 績を表r_{l に示し た}. C F E 液と がん細 胞 浮 遊 彼^の混合 液 中^のC F E 作用濃度が, 3mg/mL^, 2mg/ mL 及び1mg/ 山では^, が ん細 胞^の移 軋 増 殖は阻 害さ れ,

これ ら処理 が^ん細 胞を移 植し た各群^{のマ ウス} は各 群と もに60 日目にお^{い て}も 1 0 0 % 生 存し, 6 0 日目^に お け る屠殺 解 剖 肉眼的所 見^でも腫 瘍^の存在は み ら れ な か^っ た｡ これに対し, 作用^濃度0.5^mg/ mエ及び 0^･2 mg/ mエ

のC F E で処理 さ れ た が ん細胞^の移 植 増 殖は阻 害さ れ ず, 対照群^{のマ ウ ス}と同じ く^こと ご と く 4 週 間 以 内^に 腫瘍死し た^,

2. 溶血 力試 験^: 溶 血 力 試 験^の成 績は表2 ^に示し

Tab l^el^. In viir o^･in yiv o a ntic a n c e r e xp^{e rl m e n}tS wi^th C F E

Co rt^{c e ntr atio n of C F E}

1 n a l nixtu r e

(m g/ ml)

No.ofs u r扇v o r s^趨

3 1 0/1 0

2 1 0/1 0

ロ ^{1 0/1 0}

0^.5 0/1 0

0^.2 0ノ1 0

Co Ⅲtr Ol

(Su spe n sio n ofc a n c e r c ells alo n e)

0/1 0

疇Nu mbe r of mic e aliv e o n6 0th day aft_{e r}intr ap^{e r‑} ito n e al irj^{e ct}io n ofthe pr ein c ubated mixtu r e of

c a n c e rc ells s u spe n sio n a nd C F E Solutio n･

Tab le2^. Te stfo rhe moly tic a ctivit y ^of C F E

● A bs e n c e(R)^{o r} pr e s e n c e(R 十T)oftry pa nblu e in

e ry thr o cy t^{e s u s}pe n sio n･

一^{汁 HCo m pletehe m olysis; +廿J 十+ pa rtial he m o‑}

1ysis; ^‑ n Ohe m ol_ysis･

= On ehe m ol_{y t}ic u nit(1 H U)isthe a m o u ntof he m o^･

1y tic s ubsta n c e c a u sing5 0% ^{he molysis oi 3}%r ab^･ bite ry thr o cy te s u sp^{e n s}io n un de rthe stated c o n^･

di^tio n s^.

Table 3. Colo r r e a ctio n of C F E

Te st Colo r r e a ctio n

in O^.1% ^{s o}lutio n

N irhydrin r e a ctio n ー^什十

B iu r etr e a ctio n 十l +

M olis ch ^{r e a ct}io n 1 十

Or cin olr e a ctio n 十

Diphe nyla min e r e a ctio n +

2 8 6 木 越^･ 河野 ^･西 尾りIl尻 ^･ 杉 山^･ 正印

た･ C F E の50 % 溶血 単 位^{は 2}0 .8日U / mg であ^っ た が,

3 % 血 球 浮 遊液^に予めt_{r u}p aⁿ b lu e を加えてお く と C F E によ る溶血は, Str ep tOl_ysin S と同 様^に完 全^に 阻 止さ れ, 1 喝/ 山の濃 度^でも溶 血は 認 め ら れ な か ^っ た.

3. ウ サギ血 液 像に及ぼ す影 響^につ い て: C F E l OO 咽を 1 日 1 臥 6 日間連_日耳 静 脈 内 注射によ る血 液 像

の変 化を図1 ^に示し た.

白 血 球 数は 2 日目に2 5 %増 加し た が 4 日目よ り減 少し 6 日目^の最 終 投 与では約1 5 %減 少し た.し か し最 終 投 与よ り 4 日目以降^では増 加し^,1 4 日目^には投 与 前

の状 態に復し た^.

赤 血球 数は C F E 投 与^によ り減 少し^,最 終 投 与日^では 約1 7 % 減 少し た^. し か し,最 終 投 与よ り 2 日目以降^で

は増 加し, 14 日目^には投 与 前^の状 態^に復し た^. 血 色 素 量は赤 血 球 数と同 様^にC F E 投 与^によ り減 少 し,6 日目^では約 30 % 減少^{し た が}, 最 終 投 与よ り 2 日 目以降^では増 加して14 日目^には投 与 前^の状 態^に 復し た^.

4. ウ サギ体 温^に及ぼす影 響: C F ElOO mg の1 日 1 回 6 日間 連日投 与^によ る体 温^の往 時 的 変 化^を図2 に示

し た^.

C F E の1 回 目^の投 与^では体 温は漸 次 増 加し,9 時 間

で最 高^の1 .2 ℃上 昇し た が 1 0 時間 目か ら減 少し, 1 4 後 問 目^{で の}体 温上 昇は わずかであ^った^. 2 回 目^の投 与 以 降^で は体 温 上 昇は認め ら れ な^いか ま た は少な く, 最 高 上 昇^では0.4 ℃であ^っ た^.

5 ^･ 呈 色反 応‥0 ^.1 % C F E 液^{につ い て の}里色反 応^の

￠ h ロ } 巾 H

昏

8

一

首 月

頃

○

乱仁 巾 エ U

Oc

1s t day

＼

/

′ ＼

?H ｡ ｡ r 5 1 0

†^{エ nje c ti｡ n Of α E}

0 5

E o u 工

†

成 績は表 3 ^に示し た･ C F E はタン パ ク反 応 強陽 性 牒 反 応は陽 性 及び R N A 反 応と D N A 反 応 は弱 陽 性であ

っ た.

考 察

抗 腫 瘍 性 溶 連 歯^{か らアル ミ ナ}ま たは金剛 砂 処_理によ

っ て作 製さ れ た無 細胞 抽 出 液ま た は同 破か ら_{ア セ トン} によ ^っ て沈 毅し た E A P⁸⁾ に比 べ てI Br a u n⁷s c e11

爪 U

【 U

O

一^U

O q 一

8

■⁷

【^b

⊂ ノ

√

巨

＼ N

昌

山 中 p h b O U ヨ O T u O

】 中

召_R

【 6

"胃^芦

○

〈^U

O

( U ( ワ

0

0

〇

一 さ

■ q

､ J

2

√

鍔

＼

㌔_T

〉 の u 刃 ト リ O h 貞 一 一 日 り 山 O 日 中

琶

亡 の

声

0

0

0

0

0 8

7

8

5

4

;

.

コ

ぷ 可

巴

ぷ 一 月 0

【

賢 華 道

2nd day

･^b

T 5

↑

4

T 3 T

■^▲l

T I T

7 8 10

1 2 3 4 5 6 7 8

† T † ^↑ ↑ †

1 0 1 4 叫

F i_g.1. Influ e n c e of C F E o n the b lo od pictu r e of r ab b its

3rd day

1 0

5 】.0

ミく J 二て

ニコ

0 5 10

†

卜′㍉^､_̲

‑̲

̲̲

0 5 1 0

丁

F ig^.2. Influ e n c e of C F E o n the body te m pe r atu r e of r ab b it