博 士 （ 医 学 ） 大 村 悦 敬
学 位 論 文 題 名
ナ チ ュ ラ ル キ ラ ー T(NKT) 細 胞 は 高 脂 血 症 発 症 アポE 欠損マウスにおける動脈硬化の粥腫破綻に寄与する
学位論文内容の要旨
【背景と目的】近年高齢化と食 生活の欧米化に伴い，わが国においても心筋梗塞などの動 脈硬化性疾患が増加している． 動脈硬化の発症・進展においては，血管壁局所における脂 質代謝異常を基盤とした慢性炎 症が重要で，先行研究によって自然免疫を担うマクロファ ージ （M￠ ）や ，獲得免疫の柱となるT細胞の関与が明らかにされて いる．ナチュラルキ ラ ーT (NKT)細 胞 は ， ナ チ ュ ラ ル キ ラ ー(NK)細胞 とT細胞 双方 の表 面抗 原 を発 現し ， 自然免疫と獲得免疫を調節するT細胞亜群である．糖脂質を 特異的に認識して炎症性サイ トカインを産生することより， 動脈硬化病巣の発症・進展に諮いて重要な役割を果たして いると考えられ，動脈硬化モデ ルマウスを用いた検討において，NKT細胞は動脈硬化病巣 に存 在 し，NKT細胞の活性化によりTH1サイトカインを誘導し，動脈 硬化病巣の発症・進 展に関与していることが報告さ れている．急性心筋梗塞は冠動脈内の動脈硬化病巣での粥 腫が破綻し血栓性閉塞をきたす ことで発症するが，機序としては粥腫を覆う線維性被膜が 分解されて破綻をきたすと考えられて韜り，病変局所での慢性炎症が重要な役割を果たす．
我々の高齢アポE欠損マウスを用いた検討では，大動脈弁輪 部における複雑病変の面積は NKT細 胞を 刺激 活性 化さ せて も不 変 であ ったが，病巣内で線維性成 分が減少しており，
NKT細胞活性化によって動脈硬化病巣に質的な変化がもたらされることが示唆されている．
さらに我々は，粥腫破綻が関与 する不安定狭心症患者において，末梢血中のNKT細胞が活 性化された結果，総数が減少し ていることを報告している．これらのことより，NKT細胞 は動脈硬化粥腫破綻に関与して いる可能性が考えられるが，これまでNKT細胞と粥腫破綻 の関係を直接検討した研究はな い，本研究では，ヒト粥腫破綻に類似した病理所見が観察 され る 高脂 肪食 投与アポE欠損マウスを 用いてNKT細胞を刺激活性化 し，腕頭動脈レベル における動脈硬化病巣を病理組織学的に評価し，遺伝子発現の変化を生化学的に解析して，
NKT細 胞 が 動 脈 硬 化 粥 腫 破 綻 に お い て 果 た し て い る 役 割 を 検 討 し た ．
【材 料 と方 法】 高脂 血症 発症 雄性 アポE欠損マウスを用い，8週齢より高脂肪食で8週間 飼育した．高脂肪食開始と同時 にNKT細胞特異的刺激物質であるa‐ガラクトシルセラミド (aGC)ま た は コ ン ト ロ ー ル と し て り ン 酸 緩 衝 食 塩 水(PBS)を 週2回 ，計16回腹 腔内 投 与した． 16週齢の時点で糖負荷試験を行い，採血後屠殺し，腕頭動脈，大動脈組織を採取 した．腕頭動脈はホルマリン固 定後に切片を作製し，エラスチカ・ワンギーソン染色を行 い，最も病変形成が強い切片に おける粥腫の面積，埋没した線維被膜の数，弾性板の断裂 数，線維被膜の厚さを測定した ．左総頚動脈，左鎖骨下動脈分岐部を含む遠位大動脈弓組 織からRNAを抽出し，定量的RTPCRを行った．
【結 果 】両 群と もに 体重 ，血 清総 コレ ステ ロール値，HDL，中性脂 肪，遊離脂肪酸に有 意差は認めなかった．糖負荷試 験では空腹時血糖値に有意差は認めなかったが，グルコー
―345−
ス投 与後30分 ，60分 血糖 値がaGC投与 群でPBS投 与群 より 有意 に高 値で あった，内臓脂 肪を 用い た遺 伝 子発現解析の結果，aGC投与 群でのVa14/Ja18 (NKT細胞マーカー），MHC class II (M￠ マーカー），RANTES（T細胞 ケモカイン）の発現はPBS投 与群にくらべて 有意に亢進しており，NKT細胞の活性化によって内臓脂肪で炎症 が惹起されることが示さ れた．腕頭動脈を用いた病理組織学的検討では，両群とも同程度の粥腫形成が見られたが，
a,GC投与群で粥腫内に埋没した線維 性被膜や断裂した弾性板の数が増加し，線維性被膜の 厚さ が減 少し て おり ，NKT細 胞の 活性 化に よって粥腫が脆弱化すること が示唆された．
大動 脈組 織を 用 いた遺伝子発現解析では，Va14/Ja18，MHC class II，RANTES，IFN‑y MMP‑2の 発 現 はaGC投 与 群 でPBS投 与 群 にく らべ て有 意 に増 加し てお り，NKT細胞 特 異 的刺 激物 質aGCの投 与に よっ て血 管組 織へ のNKT細胞 ，T細 胞の 集簇 ，M￠の活性化なら びに ，TH1サイ トカ イン であ るIFN‑yや 細胞 外マトリックス分解酵素MMP‑2が病理組織で 確認された粥腫の脆弱化に寄与して いることが示唆された．
【考察】 アポE欠損マウスを高脂肪食で飼育した動脈硬化粥腫 破綻マウスモデルにおい て，aGCを 腹腔 内反復投与してNKT細胞を活性化すると，腕頭動脈におけ る動脈硬化粥腫 の脆弱性が増すことが明らかになっ た．血管組織の遺伝子発現解析では，aGC投与によっ てNKT細 胞 やT細 胞 の 集 簇 お よ ぴMめ の 活性 化が 確認 さ れ，NKT細胞 も粥 腫破 綻に お い て重要な役割を果たしていることが 示された．NKT細胞は炎症早 期に活性化し，自然免疫 と獲 得免 疫の 双 方を 調節 する 働き を有 する ことから，NKT細胞の活性化 によってM￠やT 細胞が刺激され，血管局所での慢性 炎症が惹起されたと考えられた，NKT細胞の活性化に よっ て血 管局 所 でIFN‑yやMMP‑2の 発現 亢進 が認 めら れた が，IFN‑yはTH1タイプの免疫 応答を誘導し，粥腫での脂質の蓄積 や血管壁細胞のアポトーシスを誘導し，MMPも粥腫の 脆弱性に重要なことが知られており ，NKT細胞活性化による動脈 硬化粥腫破綻の有カな分 子機序と考えられた．また，NKT細胞刺激活性化によって，耐糖 能障害の悪化も認めてお り，耐糖能障害が粥腫破綻に関与し た可能性も考えられる．実際，耐糖能障害が遷延する と生体内では糖化最終産物(AGE: Advanced Glycation Endproducts)が増加するが，AGEは 酸化LDLの増加を介して血管内皮細胞や平滑筋細胞に酸化ストレ スや炎症を惹起すること が報告されている．今回の研究結果よりNKT細胞は動脈硬化の発症・進展に寄与しており，
NKT細 胞活 性化 を抑制する介入が有効である 可能性がある．一方，NKT細 胞は自己免疫性 疾患や腫瘍などの病態では生体防御 的な役割を果たしていることが示されており，本研究 の成果を臨床に応用するためにはNKT細胞の病態における関与に ついてさらに詳細な解析 を行ぬぃ，有効かつ安全な介入方法 を開発する必要がある，
【結 論】 アポE欠損 マウ スを 高脂 肪食 で飼 育した動脈硬化粥腫破綻マウ スモデルにおい て ，aGCを 腹腔 内反 復投 与 してNKT細胞 を活 性化 する こ とに より ，血 管組 織へ のNKT細 胞，T細胞 の集 簇およぴM￠の活性化，TH1サ イトカインIFN‑1や細胞外マ トリックス分解 酵素MMP‑2の亢進が認められ，さらに腕頭動脈に韜ける動脈硬化粥腫の脆弱性が増加した．
これまでの研究結果と合わせると，NKT細胞は動脈硬化病巣の発 症・進展のみならず，動 脈硬化粥腫の破綻にも寄与している ことが確認され，免疫調節細胞であるNKT細胞が動脈 硬 化 性 疾 患 の 新 た な 予 防 ・ 治 療 の 標 的 と し て 有 望 で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ．
−346 ‑
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
ナ チ ュ ラ ル キ ラ ー T(NKT) 細 胞 は 高 脂 血 症 発 症 アポE 欠損マウスにおける動脈硬化の粥腫破綻に寄与する
近年高 齢化と食 生活の欧米化に伴い、わが国においても心筋梗塞などの動脈硬化性疾患 が増加 している 。動脈硬化の発症・進展においては、血管壁局所における脂質代謝異常を 基盤とした慢性炎症が重要で、先行研究によって自然免疫を担うマクロファージ（M￠）や、
獲得 免 疫 の 柱と な るT細 胞 の 関与 が 明らか にされ ている。 ナチュ ラルキラ ーT (NKT)細 胞は 、 ナ チュラ ルキラー(NK)細胞とT細胞 双方の 表面抗原 を発現 し、自然 免疫と獲 得免 疫を調 節するT細胞亜 群であ る。糖脂 質を特 異的に認識して炎症性サイトカインを産生す ること より、動 脈硬化病巣の発症・進展において重要な役割を果たしていると考えられ、
動脈 硬 化 モ デル マ ウ スを 用 い た検 討 において 、NKT細胞は動 脈硬化 病巣に存 在し、NKT 細胞の 活性化に よりTHIサイト カインを 誘導し、動脈硬化病巣の発症・進展に関与してい ること が報告さ れている。急性心筋梗塞は冠動脈内の動脈硬化病巣での粥腫が破綻し血栓 性閉塞 をきたす ことで発症するが、機序としては粥腫を覆う線維性被膜が分解されて破綻 をきた すと考え られており、病変局所での慢性炎症が重要な役割を果たす。我々の高齢ア ポE欠損マウ スを用い た検討 では、大 動脈弁 輪部にお ける複 雑病変の 面積はNKT細胞を刺 激活性 化させて も不変 であった が、病巣 内で線維性成分が減少して韜り、NKT細胞活性化 によって動脈硬化病巣に質的な変化がもたらされることが示唆されている。さらに我カは、
粥腫破綻が関与する不安定狭心症患者において、末梢血中のNKT細胞が活性化された結果、
総数が 減少して いるこ とを報告 している 。これらのことより、NKT細胞は動脈硬化粥腫破 綻に関 与してい る可能 性が考え られるが 、これまでNKT細胞と粥腫破綻の関係を直接検討 した研 究はない 。本研究では、ヒト粥腫破綻に類似した病理所見が観察される高脂肪食投 与アポE欠損 マウスを 用いてNKT細胞 を刺激 活性化し 、腕頭 動脈レベ ルにおける動脈硬化 病巣を 病理組織 学的に 評価し、 遺伝子発 現の変化を生化学的に解析して、NKT細胞が動脈 硬化粥腫破綻において果たしている役割を検討した。
アポE欠損マ ウスを 高脂肪食 で飼育し た動脈 硬化粥腫 破綻マ ウスモデルにおいて、NKT 細胞の 特異的リ ガンドであるa‐ガラクトシルセラミドを腹腔内反復投与してNKT細胞を活
‑ 347−
之
郎 夫
裕 喜
隆
井 居
池
筒 松
小
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
性 化 する こ と によ り 、血管 組織へ のNKT細 胞、T細胞の 集簇およ びM￠の活性 化、TH1サ イト カインIFN‑yや細 胞外マト リック ス分解酵 素MMP‑2の亢進が認められ、さらに腕頭動 脈に おける動 脈硬化 粥腫の脆 弱性が増加した。これまでの研究結果と合わせると、NKT細 胞は動脈硬化病巣の発症・進展のみならず、動脈硬化粥腫の破綻にも寄与していることが 確認 され、免 疫調節 細胞であ るNKT細胞が動脈硬化性疾患の新たな予防・治療の標的とし て有望である可能性が示唆された。
公開発表に際し、まず松居教授より動脈硬化の初期病変、大動脈瘤、移植心での動脈硬 化 病 変で のNKT細 胞 の役割 につい て質問が あった 。ついで 小池教 授よりNKT細胞の 刺激 方法による免疫反応の変化について、本研究におけるTH 17の検討の有無、ヒトの動脈硬化 とNKT細胞の 関連に 関する報 告の有無について、また、動脈硬化研究におけるマウスの組 織像とヒト動脈硬化病変の類似性についての質問があった。最後に主査より動脈硬化での NKT細 胞 の 活性 化 に 際し、 どのよ うなりガ ンドが 候補とし て考え られるか 、また、NKT 細胞とマクロファージの直接的な関係についての質問があった。いずれの質問に対しても、
申請者は研究結果および文献的知識により適切な回答を行った。
この 論文は 、高脂血 症発症ア ポE欠損マウ スを用 いてNKT細胞が動脈硬化粥種の炎症を 増強 し、マク ロファ ージやT細胞を活性化させて動脈硬化粥種の破綻に関与するとの初め て明らかにした点で高く評価され、今後の動脈硬化粥種の破綻の機序解明やその予防治療 に期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども 併 せ 申請 者 が 博士 （ 医学） の学位 を受ける のに充 分な資格 を有す るものと 判定した 。
ー348―
